瀉火化瘀通竅法對感音神經(jīng)性耳聾大鼠治療效果的實驗研究*

徐 錦 楊 悅 池萬磊 熊高云

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

感音神經(jīng)性耳聾(SND)在全國持證殘疾人中占絕大部分[1]。手術(shù)可恢復(fù)大部分傳導(dǎo)性耳聾患者的聽力，而SND病因復(fù)雜，手術(shù)雖具一定療效，但因經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重而受限制，故如何有效治療SND已成為諸多耳科學(xué)界學(xué)者研究的熱點。耳蝸缺血再灌注損傷(CIRI)引起的耳血流微循環(huán)障礙是SND主要致病因素[2]。中醫(yī)從整體調(diào)節(jié)入手，減少西藥及手術(shù)引發(fā)的不良反應(yīng)，可有效預(yù)防并發(fā)癥，改善臨床癥狀。瀉火化瘀通竅法是將活血化瘀、清肝瀉火有機(jī)結(jié)合，其對CIRI的防治作用仍未闡明。因此本文通過探究瀉火化瘀通竅法對感音神經(jīng)性耳聾的潛在作用機(jī)制及調(diào)控作用，為其提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：60只體質(zhì)量為200±20g的健康SD大鼠(SPF級)，從上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0006；飼養(yǎng)許可證號：SYXK(浙)2018-0012。自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1w。

1.2 主要實驗材料與儀器：瀉火化瘀通竅法組方(柴胡、梔子、川芎、紅花、香附、甘草、枳殼各15g，石菖蒲、鉤藤、夜交藤各25g，丹參、葛根各30g)，濃縮煎煮液至1.0g生藥/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿^氧化氫酶(CAT)試劑盒(貨號：20190413購于南京建成)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(貨號：MM-0047R2、MM-0190R2、MM-0180R2)購于江蘇酶免。腦干聽覺誘發(fā)電位儀(丹麥MADSEN，型號：Octavus)；加熱石蠟包埋系統(tǒng)(Leica，型號：G1150H)。

1.3 實驗分組與CIRI模型制備：1w喂養(yǎng)完畢后，將SD大鼠隨機(jī)分為模型組,瀉火化瘀通竅低、中、高劑量組、地塞米松組,對照組，各10只，利用血管阻斷法制備CIRI模型[3]。常規(guī)麻醉，固定，消毒備皮，于大鼠頸前正中作一切口，鎖骨下動脈、分支椎動脈被暴露。用無菌小動脈夾夾住頸總動脈以形成局部缺血1h后釋放，恢復(fù)供血，形成再灌注。對照組僅作切口，暴露相關(guān)動脈后縫合切口。模型組,瀉火化瘀通竅低、中、高劑量組,地塞米松組模型制備后分別給予等劑量生理鹽水,12.5、25.0、37.5g/kg·d-1瀉火化瘀通竅方,20.0mg/kg·d-1地塞米松灌胃，對照組給予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)7d。

1.4 ABR閾值測試：給藥結(jié)束后，在暗室中測量ABR閾值。除對照組測量實驗開始前、處死前的ABR閾值外，其余組均選取造模后24h且未給藥前、造模7d的兩個時間點進(jìn)行測量ABR閾值。

1.5 HE染色：耳蝸組織樣本于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，行HE染色。

1.6 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平：參照相關(guān)ELISA試劑盒說明，檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平表達(dá)。

1.7 耳蝸組織中MDA含量及CAT活性水平的檢測：參照相關(guān)試劑盒說明，檢測各組大鼠耳蝸組織中MDA含量、CAT活性水平。

1.8 qRT-PCR檢測耳蝸組織中HMGB1、RAGE的mRNA表達(dá)：取耳蝸組織樣本100mg，總RNA通過試劑盒操作說明提取，RNA純度、濃度和完整性通過紫外分析檢測得出。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，特異性擴(kuò)增HMGB1、RAGE，以βactin為內(nèi)參。HMGB1、RAGE的mRNA表達(dá)水平通過2-△△Ct方法計算得出。各引物序列見表1。

表1 HMGB1、RAGE、β-actin引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 16.0軟件，組間采用SNK分析，多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析。方差不齊者采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis H檢驗。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瀉火化瘀通竅法對ABR反應(yīng)閾值的影響：與對照組相比，模型組ABR反應(yīng)閾值明顯增加(P＜0.01)；與模型組相比，各給藥組ABR反應(yīng)閾值均明顯降低(P＜0.05、P＜0.01)，其中瀉火化瘀通竅方作用效果呈劑量依賴性。具體見表2。

表2 各組大鼠ABR反應(yīng)閾值(±s，n=10)

表2 各組大鼠ABR反應(yīng)閾值(±s，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別ABR波反應(yīng)閾值(dB SPL)地塞米松組30.67±3.73**對照組20.36±1.65**模型組65.24±6.05低劑量組53.89±7.66*中劑量組46.69±6.11**高劑量組42.94±6.50**

2.2 各組耳蝸毛細(xì)胞病理改變情況：對照組血管紋清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組耳蝸血管紋模糊，毛細(xì)胞缺損嚴(yán)重。相比模型組，低劑量組干預(yù)的大鼠耳蝸毛細(xì)胞無明顯變化，而中劑量組耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本清晰，高劑量組與地塞米松組大鼠耳蝸毛細(xì)胞沒有明顯損傷，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)清晰。見圖1。

圖1 HE染色下各組大鼠耳蝸毛細(xì)胞病理改變情況

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的變化：與對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，除低劑量組外，其他組都不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)，見表3。

表3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化情況(±s，n=10)

表3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化情況(±s，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)地塞米松組52.02±13.16**82.82±11.92**87.88±9.59**對照組40.04±13.08**59.28±19.70**69.08±21.22**模型組96.62±18.45 176.36±17.82 146.76±21.22低劑量組91.27±14.96 165.65±31.21 124.18±14.85中劑量組75.59±6.57*108.33±16.18**112.70±18.59*高劑量組65.43±12.22**109.20±24.68**106.99±15.07**

2.4 各組耳蝸組織中MDA含量及CAT活性的變化：和對照組相比，模型組耳蝸組織中MDA含量明顯增加(P＜0.01)，CAT活性顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，高劑量組與地塞米松組可明顯降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)，各給藥組均可增加 CAT活性(P＜0.05，P＜0.01)。具體見表4。

表4 耳蝸組織中MDA含量及CAT活性的變化情況(±s，n=10)

表4 耳蝸組織中MDA含量及CAT活性的變化情況(±s，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別MDAmmol/L CAT U/ml地塞米松組6.41±0.85**3.44±0.23**對照組4.62±1.13**24.41±2.87**模型組8.90±1.17 7.10±0.79低劑量組8.14±1.41 10.12±2.42*中劑量組7.34±2.17 17.17±2.93**高劑量組7.17±1.06*18.93±3.95**

2.5 qRT-PCR檢測耳蝸組織中HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)情況：模型組HMGB1和RAGE mRNA在耳蝸組織的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)；與模型組相比，除低劑量組，HMGB1和RAGE mRNA在耳蝸組織的表達(dá)沒有明顯改變(P＞0.05)。其他給藥組均可明顯降低HMGB1和RAGE mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05，P＜0.01)。具體見表5。

表5 耳蝸組織中HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)情況(±s，n=10)

表5 耳蝸組織中HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)情況(±s，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別HMGB1 RAGE地塞米松組1.350±0.151**1.234±0.148**對照組1.009±0.165**1.004±0.107**模型組2.387±0.154 1.901±0.026低劑量組2.259±0.157 1.848±0.256中劑量組1.940±0.148*1.611±0.078**高劑量組1.668±0.158**1.577±0.133*

3 討論

SND可歸屬于中醫(yī)學(xué)“暴聾”范疇，“火”“瘀”為SND的主要病因，因肝膽與耳密切相關(guān)，故治療多選用活血通絡(luò)化瘀、瀉火清肝養(yǎng)心之法。瀉火化瘀通竅方中柴胡、鉤藤、梔子、石菖蒲疏肝利膽、清熱瀉火、活血開竅，是為君；丹參、紅花、葛根、川芎通絡(luò)祛瘀、行氣開郁、活血止痛，是為臣；佐以枳殼、夜交藤、香附，通絡(luò)安神、解郁疏肝；配以甘草調(diào)和諸藥。眾藥并行，可清肝瀉火、活血化瘀，標(biāo)本兼治[3]。

ABR可反應(yīng)聽覺系統(tǒng)傳導(dǎo)通路功能是否存有障礙。本研究通過血管阻斷法制備CIRI模型大鼠，對其ABR閾值進(jìn)行檢測，得出瀉火化瘀通竅法可改善聽神經(jīng)功能，可能是與改善內(nèi)耳微循環(huán)、局部血流量及保護(hù)神經(jīng)纖維有關(guān)。HE染色結(jié)果顯示給予瀉火化瘀通竅方，可有效改善耳蝸毛細(xì)胞損傷，且可恢復(fù)正常的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實瀉火化瘀通竅法可有效改善CIRI，改善聽力障礙，可能與方劑中活性成分葛根素下調(diào)iNOS表達(dá)，改善聽力功能等有關(guān)[4]。

HMGB1是一類非組蛋白的促炎因子，抑制HMGB1表達(dá)，可介導(dǎo)募集、遷移嗜中性粒細(xì)胞，改善腎臟缺血再灌注損傷。此外，跨膜蛋白RAGE受體可與HMGB1結(jié)合參與炎癥反應(yīng)，激活NF-κB，TNF-α、IL-1β、IL-6被釋放出。通過qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)經(jīng)瀉火化瘀通竅方干預(yù)處理，HMGB1、RAGE mRNA均顯著下調(diào)，提示瀉火化瘀通竅法可通過抑制HMGB1/RAGE信號通路發(fā)揮改善CIRI的作用。

MDA可干擾酶活性、核酸等的代謝，MDA含量的高低與細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)。體內(nèi)自由基不能全部清理除盡，CAT活性降低，會使耳蝸組織損傷進(jìn)一步加重[5]。此研究中，一定劑量的瀉火化瘀通竅方治療能使CAT的活性水平增加，并使MDA含量降低。這進(jìn)一步表明，通過阻遏HMGB1/RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，瀉火化瘀通竅方可以介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)并改善耳蝸微循環(huán)障礙。

綜上所述，瀉火化瘀通竅法對CIRI大鼠具有保護(hù)作用，主要通過下調(diào)HMGB1、RAGE表達(dá)，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制來實現(xiàn)。