何氏養(yǎng)巢方對(duì)DOR小鼠超排卵和卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響*

楊柳青 方曉紅 王如燁 陳 赟 沈 丹 杜婷婷 章 勤#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

何氏養(yǎng)巢方在何氏祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方——育麟方的基礎(chǔ)上優(yōu)化而成，多年臨床應(yīng)用顯示其能顯著改善卵巢儲(chǔ)備功能減退（DOR）患者的卵巢功能。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察何氏養(yǎng)巢方對(duì)DOR小鼠超排卵及卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響，為中醫(yī)藥在輔助生殖領(lǐng)域的運(yùn)用奠定基礎(chǔ)，為DOR不孕癥提供更完善的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌鼠24只、雄鼠2只，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 主要藥品：每劑何氏養(yǎng)巢方由天冬、當(dāng)歸、柏子仁、菟絲子、肉蓯蓉、覆盆子、白芍各10g，葛根20g組成，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院制備成含生藥3.6g/g的浸膏。脫氫表雄酮（DHEA）（商品名：NUGORON，產(chǎn)地：中國香港，批號(hào)：DN165152）。

1.3 主要試劑與儀器：環(huán)磷酰胺（CTX）、M16培養(yǎng)液、KSOM培養(yǎng)液購自Sigma公司，瑞氏-姬姆薩染色液購自上海源葉生物科技有限公司，小鼠抗人八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）單克隆抗體購自Abcam公司，孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波第二激素廠，Nikon牌熒光顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱（上海天能科技有限公司），Olympus牌體式顯微鏡，恒溫烤箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.4 分組與造模：將雌鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組（Control），DOR組，DHEA組，何氏養(yǎng)巢方低、中、高劑量組（Low-HSYC、Mod-HSYC、High-HSYC），每組4只。除對(duì)照組外，其余組予90mg/kg CTX腹腔注射建立DOR模型。

1.5 用藥：根據(jù)體表面積換算法[1]，何氏養(yǎng)巢方成人每天劑量90g，以標(biāo)準(zhǔn)劑量的0.5、1、2倍分低、中、高濃度進(jìn)行灌胃，給藥量分別為 3.25g/kg·d-1、6.5g/kg·d-1、13g/kg·d-1浸膏；DHEA成人劑量75mg/d，小鼠給藥量為9.75mg/kg·d-1，對(duì)照組、DOR組予0.2ml生理鹽水灌胃。

1.6 超排與取卵：雌鼠腹腔注射PMSG 48h后再注射HCG，兩種促性腺激素注射量均為10IU/只，HCG給藥后14～16h予脊椎脫臼法處死小鼠，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）并放入二氧化碳培養(yǎng)箱暫存。

1.7 精子收集及獲能：頸椎脫臼法處死雄性小鼠，將附睪尾獲取的精子放入提前準(zhǔn)備獲能皿，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時(shí)以獲能。

1.8 體外受精：將COCs加入受精液中，隨即加入獲能精子，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精，孵育時(shí)間為6h左右。受精結(jié)束后，將受精卵移入37℃、5% CO2條件下含有新鮮KSOM的培養(yǎng)皿，24h后統(tǒng)計(jì)2-細(xì)胞胚胎數(shù)，96h后統(tǒng)計(jì)囊胚數(shù)。

1.9 囊胚中OCT4免疫熒光染色：挑出形態(tài)良好的囊胚，預(yù)處理后轉(zhuǎn)入OCT4一抗中，4℃孵育過夜，次日用洗脫液洗滌3次，然后將囊胚轉(zhuǎn)移至含有Alexa Fluor 555染料標(biāo)記的二抗中，室溫避光孵育孵1h，用洗脫液洗滌3次，然后DAPI染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用 GraphPad prism軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料結(jié)果表示為Means±SD，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 何氏養(yǎng)巢方對(duì)DOR小鼠促排卵數(shù)的影響：見圖1。

圖1 各組小鼠促排后收集的COCs數(shù)比較

2.2 何氏養(yǎng)巢方對(duì)DOR小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響：見圖2。A組表示各組2-細(xì)胞胚胎數(shù)；B組表示各組囊胚數(shù)。

圖2 各組小鼠早期胚胎發(fā)育情況

2.3 何氏養(yǎng)巢方對(duì)胚胎質(zhì)量的影響：見圖3。

圖3 各組小鼠囊胚的OCT4陽性細(xì)胞百分比

3 討論

DOR患者在體外受精（IVF）過程中往往對(duì)促排卵藥物不敏感，其常表現(xiàn)為獲卵少且卵子質(zhì)量低下，往往是IVF失敗的主要原因。如何改善DOR患者的生殖功能，在IVF過程中獲得適量且高質(zhì)量的卵子是目前生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

根據(jù)DOR的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬中醫(yī)學(xué)“不孕”“血枯”等范疇[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，主生殖，卵子的生長發(fā)育有賴于腎精充足，腎精虧虛是DOR的主要病機(jī)，臨床辨證論治常以補(bǔ)腎填精為主[3]。中醫(yī)藥與ART聯(lián)合應(yīng)用于DOR不孕癥患者的助孕治療往往可取得較好的療效。

IVF以非侵襲性方式避免了對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育造成的不利影響，是評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)劣直接、無創(chuàng)、可靠的方法[4]。以往研究顯示，DHEA能提高C57BL/6J小鼠超排卵效果，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎填精中藥何氏養(yǎng)巢方以劑量依賴性方式增加了DOR小鼠IVF中的獲卵數(shù)、2-細(xì)胞胚胎數(shù)以及囊胚數(shù)等，且效果優(yōu)于DHEA。

OCT4在內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)（ICM）中特異性表達(dá)，OCT4缺陷或表達(dá)水平低的小鼠胚胎無法形成ICM，失去多能性及自我更新能力[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，何氏養(yǎng)巢方能顯著提高DOR小鼠囊胚中OCT4陽性細(xì)胞比例，激發(fā)胚胎發(fā)育潛能，提高胚胎質(zhì)量。然而，胚胎質(zhì)量優(yōu)劣與卵母細(xì)胞質(zhì)量高低密切相關(guān)，這也反映了何氏養(yǎng)巢方具有提高DOR小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用。

綜上，何氏養(yǎng)巢方可以提高DOR小鼠超排卵后獲卵數(shù)和卵母細(xì)胞質(zhì)量，將補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方與輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，成為了中醫(yī)理論“腎藏精，主生殖”的又一力證，并為進(jìn)一步探討中醫(yī)藥在輔助生殖領(lǐng)域中的作用奠定了基礎(chǔ)。