α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達及機制研究

倪磊 郭健 于雪 張凝 韓依影 楊瑜愛 楊建仁 李春蕊 賈娟 劉天華

肝癌作為世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居第四位，由于其本身惡性程度高、侵襲能力強、發(fā)展迅速，故而預(yù)后較差[1-2]。α-1,3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV(α-1,3-fucosyltransferase IV, FUT4)可以催化巖藻糖殘基由UDP-Fuc轉(zhuǎn)移至N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc )并形成α-1,3-糖苷鍵，從而參與路易斯抗原Y (Lewis antigen Y, LeY)的形成，其表達水平在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程中均有所提高[3-6]。然而，在肝癌轉(zhuǎn)移過程中FUT4的表達及相關(guān)機制仍需進一步探究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞獲得間質(zhì)特征的生物學(xué)過程[7]。EMT過程中，細胞會發(fā)生向紡錘形間質(zhì)細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變，以E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等為代表的上皮標(biāo)志物的表達會發(fā)生下調(diào)，而以N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等為代表的間質(zhì)標(biāo)志物的表達會發(fā)生上調(diào)[8]。EMT能夠增強細胞的遷移、侵襲及抗凋亡能力，被認為是大多數(shù)上皮細胞來源于惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[9]。本研究主要通過檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞以及人肝癌MHCC97L細胞EMT模型中FUT4的表達水平，并借助生物信息學(xué)分析獲取FUT4在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中的表達水平和共表達基因，進行KEGG通路富集分析，探究FUT4在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達及機制，以期為肝癌轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

(一)細胞 人肝癌細胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3為本實驗室凍存，復(fù)蘇使用；其中MHCC97L為低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞，MHCC97H、HCCLM3為高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞。

(二)試劑 TGF-β1(美國R&D公司)，RNA提取試劑盒(廣東廣州美基生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ThermoFisher Scientific公司)，E-鈣黏蛋白抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，N-鈣黏蛋白抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，波形蛋白抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(上海康成生物工程有限公司)。

二、實驗方法

(一)細胞培養(yǎng) 實驗所需人肝癌細胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

(二)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型 人肝癌MHCC97L細胞以1×105/孔接種于六孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換無血清DMEM培養(yǎng)基，加入10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)72 h，以無血清DMEM培養(yǎng)細胞為對照，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

(三)qRT-PCR檢測 采用RNA提取試劑盒提取不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞以及對照組和TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組總RNA。以2 mg RNA為模板進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成，隨后進行qRT-PCR反應(yīng)，擴增程序設(shè)定為：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，72 ℃，20 s，共40個循環(huán)；以GAPDH為內(nèi)參，所用引物序列如下： FUT4-forward 5′-TCCTACG-GAGAGGCTCAG-3′，F(xiàn)UT4-reverse 5′-CCTCGTAGTC-CAACACG-3′；E-cadherin-forward 5′-GAATGACAAC-AAGCCCGAAT-3′，E-cadherin-reverse 5′-GACCTCCA-TCACAGAGGTTCC-3′；N-cadherin-forward 5′-GGTG-GAGGAGAAGAAGACCAG -3′，N-cadherin-reverse 5′-CATCAGGCTCCACAGT-3′；Vimentin-forward 5′-TG-GTTGCTTCAAGGACACAT-3′，Vimentin-reverse 5′-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3′；GAPDH-forward 5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，GAPDH-reverse 5′-GAGGGGAGATTCAGTGTGGT-3′。

(四) Western blot檢測 提取對照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量后與5×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸。取等量蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，采用半干電轉(zhuǎn)移的方法將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、GAPDH抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜；0.1% TBST洗膜3次后加入二抗，室溫孵育1 h；0.1% TBST洗膜3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。

(五)生物信息學(xué)分析 采用人類腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫(Human Cancer Metastasis Database, HCMDB)檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達水平及共表達基因相關(guān)數(shù)據(jù)[10]。將FUT4及其共表達基因?qū)隣micsBean數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗，設(shè)定P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、FUT4在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞中的表達

采用qRT-PCR檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3中FUT4的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97L細胞相比，高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞MHCC97H與HCCLM3中FUT4的表達水平均顯著提高(P<0.01)，分別為MHCC97L細胞中的4.99倍和6.08倍。

二、 TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型的建立

通過TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞構(gòu)建EMT模型，于顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖1A所示，與對照組相比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)72 h后MHCC97L形態(tài)由多邊形變?yōu)榧忓N形。

qRT-PCR檢測對照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組EMT標(biāo)志分子的mRNA表達水平。結(jié)果如表1所示，與對照組相比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細胞中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，為對照組的0.63倍；而間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白與波形蛋白表達水平均顯著提高(P<0.001)，分別為對照組的3.10倍和1.58倍。Western blot檢測對照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組EMT標(biāo)志分子的蛋白表達水平，結(jié)果顯示蛋白表達變化與mRNA表達變化一致(圖1B)。

表1 qRT-PCR檢測TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細胞EMT標(biāo)志分子的表達水平

(A)TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細胞的形態(tài)變化；(B)Western blot檢測TGF-β1誘導(dǎo)MHCC97L細胞EMT標(biāo)志分子的表達水平

三、FUT4在TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型中的表達

采用qRT-PCR檢測對照組及TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組FUT4的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，在TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞EMT模型組中FUT4的表達水平顯著提高(P<0.01)，為對照組的1.42倍。

四、 轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達水平及共表達基因

通過HCMDB數(shù)據(jù)庫檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達水平及共表達基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。實驗EXP00134 (Dataset ID: GSE40367)顯示，與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本相比，轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達水平提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2A)；并且進一步獲取了包括SPINT1、FUT8、PROM1、ITGB8、 ITGA3、 ITGB4等在內(nèi)的200個FUT4共表達基因。

(A)HCMDB數(shù)據(jù)庫檢索轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達(**, P<0.01)；(B)FUT4及其共表達基因的KEGG通路富集分析

五、FUT4及其共表達基因的KEGG通路富集分析

將由HCMDB數(shù)據(jù)庫檢索獲得的FUT4共表達基因與FUT4一起輸入OmicsBean數(shù)據(jù)庫，進行KEGG通路富集分析。結(jié)果如圖2B顯示，富集到了腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常(Transcriptional misregulation)、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)以及ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)等KEGG通路。

討 論

FUT4作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族一員，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已有文獻報道表明，F(xiàn)UT4可以作為乳腺癌早期診斷和病程監(jiān)測的潛在分子標(biāo)志物[4]。然而，關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移中FUT4的表達及相關(guān)機制仍有待進一步探究?；诖?，本研究不僅通過檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞中FUT4的表達證實了其在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞中表達水平顯著提高，并且通過TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌MHCC97L細胞建立了EMT模型，進一步驗證了FUT4表達的變化；此外，還借助生物信息學(xué)的方法獲取了轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移肝癌樣本中FUT4的表達水平及共表達基因，并且對FUT4及其共表達基因進行了KEGG通路富集分析。

在KEGG通路富集分析結(jié)果中，共表達基因SPINT1、FUT8、PROM1等被富集到了腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常通路。已有報道證實，SPINT1的表達水平與分化型甲狀腺癌的淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)高風(fēng)險存在緊密關(guān)聯(lián)[11]。FUT8與FUT4同為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員，其可以通過影響TGF-β 受體促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]；在前列腺癌細胞中上調(diào)FUT8則可以通過影響胞外囊泡糖蛋白的糖基化修飾促進轉(zhuǎn)移[13]。PROM1又被稱為CD133，目前已被證實在胰腺癌中其表達水平與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。共表達基因ITGB8在肺癌中可以通過影響轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，改變侵襲表型，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[15]；在結(jié)直腸癌中，ITGB8的異位表達則可以抑制細胞侵襲，影響腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。ITGA3同樣為FUT4的共表達基因，通過敲減其表達可以抑制頭頸部鱗狀細胞癌細胞和前列腺癌細胞的遷移侵襲[17-18]。而共表達基因細胞黏附分子ITGB4的高表達則已被證實與宮頸癌淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)[19]。KEGG通路富集分析結(jié)果提示，共表達基因ITGB8、ITGA3以及ITGB4不僅參與了肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)，還參與了ECM受體相互作用。由此可見，F(xiàn)UT4及其共表達基因可能通過腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、ECM受體相互作用等KEGG通路參與肝癌轉(zhuǎn)移過程。

總之，本研究完成了對FUT4在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達及機制的初步探索，并且為肝癌轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了以FUT4為潛在生物學(xué)標(biāo)志物與靶點的新思路。