產(chǎn)糖乳酸菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

韓 瑨

(光明乳業(yè)股份有限公司 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436)

微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)被定義為由微生物分泌到周圍環(huán)境中的高分子聚合物，其主要作用是協(xié)助細(xì)菌黏附以及抵抗各種不利的環(huán)境因素(干燥、有毒和/或環(huán)境壓力等)[1]。乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)作為一類典型的EPS產(chǎn)生菌，在食品加工領(lǐng)域有著長(zhǎng)期且安全的應(yīng)用歷史[2]。由于LAB通常被認(rèn)為是安全的食品級(jí)微生物，因此LAB及其純化的EPS可直接被應(yīng)用于乳制品行業(yè)，以代替商業(yè)乳化劑和增稠劑，從而改善酸奶或發(fā)酵乳的黏度、質(zhì)地和口感[3]。除了上述優(yōu)異的加工性能外，LAB EPS還可為環(huán)境(生物絮凝劑、生物吸收劑和重金屬去除劑[4])和人體健康(抗腫瘤劑[5]、免疫刺激劑、抗氧化劑[6]、藥物輸送劑[7]、益生元[8])提供多種增益作用。盡管LAB EPS的各類功效得到了廣泛的認(rèn)同，并且該領(lǐng)域的文章發(fā)表數(shù)量與日俱增，但被市場(chǎng)化、產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品卻鳳毛麟角(α-葡聚糖如右旋糖苷[9]、β-果聚糖如levan[10])。乳桿菌屬(Lactobacillus)微生物是LAB的重要分支，至今已有超過180種微生物劃歸該屬，其典型的菌株特性為革蘭陽性、無孢子形成、酶觸反應(yīng)陰性、兼性需氧或微需氧、桿狀、營(yíng)養(yǎng)需求復(fù)雜(碳水化合物、氨基酸、維生素等)。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)是乳桿菌家族的成員之一，最早被發(fā)現(xiàn)于1968年并歸類為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的一個(gè)亞種，后于近代(1989年)被重新歸類為一個(gè)獨(dú)立的乳桿菌種。到目前為止已有大量學(xué)者針對(duì)L.rhamnosus的各種益生特性進(jìn)行了廣泛的報(bào)道。Yan等[11]發(fā)現(xiàn)新生小鼠在定殖了鼠李糖乳桿菌LGG后腸道發(fā)育更健康，其成年期的易感性更低。Pahumunto等[12]認(rèn)為，每天飲用含有鼠李糖乳桿菌-SD11和麥芽糖醇的發(fā)酵牛奶，可有效降低唾液變異鏈球菌對(duì)口腔的危害。不難發(fā)現(xiàn)，此類報(bào)道的研究對(duì)象多為鼠李糖乳桿菌菌體本身或其發(fā)酵混合物，但有關(guān)該類微生物的具體代謝產(chǎn)物(如EPS等)及其生物學(xué)功能的研究卻相對(duì)偏少。Shao等[13]從L.rhamnosusKF5發(fā)酵乳中分離獲得2個(gè)多糖組分，研究人員在對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征后，還進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩組分均有不同程度的調(diào)節(jié)免疫活性。鑒于微生物來源的功能性EPS的應(yīng)用范圍越來越廣，更多的產(chǎn)糖LAB需要被發(fā)掘和研究。針對(duì)上述研究背景，本研究首先從篩選EPS高產(chǎn)的LAB入手，繼而對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行了鑒定，最后利用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菌株產(chǎn)糖條件，旨在為后續(xù)相關(guān)的開發(fā)與研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源LactobacillusrhamnosusB6(CGMCC No.13310)、KF7由光明乳業(yè)股份有限公司提供；LactobacillusbulgaricusLB340、HM及StreptococcusthermophilusST-21、TA-40由丹尼斯克公司提供；Lactobacilluscasei334、393購(gòu)自ATCC。

1.1.2 試驗(yàn)材料 脫脂乳粉(Foterra，新西蘭)，主要成分為乳糖54.5%、蛋白質(zhì)32.9%、礦物質(zhì)7.9%、水分3.8%、脂肪0.9%。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 MRS瓊脂/液體培養(yǎng)基(默克公司，德國(guó))；M17瓊脂/液體培養(yǎng)基(OXOID LTD.，英國(guó))；三氯乙酸、無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 電爐(108H，F(xiàn)isher scientific公司)；高壓滅菌鍋(HVE-50，HIRAYAMA公司)；超凈工作臺(tái)(SG-402TX，THE BAKER COMPANY公司)；高速冷凍離心機(jī)(AVANTI J30I，美國(guó)BECKMAN COULTER公司)；真空冷凍干燥機(jī)(FreeZone 12，美國(guó)LABCONCO公司)；黏度計(jì)(R180，德國(guó)proRheo公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵種子的制備 將L.rhamnosusB6、KF7、L.bulgaricusLB340、HM、L.casei334、393和S.thermophilusST-21、TA-40的凍干粉以少量無菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)挑取一環(huán)劃線于MRS(桿菌培養(yǎng))或M17(球菌培養(yǎng))瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL 對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于50 mL 對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，15 000 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀部分以無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，即得發(fā)酵種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 脫脂乳培養(yǎng)基的制備：將脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，120 ℃滅菌20 min即得質(zhì)量濃度40～120 mg/mL的無菌脫脂乳培養(yǎng)基。

1.2.3 多糖的制備 將發(fā)酵乳于15 000 r/min離心10 min，取上清，加入3倍的80%～100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇于上述離心后的上清液中，靜置過夜，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀物并溶于少量蒸餾水中，加入三氯乙酸，使其終濃度達(dá)到10%(體積分?jǐn)?shù))，冷藏過夜，15 000 r/min離心10 min，取上清，透析袋(MWCO=14 kD)透析48 h，期間每8 h換水一次，袋內(nèi)透析液經(jīng)真空冷凍干燥即得多糖。

1.2.4 發(fā)酵乳黏度的測(cè)定 使用黏度計(jì)對(duì)發(fā)酵乳的黏度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量條件：德國(guó)proRheo公司R180型黏度計(jì)、1#轉(zhuǎn)子、轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/秒，溫度15 ℃。

1.2.5 高產(chǎn)EPS菌株的篩選與鑒定 將1.2.1所述方法制備的發(fā)酵種子液按3%(體積分?jǐn)?shù))的接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，根據(jù)1.2.3和1.2.4所述方法測(cè)定發(fā)酵乳的黏度和多糖含量。采用生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rDNA基因序列比對(duì)的方法對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.6 產(chǎn)糖條件的單因素實(shí)驗(yàn) ①發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響：將L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于12、24、36、48和60 h取樣，按1.2.3所述方法制備多糖并稱重。②發(fā)酵溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響：L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，分別于31、34、37、40和43 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，按1.2.3所述方法制備多糖并稱重。③脫脂乳濃度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響：將L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入40、60、80、100和120 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，按1.2.3所述方法制備多糖并稱重。④接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響：將L.rhamnosusB6種子液分別以1%、3%、5%、7%和9%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，按1.2.3所述方法制備多糖并稱重。

1.2.7 產(chǎn)糖條件的響應(yīng)面優(yōu)化 ①響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對(duì)4個(gè)影響EPS合成的主要因素：發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、脫脂乳濃度(C)和接種量(D)，采用Box-Behnken法進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。每個(gè)因素取3個(gè)水平(表1)，分別用-1、0、1表示，形成4因素3水平的響應(yīng)面分析。以多糖含量為響應(yīng)值，A、B、C和D為自變量，利用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型，最后求得最優(yōu)影響因子水平組合。②驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：將L.rhamnosusB6分別在優(yōu)化條件和未優(yōu)化條件(1.2.5所述條件)下發(fā)酵，按1.2.3所述方法制備多糖、稱重，并與預(yù)測(cè)值比較。③數(shù)據(jù)處理：采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及回歸模型建立，運(yùn)用Origin Pro 2016、Excel 2013 進(jìn)行圖像制作。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素、水平和代碼

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選與鑒定

將不同菌株的種子液按3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接種于100 mg/mL脫脂乳，靜置發(fā)酵24 h，所得發(fā)酵乳的黏度和多糖含量如圖1所示。L.rhamnosusB6發(fā)酵乳的黏度和多糖含量最高，為0.215 Pa·s和261 mg/L，S.thermophilesTA-40(0.174 Pa·s、224 mg/L)、ST-21(0.136 Pa·s、195 mg/L)發(fā)酵乳次之，而L.bulgaricusLB340、HM發(fā)酵乳因多糖含量過低而無法測(cè)得黏度值。S.thermophiles和L.bulgaricus產(chǎn)糖性能的巨大反差與各自的發(fā)酵特性有關(guān)。S.thermophiles和L.bulgaricus是酸奶發(fā)酵的傳統(tǒng)乳酸菌株，前者可通過發(fā)酵產(chǎn)EPS增加酸奶的黏度，后者則是乳酸產(chǎn)生與積累的主要貢獻(xiàn)者[14]。在篩選過程中L.rhamnosusB6表現(xiàn)出更優(yōu)于S.thermophiles的產(chǎn)糖性能，因此值得進(jìn)一步研究。

圖1 不同發(fā)酵乳的多糖含量與黏度比較

EPS高產(chǎn)菌株B6的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，其結(jié)果結(jié)合16S rDNA序列(未列出)顯示B6為1株L.rhamnosus，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，編號(hào)為CGMCC No.13310。

表2 L.rhamnosus B6的生理生化特性

2.2 產(chǎn)糖條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 將L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，測(cè)定不同時(shí)間獲得的發(fā)酵乳中的多糖含量，結(jié)果如圖2A所示。在發(fā)酵初期，L.rhamnosusB6 EPS的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中發(fā)酵12～24 h的發(fā)酵乳中EPS的積累速率最快(137 mg/L)，產(chǎn)率最高(11.4 mg/L/h)，這是因?yàn)橥ㄟ^12 h的增殖作用后，脫脂乳體系內(nèi)的L.rhamnosusB6菌體達(dá)到較高水平，大量高活力菌體利用碳源充足的環(huán)境優(yōu)勢(shì)，完成了短時(shí)、高速合成特定產(chǎn)物(EPS)的代謝作用。當(dāng)發(fā)酵36 h時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到峰值(308 mg/L)。進(jìn)一步延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中EPS含量依次降低，分別為295 mg/L(48 h)和277 mg/L(60 h)。對(duì)于這種現(xiàn)象可能的解釋有兩種：一是乳酸菌發(fā)酵過程中積累的有機(jī)酸對(duì)EPS產(chǎn)生的降解作用；二是菌體為應(yīng)對(duì)發(fā)酵后期碳源匱乏的生境而降解EPS。鑒于EPS產(chǎn)量最大值出現(xiàn)在36 h，因此選取該時(shí)間點(diǎn)作為最適發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 將L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，分別于不同溫度(31、34、37、40和43 ℃)下厭氧培養(yǎng)24 h，各發(fā)酵乳中多糖含量如圖2B所示。以31 ℃為起點(diǎn)，L.rhamnosusB6發(fā)酵乳的EPS含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加，40 ℃時(shí)達(dá)到最高值(296 mg/mL)，該現(xiàn)象說明40 ℃有利于L.rhamnosusB6代謝合成與積累EPS，大部分鼠李糖乳桿菌在40 ℃左右均具備一定的代謝活性(降解亞硝酸鹽[15]、降血糖[16]等)，因此40 ℃為L(zhǎng).rhamnosusB6的優(yōu)選發(fā)酵溫度。

2.2.3 脫脂乳濃度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 將L.rhamnosusB6種子液以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入含40、60、80、100和120 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，經(jīng)測(cè)定不同脫脂乳濃度的發(fā)酵乳中多糖含量分別為156、231、288、261和254 mg/L(圖2C)。多糖產(chǎn)量的差異可能與培養(yǎng)基中養(yǎng)分和EPS合成底物的濃度以及滲透壓有關(guān)。當(dāng)脫脂乳濃度較低時(shí)，培養(yǎng)基中可用于細(xì)菌增殖的養(yǎng)分以及合成EPS的碳源相對(duì)不足，致使EPS產(chǎn)量減少，而高濃度脫脂乳帶來的高滲透壓直接影響細(xì)胞膜的通透性，從而降低菌株正常代謝和EPS產(chǎn)量。由圖2C可知，80 mg/mL發(fā)酵乳中的EPS含量最高，表明該培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、底物濃度以及滲透壓力對(duì)L.rhamnosusB6來說最適合，因此80 mg/mL為最適脫脂乳濃度。

圖2 發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、脫脂乳濃度(C)和接種量(D)對(duì)多糖產(chǎn)量的影響

2.2.4 接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 將L.rhamnosusB6種子液以1%、3%、5%、7%和9%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接入100 mg/mL脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，分析接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(圖2D)。當(dāng)接種量處于較低水平(1%～3%)時(shí)，多糖含量隨著接種量的增加而增加(186、261 mg/L)，繼續(xù)增加接種量至5%時(shí)，發(fā)酵乳中多糖含量達(dá)到峰值(286 mg/mL)，再進(jìn)一步加大接種量發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵乳中累積的多糖總量不再增加，表明發(fā)酵體系中的部分多糖合成原料被大量菌體消耗，最終導(dǎo)致單位體積內(nèi)的多糖含量趨于穩(wěn)定或相對(duì)不足。因此選擇對(duì)多糖積累效果最佳的接種量5%(體積分?jǐn)?shù))為最適接種量。

2.3 產(chǎn)糖條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步選用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵乳體系中的主要影響因素(發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、脫脂乳濃度和接種量)和評(píng)價(jià)因素(多糖含量)的相關(guān)性及其相互影響進(jìn)行了系統(tǒng)分析，通過專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件(Design Expert 8.0.6)推算建立二次回歸數(shù)學(xué)模型，從而獲得一組模擬的優(yōu)選發(fā)酵條件組合。在Box-Behnken中心組合原理的指導(dǎo)下，共設(shè)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)29個(gè)，其中析因點(diǎn)24個(gè)，中心零點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)5個(gè)，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面的設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 8.0.6分析后獲得多元二次響應(yīng)面回歸模型：多糖含量(mg/L)=363+14.687A-9.83B+15.17C+2.33D-2.00AB-0.25AC+3.25AD-14.42A2-29.42B2-33.17C2-14.17D2。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析后發(fā)現(xiàn)，模型高度顯著(P< 0.000 1)，且無失擬項(xiàng)因素存在(P=0.353 5>0.05)，模型復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.990 6，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的誤差小，擬合程度極高，無需引入更高次的項(xiàng)來提高擬合度，而調(diào)整R2=0.981 3顯示調(diào)整后的模型擬合度依然處于較高水平(表4)。由此可見，該模型可較好地描述L.rhamnosusB6合成多糖過程中各主要因素的影響狀況，對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化具有重要的指導(dǎo)意義。

表4 響應(yīng)面模型的方差分析

各因素間的交互作用對(duì)L.rhamnosusB6多糖產(chǎn)量的影響順序：AD(P=0.080 8)=BD(P=0.080 8)>BC(P=0.133 6)>AB(P=0.266 2)>AC(P=0.887 0)>CD(P=1.000 0)，其中部分因素的交互作用(發(fā)酵溫度和脫脂乳質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間和接種量)對(duì)多糖產(chǎn)量的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度和脫脂乳濃度(A)、發(fā)酵時(shí)間和接種量(B)對(duì)多糖含量的交互影響

通過響應(yīng)面分析軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行推算和預(yù)測(cè)，獲得優(yōu)選的發(fā)酵條件組合：發(fā)酵時(shí)間41.46 h，發(fā)酵溫度39.11 ℃，脫脂乳質(zhì)量濃度90.6 mg/mL，接種量4.7%(體積分?jǐn)?shù))，在此條件下，發(fā)酵乳中粗多糖含量可達(dá)365.6 mg/L。為提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可操作性，對(duì)優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行取整化處理：發(fā)酵時(shí)間41 h、發(fā)酵溫度39 ℃、脫脂乳質(zhì)量濃度91 mg/mL，接種量5%(體積分?jǐn)?shù))。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)參數(shù)的可靠性，將L.rhamnosusB6分別于優(yōu)化條件(發(fā)酵時(shí)間41 h、發(fā)酵溫度39 ℃、脫脂乳質(zhì)量濃度91 mg/mL，接種量5%)和未優(yōu)化條件(發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃、脫脂乳質(zhì)量濃度100 mg/mL、接種量3%)下發(fā)酵，按1.2.3所述方法測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)處各體系中的多糖含量，同時(shí)與預(yù)測(cè)含量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。

圖4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證，在優(yōu)化條件下，L.rhamnosusB6的多糖平均產(chǎn)量為354.5 mg/L，基本與預(yù)測(cè)值(365.6 mg/L)處于同一水平。與優(yōu)化前(261 mg/L)相比，優(yōu)化后的發(fā)酵乳中多糖含量顯著提高了35.8%。上述數(shù)據(jù)表明應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)L.rhamnosusB6發(fā)酵產(chǎn)糖條件的優(yōu)化是有效的。

3 討 論

自L.rhamnosus被發(fā)現(xiàn)以來，以菌株LGG為代表的研究最為廣泛。近期有綜述總結(jié)了該菌株三十年來的研究成果，發(fā)現(xiàn)其具備黏附細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗氧化、治療腹瀉等多種有益的生物學(xué)活性[17]。Tuo等[18]指出4株野生型L.rhamnosusSB5L、J5L、SB31L和1N1L可耐受或存活于模擬胃腸液，拮抗大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌等致病微生物，其活菌、細(xì)胞壁和胞內(nèi)遺傳物質(zhì)(DNA)可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-12、IFN-g和TNF-α。Martin等[19]提出L.rhamnosusCNCM I-3690菌株可通過刺激黏液產(chǎn)量和細(xì)胞保護(hù)應(yīng)答保護(hù)腸屏障。Hu等[20]指出，攝入L.rhamnosusFLRH93發(fā)酵乳可刺激上調(diào)腸道中Bcl-2的表達(dá)，且下調(diào)NLRP3的表達(dá)，從而減少炎癥因子白介素1-β(IL1-β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生，進(jìn)而改善或預(yù)防由癌癥化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)引發(fā)的腸道損傷。上述研究為鼠李糖乳桿菌在功能型產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了大量理論依據(jù)。

然而，有關(guān)L.rhamnosus的報(bào)道大多集中在菌體本身或發(fā)酵混合物，但對(duì)明確的代謝產(chǎn)物(如EPS等大分子代謝產(chǎn)物)的研究相對(duì)較少。研究人員通過摸索總結(jié)得到多種提高L.rhamnosus多糖產(chǎn)量的方法：調(diào)整培養(yǎng)條件[21]、過氧化物刺激[22]、與其他菌株共培養(yǎng)[23]等。Peant等[24]發(fā)現(xiàn)4株L.rhamnosus的多糖合成基因簇極為相似，均由長(zhǎng)度為185 kb，負(fù)責(zé)編碼17個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)的染色體區(qū)域組成。Shao等[13]從L.rhamnosusKF5的發(fā)酵乳中分離獲得兩個(gè)多糖組分S1和S2：前者的分子量為1.36×104D，單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、半乳糖胺和半乳糖，比例為2.03∶1.29∶1.25∶0.72∶0.61；后者的分子量為1.23×106D，單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，比例為1.73∶1.47∶1.00。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)組分對(duì)脾細(xì)胞的體外增殖有顯著的刺激作用。L.rhamnosusKL37的多糖可抑制來自T-細(xì)胞的免疫應(yīng)答[25]，并積極影響炎癥介質(zhì)的產(chǎn)量[26]，從而發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。盡管此類報(bào)道已覆蓋了多糖的產(chǎn)量提高、結(jié)構(gòu)表征、產(chǎn)糖基因以及功能等多個(gè)研究領(lǐng)域，但相關(guān)研究還缺乏深度，尤其在功能機(jī)制和作用機(jī)理方面有待進(jìn)一步發(fā)掘，此外，鮮有結(jié)構(gòu)、功能、機(jī)理三者一體化、完整化、系統(tǒng)化的L.rhamnosus多糖報(bào)道呈現(xiàn)。

本研究首先從篩選EPS高產(chǎn)的LAB菌株入手，篩選到多糖產(chǎn)量顯著高于常規(guī)乳酸菌的菌株L.rhamnosusB6。其生理生化結(jié)合16S rDNA結(jié)果顯示，該菌株為1株L.rhamnosus，通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L.rhamnosusB6的最適產(chǎn)糖條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、發(fā)酵溫度40 ℃、脫脂乳質(zhì)量濃度80 mg/mL、接種量5%(體積分?jǐn)?shù))，最后利用響應(yīng)面法分析了各影響因素間的相互作用，結(jié)果顯示，將L.rhamnosusB6以5%(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌接種于質(zhì)量濃度為91 mg/mL的脫脂乳中，39 ℃靜置發(fā)酵41 h后，所得發(fā)酵乳中的多糖含量可達(dá)354.5 mg/L，產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了35.8%。本研究為L(zhǎng).rhamnosusB6多糖的后續(xù)研究提供了研究材料的基本保障，L.rhamnosusB6多糖的結(jié)構(gòu)表征、生物活性及其機(jī)制的探索將在此基礎(chǔ)上有序開展。