卵母細胞透明帶ZP3基因雜合變異患者成功分娩1例

葉蕾，王佳，朱愛珍

(山西省運城市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學科，運城 044000)

一、病例資料

患者，女，33歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)24.8 kg/m2，未避孕4年未孕，外院子宮輸卵管造影(HSG)提示雙側(cè)輸卵管呈炎性改變，通而不暢，口服中藥治療4個周期未孕，2019年1月28日于本院首診。月經(jīng)史：14歲，7 d/30～60 d，量中，無痛經(jīng)，但需服用黃體酮調(diào)整月經(jīng)周期。2019年2月15日TORCH檢查正常；陰道B超示左卵巢2個竇卵泡，右卵巢1個竇卵泡?？姑缋展芗に?AMH)為1.32 ng/ml。宮腔鏡檢查提示宮腔形態(tài)正常，子宮內(nèi)膜增厚；病檢結果顯示子宮內(nèi)膜呈單純性增生。男方精液檢查：濃度65×106/ml，前向精子運動率(PR)40%。基礎性激素：FSH 15.45 U/L、LH 8.35 U/L、雌二醇(E2)293.6 pmol/L，睪酮(T)0.67 nmol/L，促甲狀腺激素(TSH)2.07 mU/L。2019年3月20日檢查女方染色體為46，XX。監(jiān)測4個自然周期排卵，無優(yōu)勢卵泡發(fā)育。促排4個周期，3個周期無優(yōu)勢卵泡發(fā)育，1個周期有排卵但未孕。于2019年6月轉(zhuǎn)行IVF助孕。初步診斷：(1)原發(fā)不孕；(2)排卵障礙；(3)卵巢功能減退。

IVF助孕共3個周期。第1周期：采用拮抗劑方案，2019年6月16日給予麗申寶(珠海麗珠制藥)225 U啟動，促性腺激素(Gn)使用時間12 d，Gn用量4 050 U，卵泡數(shù)3個，HCG注射日E2水平3 005.69 pmol/L，LH水平1.16 U/L，孕酮(P)0.73 nmol/L。2019年6月29日獲卵3枚，行常規(guī)IVF，授精濃度為精卵比5×104∶1，4 h后脫顆粒觀察受精情況，3枚卵母細胞的透明帶(ZP)均不完整(圖1A)，且無正常卵母細胞胞質(zhì)結構。

第2周期：采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS方案)，2019年8月12日給予HMG(珠海麗珠制藥)225 U啟動，Gn使用時間9 d，Gn用量2 025 U，卵泡數(shù)3個，HCG注射日E2水平3 042.72 pmol/L，LH 0.71 U/L，P 0.76 nmol/L。2019年8月22日獲卵2枚，授精方式為卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，脫顆粒后獲MⅡ卵母細胞1枚，ZP不完整的卵母細胞1枚(圖1B)。MⅡ卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，第1天觀察原核(PN)，形成1枚2PN胚胎；第3天形成1枚5細胞3級(5C3)可用胚胎(圖2A)，冷凍保存。2019年8月28日對患者的ZP1、ZP3基因進行測序發(fā)現(xiàn)：在ZP3基因上存在雜合變異，變異點為：chr7：76069913-/T：c.1045_1046insT(圖1D)。對患者父母的ZP1、ZP3基因進行測序未檢測到此變異，該變異為新發(fā)變異。

第3周期：采用PPOS方案，2019年10月3日給予HMG 300 U啟動，Gn使用時間9 d，Gn用量2 700 U，卵泡數(shù)5個，HCG注射日E24 466.90 pmol/L，LH水平3.02 U/L，P 1.02 nmol/L。2019年10月14日獲卵5枚，行ICSI授精，脫顆粒后獲MⅡ卵母細胞3枚，ZP不完整的卵母細胞2枚(圖1C)。3枚MⅡ卵母細胞行ICSI，第1天觀察PN，形成2PN胚胎1枚，0PN胚胎2枚；第3天形成1枚8細胞1.5級(8C1.5)優(yōu)質(zhì)胚胎(圖2B)，冷凍保存。

A：第1周期；B：第2周期；C：第3周期；D：ZP3基因雜合突變位點(箭頭)圖1 各周期獲得的ZP不完整的卵母細胞(×400)及ZP3基因突變位點

凍融胚胎移植(FET)：月經(jīng)(或撤退出血)第5天開始給予雌激素戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳醫(yī)藥，德國)，采用遞增方案，起始劑量為6 mg/d，通過B超檢查監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，適當調(diào)整藥物用量；當超聲檢查提示子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm，開始內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚藥業(yè))60 mg/d×4 d。移植前1日下午解凍2枚胚胎，行激光輔助孵化(削薄范圍為部分ZP，削薄厚度為50%～80%)，過夜培養(yǎng)后增殖為13C1.5和6C3兩枚胚胎(圖2C、D)。注射黃體酮后第5天，在超聲引導下移植此2枚卵裂期胚胎，并繼續(xù)使用黃體酮及補佳樂。在移植后第14天測血β-HCG水平為1 243 U/L，移植后35 d超聲可見宮內(nèi)兩個孕囊，均見胎芽胎心，孕37+3周經(jīng)剖宮產(chǎn)成功分娩2個女嬰，均活產(chǎn)，新生兒評分為7和6分，體重1 200 g和1 125 g，未見明顯出生缺陷，現(xiàn)出生11個月，體健。

二、討論

人類ZP是包圍卵母細胞和植入前胚胎的細胞外糖蛋白基質(zhì)，在卵泡發(fā)育過程中初級卵泡階段開始形成，并隨著卵泡發(fā)育而增加[1]。ZP是一種高度有序的動態(tài)結構，對卵母細胞發(fā)生、受精和早期胚胎發(fā)育至關重要。我院收治的本例不孕患者ZP3基因新發(fā)雜合變異，所獲卵母細胞多無正常卵母細胞胞質(zhì)結構，同時伴有ZP斷裂等異常形態(tài)，有文獻稱之為不完整ZP[2]。

ZP在生殖發(fā)育過程中起重要作用，參與卵母細胞發(fā)生、受精和著床前胚胎發(fā)育等關鍵事件[3]。同時，ZP限制了不同物種精子和卵母細胞之間的相互作用[4]，并防止人類卵母細胞與多個精子融合[5]。

人類ZP由4種糖蛋白ZP1、ZP2、ZP3和ZP4組成[6-8]。ZP1是其中含量最少的一種，但它保證了ZP結構的完整性。在ZP的形成過程中，ZP1通過交聯(lián)由ZP2、ZP3和ZP4交替組成的長絲鏈發(fā)揮關鍵作用[9-10]。ZP1突變患者所獲卵母細胞缺乏ZP，或者得到退化或破裂的卵母細胞[11-12]。

ZP2和ZP3作為精子受體參與受精過程，精子進入ZP后，首先與ZP3結合引發(fā)頂體反應，然后與ZP2結合，獲得穿透ZP的能力。有研究報道，缺乏ZP2蛋白會導致ZP在配子識別方面的異常[13]。動物實驗則發(fā)現(xiàn)，缺乏ZP2和ZP3的小鼠產(chǎn)生的卵母細胞沒有ZP，雌性小鼠完全不孕[14-15]。曾有研究者發(fā)現(xiàn)1名原發(fā)性不孕癥患者的ZP2和ZP3基因存在雜合突變，獲得的卵母細胞ZP很薄或缺失[16]。本例患者3個周期共獲卵10枚，其中6枚為不完整的ZP，印證了P?kkyl?等[17]的研究，即ZP2和ZP3編碼基因的序列變異可能與ZP形態(tài)異常有關。另有研究報道ZP3中的雜合子錯義突變阻礙了ZP2和ZP3之間的相互作用，導致卵母細胞變性和空卵泡綜合征[18]。ZP3在生發(fā)泡破裂中也可能起到一定作用[19]。

ZP4在體內(nèi)受精過程中并不起重要作用，但它的結構和機械功能是在著床前保護胚胎的基礎。ZP4切除會損害雌性兔子的生育能力[20]。

人類ZP3基因位于7號染色體上，編碼424個氨基酸的多肽。本例患者ZP3基因新發(fā)雜合變異，使ZP3的第7外顯子發(fā)生移碼變異，第349位氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榱涟彼?Leu)，其后的序列發(fā)生改變，經(jīng)兩個氨基酸后提前終止，查詢文獻尚未見同一位置變異的報道。本例患者獲得的卵冠丘復合物脫顆粒后多為不完整的ZP，沒有正常卵母細胞質(zhì)結構，無法受精，可能原因是ZP3基因雜合變異導致ZP形態(tài)異常，影響卵母細胞生長發(fā)育，最終導致卵母細胞退化崩解。經(jīng)過多周期促排卵治療，患者最終獲得兩枚可用胚胎，凍融周期移植后雙胎活產(chǎn)。

綜上，在臨床中遇到尋求ART治療的不孕癥患者，如果多次發(fā)現(xiàn)ZP異常，建議進行ZP基因測序。但本文僅為個案報道，可能提示ZP的異常形態(tài)、基因的變異與女性不孕癥存在某種關聯(lián)，后續(xù)尚需要更多的研究加以驗證。