DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠中高雄激素對(duì)肝細(xì)胞凋亡影響的初步探索

張婷婷，高慧民，谷牧青，劉瑞霞，李天鶴，陰赪宏

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性最常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率為5%～20%，以高雄激素血癥、排卵功能障礙和卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕R床特征，并可伴有多毛癥、凝血功能異常、代謝功能異常等表現(xiàn)[1-2]。由于代謝功能異常，大多數(shù)PCOS患者會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗(IR)或代謝綜合征的表現(xiàn)，如肥胖、血脂異常、高血壓、高胰島素血癥和血糖失調(diào)[3-4]。近年來(lái)，已有多項(xiàng)研究證明，PCOS患者中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)生率明顯高于普通人群[5-7]，且高雄激素血癥、肥胖、IR和高胰島素血癥同樣可促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展[8-10]。所以，NAFLD和PCOS分別被認(rèn)為是代謝綜合征累及肝臟、卵巢的表現(xiàn)。鑒于兩者發(fā)病機(jī)制相似且具有高度的臨床相關(guān)性，有專(zhuān)家由此提出“肝-卵巢軸”的概念[11]，提示我們PCOS患者肝臟受損可能與其PCOS疾病本身有關(guān)。但是在PCOS動(dòng)物模型，特別是脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型中，肝功能的變化以及影響因素尚不明確。

細(xì)胞凋亡是一種在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞死亡途徑，正常情況下，在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮適當(dāng)剔除細(xì)胞和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用[12]，當(dāng)細(xì)胞凋亡過(guò)程調(diào)節(jié)障礙時(shí)，可導(dǎo)致體內(nèi)多種疾病的發(fā)生[13]。肝細(xì)胞凋亡與各種肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化、肝癌以及NAFLD之間的關(guān)系日益受到關(guān)注。人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡是肝臟常見(jiàn)疾病細(xì)胞死亡的常規(guī)模式[14]。Beclin-1和Lamin B1蛋白與細(xì)胞凋亡聯(lián)系緊密。當(dāng)細(xì)胞生存環(huán)境發(fā)生缺乏生長(zhǎng)因子或饑餓等異常變化時(shí)，Beclin-1蛋白可被激活并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[15]。Lamin B1蛋白可作為Caspase-6的特異性天然作用底物，與其共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[16]。

因此，本研究利用DHEA構(gòu)建PCOS大鼠模型，通過(guò)分析PCOS大鼠內(nèi)分泌代謝水平、血清生化水平、肝臟組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)蛋白的變化，初步了解PCOS大鼠模型中肝細(xì)胞凋亡在肝臟損傷過(guò)程中所起的作用，以期為今后PCOS相關(guān)疾病的研究提供一定參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡SD雌性大鼠20只，購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)在譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0002。SPF級(jí)屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，溫度為24～26℃，濕度為50%～70%，光照黑暗時(shí)間比為12 h/12 h，常規(guī)食水飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作流程符合美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和道德規(guī)定。

二、主要試劑和儀器

DHEA(D8950，北京索萊寶科技)，睪酮(MC12987)、雌二醇(MC12312)、黃體生成素(MC12403)、卵泡刺激素(MC12313)的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京美辰聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Beclin-1、Lamin B1及β-tublin兔源單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，甲醇(北京化工廠)，4%多聚甲醛(G1101，武漢賽維爾生物科技)，瑞氏染色液(S7030，北京酷來(lái)博科技)；顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)，胰島素耐量的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估使用Accu-Chek’O血糖儀(羅氏，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Spark 10M，Tecan，瑞士)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：選取3周齡SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DHEA組，每組10只，參照之前文獻(xiàn)方法[17]，分別給予頸部皮下注射油劑、6 mg/100 g DHEA，1次/d，連續(xù)注射21 d。造模第22天，將兩組大鼠各分為處死取材和動(dòng)情周期觀察兩部分，每組7只大鼠處死并取材，每組3只大鼠繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)情周期觀察。每7 d稱(chēng)量一次大鼠體重。

2.取材：大鼠造模第22天，將大鼠麻醉，股動(dòng)脈取血并分離血清待測(cè)。頸椎脫臼法處死大鼠后，將新鮮的卵巢和肝臟組織固定于4%多聚甲醛，24 h后用于HE染色和Masson染色。

3.大鼠動(dòng)情周期觀察：參照文獻(xiàn)方法[18]，從大鼠給藥第22天開(kāi)始，每天上午8∶00～10∶00進(jìn)行陰道涂片檢查(連續(xù)8 d)：將無(wú)菌棉簽在生理鹽水中浸濕后，放入大鼠陰道側(cè)璧的前1/3處順時(shí)針?lè)较蛲磕ㄒ恢?，取出棉簽后沿同一方向涂抹到玻片上，瑞氏法染色后，鏡檢。動(dòng)情前期涂片特征：絕大部分是小、圓的有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；動(dòng)情期：大部分是無(wú)核、不規(guī)則的角化細(xì)胞，間有少量上皮細(xì)胞；動(dòng)情后期：有核細(xì)胞、角化細(xì)胞、白細(xì)胞均有；動(dòng)情間期：出現(xiàn)大量白細(xì)胞和少量的上皮細(xì)胞。大鼠如失去規(guī)律的動(dòng)情周期，或持續(xù)處于動(dòng)情間期，則提示無(wú)排卵。

4.大鼠血清生殖激素水平檢測(cè)：取各組血清按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)含量，用酶標(biāo)儀(Spark 10 M，Tecan，瑞士)于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)其OD值。

5.大鼠血清生化檢測(cè)：取各組血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)AST、ALT含量，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)510 nm下檢測(cè)其OD值；取各組血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ALP含量，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm下檢測(cè)其OD值。

6.HE染色：將取到的兩組卵巢和肝臟組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后再普通光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄染色結(jié)果。

7.Masson染色：將取到的兩組肝臟組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片、透明、脫水、染色和封片。Masson染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄肝臟組織纖維化程度。每次實(shí)驗(yàn)中每組選取3～4只大鼠，每次實(shí)驗(yàn)任意選取3～4張切片。

8.蛋白質(zhì)印跡法(WB)測(cè)定肝臟組織蛋白表達(dá)變化：取正常對(duì)照組、DHEA組肝臟組織，用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度。等量的蛋白利用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入 Beclin-1、Lamin B1的一抗(1∶2 000稀釋)中，4℃孵育過(guò)夜；次日，回收一抗后，洗膜3次，分別加入山羊抗兔的二抗(1∶5 000稀釋)中，室溫孵育2 h，洗膜3次，將膜置于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測(cè)試劑中，凝膠成像系統(tǒng)顯影。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照β-tublin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠動(dòng)情周期情況及卵巢病理學(xué)變化

利用6 mg/100 g DHEA注射油針劑連續(xù)頸部皮下給藥21 d后，連續(xù)8 d取陰道細(xì)胞進(jìn)行涂片及鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)動(dòng)情前期時(shí)存在小、圓、有核鱗狀上皮細(xì)胞；動(dòng)情期時(shí)存在不規(guī)則(角質(zhì)化)鱗狀上皮細(xì)胞；動(dòng)情后期和動(dòng)情間期時(shí)存在白細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞和圓上皮細(xì)胞。且陰道涂片結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠具有規(guī)律性動(dòng)情周期，而DHEA組大鼠動(dòng)情周期失調(diào)，大部分時(shí)間處于動(dòng)情前期和動(dòng)情后期，提示無(wú)排卵(圖1)。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠卵巢組織鏡下可觀察到3個(gè)正常黃體和處于不同時(shí)期的多個(gè)正常卵泡，而DHEA組大鼠鏡下未觀察到黃體，且觀察到3個(gè)囊性卵泡(圖2)。說(shuō)明DHEA組大鼠卵巢組織發(fā)生多囊樣改變且效果顯著，PCOS大鼠模型構(gòu)建成功。

圖示分別為兩組內(nèi)某大鼠連續(xù)8 d陰道涂片檢查結(jié)果：紅色箭頭示不規(guī)則角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞；藍(lán)色箭頭示有核鱗狀上皮細(xì)胞圖1 兩組大鼠的陰道涂片結(jié)果(瑞氏染色，×10)

#示黃體；*示囊狀卵泡圖2 兩組大鼠的卵巢結(jié)構(gòu)(HE染色，×10)

二、兩組大鼠血清生殖激素水平比較

收集大鼠空腹血清，利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中生殖激素水平。結(jié)果顯示，DHEA組大鼠血清中T值[(28.65±6.31)nmol/L]顯著高于對(duì)照組大鼠[(0.40±0.29)nmol/L](P=0.001)，而兩組大鼠的FSH、LH和E2水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組大鼠血清生殖激素水平比較(-±s)

三、兩組大鼠體重及胰島素抵抗能力的比較

連續(xù)給藥期間，兩組大鼠體重比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3A、B)。利用胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)檢測(cè)大鼠胰島素抵抗情況，結(jié)果顯示，DHEA組在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min的血糖值均略高于對(duì)照組，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3C)；DHEA組ITT的曲線(xiàn)下面積(AUC)顯著大于對(duì)照組(P=0.031)(圖3D)。表明PCOS大鼠較對(duì)照組葡萄糖清除能力下降，對(duì)胰島素的敏感性降低。

A：兩組大鼠體重變化的比較；B：處死前兩組大鼠體重的比較；C：兩組大鼠ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較；D：兩組大鼠ITT的AUC比較。與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 兩組大鼠體重及葡萄糖清除能力的比較

四、兩組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)及纖維化程度比較

兩組大鼠肝臟的大體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4A。與對(duì)照組相比，DHEA組大鼠肝臟重量、肝臟/體重比顯著增加(P=0.001)(圖4B、C)，提示肝臟腫大。利用HE染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞核大小正常，核質(zhì)淡染，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索放射狀分布于中央靜脈周?chē)?；DHEA組大鼠肝細(xì)胞間結(jié)構(gòu)疏松，染色變淺可見(jiàn)少量脂滴形成，中央靜脈周?chē)猩倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)(圖4D)。利用Masson染色觀察肝纖維變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝臟中央靜脈和匯管區(qū)無(wú)膠原纖維，DHEA組大鼠肝臟中央靜脈周?chē)霈F(xiàn)少量藍(lán)色膠原纖維(圖4E)。

進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)血清ALT、AST、ALP水平來(lái)評(píng)估兩組大鼠的肝功能，結(jié)果顯示，DHEA組大鼠血清ALT水平顯著高于對(duì)照組(P=0.042)。兩組大鼠血清AST、ALP水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

A：兩組大鼠肝臟外形比較；B：兩組大鼠肝臟重量/體重比較；C：兩組大鼠肝臟重量比較；D：兩組大鼠HE染色比較(HE染色，×10)；E：兩組大鼠Masson染色比較(Masson染色，×10)。與對(duì)照組比較，*P<0.01 圖4 兩組大鼠肝臟組織的重量及結(jié)構(gòu)比較

表2 兩組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較(-±s)

五、兩組大鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)分析

應(yīng)用WB檢測(cè)兩組大鼠肝臟組織中的凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1和Lamin B1，結(jié)果顯示，DHEA組大鼠Beclin-1和Lamin B1蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P=0.001；P=0.002)(圖5)。

A：對(duì)照組；B：DHEA組。與對(duì)照組比較，*P<0.01圖5 兩組大鼠肝臟組織中Beclin-1和Lamin B1蛋白的表達(dá)

六、ALT、AST、ALP水平與T值的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探索PCOS肝損傷的原因，利用Pearson相關(guān)性分析血清T值與轉(zhuǎn)氨酶之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，ALT與T值之間存在顯著正相關(guān)(r=0.606)；AST與T值之間存在正相關(guān)，但相關(guān)程度較弱(r=0.112)；ALP與T值之間存在負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性極弱(r=-0.108)(表3)。

表3 ALT、AST、ALP水平與T值的相關(guān)性分析

討 論

已有多項(xiàng)研究證實(shí)，在PCOS患者中NAFLD的發(fā)病率較高，可達(dá)34%～70%，而NAFLD在一般人群中的發(fā)病率僅為14%～34%[7-9，19]。在長(zhǎng)期來(lái)曲唑處理的PCOS大鼠中，雄激素增加可引發(fā)肝功能損傷[20]。我們的研究在DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠中證實(shí)，高雄激素血癥是導(dǎo)致DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型中肝損傷的重要誘因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，DHEA組大鼠血清T水平顯著升高(P=0.001)，而兩組大鼠的FSH、LH和E2水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。這表明，DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠血清中T值升高為其主要的性激素變化特征。同時(shí) DHEA組大鼠血清ALT水平顯著高于對(duì)照組(P=0.042)，提示PCOS大鼠肝功能不全。肝臟HE染色和Masson染色顯示PCOS大鼠肝臟結(jié)構(gòu)受損，有炎癥性改變和纖維化形成；且DHEA組大鼠ALT與T值具有顯著相關(guān)性(r=0.606)，表明高雄激素血癥可導(dǎo)致PCOS大鼠肝功能障礙。

研究表明，高雄激素血癥PCOS患者的肝臟脂肪含量高于雄激素正常的PCOS患者[21]。但目前為止，PCOS患者中高雄激素血癥是如何影響NAFLD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。有報(bào)道推測(cè)，高雄激素血癥可直接影響肝臟中的低密度脂蛋白受體，從而使PCOS患者更易發(fā)生血脂異常和NAFLD[22]。此外，雄激素也可能直接影響脂肪因子的產(chǎn)生，從而參與PCOS的代謝改變[23]。同時(shí)，也有研究表明與單純NAFLD患者相比，PCOS伴有NAFLD患者血清中的特異性凋亡標(biāo)記物M30水平顯著升高[24]，這提示我們PCOS 患者的肝臟損傷可能是由于高雄激素血癥通過(guò)促進(jìn)其凋亡途徑而發(fā)生發(fā)展?；诖?，我們研究了PCOS大鼠肝臟組織凋亡蛋白Beclin-1和Lamin B1的表達(dá)量。Beclin-1基因也稱(chēng)BECN1基因，是酵母自噬相關(guān)基因At96/Vps30的哺乳動(dòng)物同源基因，位于人類(lèi)染色體17q21位點(diǎn)。Beclin-1基因可通過(guò)其BH3結(jié)構(gòu)域與凋亡抑制因子Bcl-2蛋白結(jié)合，使Bcl-2與促凋亡蛋白Bax解離，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。核纖層蛋白是核纖層的關(guān)鍵形成部分之一，而核纖層則對(duì)維持細(xì)胞核形態(tài)有關(guān)鍵作用[16]。Lamin B1是一類(lèi)細(xì)絲狀多肽，也核纖層蛋白的成分之一，在維持核仁的完整性和可塑性上起重要作用，其又作為Caspase-6的特異性天然作用底物可在酶切后改變其結(jié)構(gòu)，可共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[25]。我們的研究結(jié)果顯示，PCOS大鼠肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1和Lamin B1蛋白的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，提示PCOS大鼠肝臟組織凋亡增加。據(jù)此，我們推測(cè)在PCOS大鼠肝臟受損過(guò)程中，肝細(xì)胞存在凋亡過(guò)程且可能是由于PCOS大鼠中高雄激素血癥所致。

綜上所述，本研究利用DHEA構(gòu)建PCOS大鼠模型，通過(guò)分析PCOS大鼠內(nèi)分泌代謝水平、血清生化水平、肝臟組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)蛋白的變化，研究結(jié)果表明PCOS大鼠模型中肝細(xì)胞凋亡在肝臟損傷過(guò)程中起到一定的作用，并推測(cè)其可能是由于高雄激素水平所致。本研究為今后PCOS相關(guān)疾病的研究和診療提供了一定參考。