• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    我國斑點熱立克次體感染與免疫的實驗研究

    2016-01-31 01:26:14熊小路溫博海
    中國人獸共患病學報 2016年10期
    關(guān)鍵詞:立克次體保護性黑龍江

    熊小路,焦 俊,溫博海

    ?

    我國斑點熱立克次體感染與免疫的實驗研究

    熊小路,焦 俊,溫博海

    研究證明黑龍江立克次體能夠感染人血管內(nèi)皮細胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血癥和器官損傷;全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體毒力相關(guān)基因。表面蛋白質(zhì)組分析鑒定了黑龍江立克次體和立氏立克次體的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,發(fā)現(xiàn)某些表面蛋白為保護性抗原,并揭示這些保護性抗原均能夠誘導抗原特異CD4+和CD8+T細胞增殖并產(chǎn)生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及誘導高水平特異性IgG2a產(chǎn)生,在這些免疫因素的協(xié)同作用下使小鼠有效抵抗立克次體感染。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達或低表達人血管內(nèi)皮細胞以及Tim-3高表達轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)果有力證明Tim-3高表達能夠促進人血管內(nèi)皮細胞和小鼠抵抗黑龍江立克次體感染。

    斑點熱立克次體;感染;免疫;保護性抗原

    斑點熱立克次體通過“拉鏈式 (zipper-like)”入侵機制侵入非專業(yè)吞噬細胞(如血管內(nèi)皮細胞)[1]。“拉鏈式”入侵是一種受體介導的入侵機制,立克次體表面配體蛋白與宿主細胞表面受體結(jié)合后誘導宿主細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。這些細胞內(nèi)信號分子在立克次體與宿主細胞相互作用部位募集肌動蛋白并重構(gòu)宿主細胞骨架,最終在立克次體周圍形成膜“拉鏈”。基于斑點熱立克次體“拉鏈式”入侵宿主細胞機制和專性胞內(nèi)寄生方式;斑點熱立克次體表面蛋白可以在立克次體的感染與免疫中發(fā)揮重要作用,比如介導立克次體粘附和入侵宿主細胞、促進立克次體在細胞內(nèi)生長繁殖以及誘導機體的免疫應(yīng)答等[1]。近幾年來,我國學者對在我國黑龍江立克次體和立克次體中毒力最強的立氏立克次體在感染與免疫方面開展了系列實驗研究。

    1 黑龍江立克次體的致病性

    黑龍江立克次體是1982年由我國學者婁丹等分離的斑點熱立克次體新種[2]。研究人員用黑龍江立克次體感染人血管內(nèi)皮細胞和小鼠,發(fā)現(xiàn)它與其它斑點熱立克次體相似的致病特征。同時測定黑龍江立克次體全基因組序列,通過全基因組序列的比較分析,發(fā)現(xiàn)它的毒力相關(guān)基因。這些研究證明黑龍江立克次體為毒力較強致病菌。

    1.1 感染人血管內(nèi)皮細胞 孟艷芬等[3]將人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞分離,培養(yǎng)出人血管內(nèi)皮細胞,并用純化黑龍江立克次體體外感染血管內(nèi)皮細胞。感染后1~3 d,免疫熒光染色可見立克次體存在于細胞胞質(zhì)中,以游離狀態(tài)分散于胞質(zhì)內(nèi),菌體外周有一層電子密度低的“環(huán)帶”將立克次體與宿主細胞胞質(zhì)分隔開。第5~9 d,立克次體在內(nèi)皮細胞以二分裂方式快速增殖,立克次體數(shù)量急劇增加,并且細胞核內(nèi)出現(xiàn)立克次體。被立克次體感染細胞的胞膜形成突觸,相鄰細胞胞膜凹陷將立克次體攝入胞質(zhì)。感染后第10 d,內(nèi)皮細胞由梭形貼壁伸展生長逐漸呈瘦長形,胞質(zhì)內(nèi)充滿立克次體,細胞核內(nèi)立克次體亦有增多。感染后第12 d,大部分內(nèi)皮細胞變圓脫落;檢查脫落內(nèi)皮細胞,可見細胞內(nèi)有大量立克次體。細胞培養(yǎng)上清中也有大量立克次體,這是由于立克次體大量繁殖致細胞裂解后立克次體釋放到上清中。

    1.2 感染BALB/c小鼠 段長松等[4]采用眼眶靜脈叢注射將黑龍江立克次體感染BALB/c小鼠,定量PCR檢測感染小鼠血液和肝、脾、肺、腦等主要器官中立克次體DNA拷貝數(shù)。感染后第1 d檢出少量立克次體,第3 d立克次體載量顯著增長,第6 d達到頂峰,第9 d立克次體載量顯著下降。該結(jié)果證明黑龍江立克次體能夠在BALB/c小鼠體內(nèi)建立有效的感染。另外,黑龍江立克次體感染第6 d,小鼠肺和腦組織中檢出高水平的立克次體DNA,說明立克次體擴散到了肺和腦這兩個重要的器官,肺和腦損傷是立克次體感染致死的最重要原因。

    黑龍江立克次體感染第1、3 d,小鼠的肝、脾、肺、腦組織沒有明顯病理改變。感染后第6 d,小鼠的肝、肺、腦組織出現(xiàn)明顯病理損傷:肝組織出現(xiàn)單核細胞炎性浸潤和匯管區(qū)多型核白細胞聚集以及肝細胞輕微溶脹,肺組織出現(xiàn)單個核細胞浸潤為特征的間質(zhì)性肺炎和肺泡壁增厚,腦實質(zhì)出現(xiàn)微出血點[4]。

    黑龍江立克次體感染第3 d,小鼠肝、脾、肺、腦等主要器官中的IFN-γ、TNF-α和趨化因子RANTES的表達均顯著上調(diào),說明小鼠啟動天然免疫應(yīng)答,但是器官的立克次體DNA拷貝數(shù)仍然在增加,說明天然免疫作用還比較弱,并不能有效抑制立克次體感染[4]。研究中發(fā)現(xiàn)促炎性因子IFN-γ和TNF-α的表達顯著上調(diào)與立克次體感染小鼠器官組織的炎性損傷密切相關(guān)。隨著這兩種炎性因子在器官組織中表達顯著下調(diào),感染小鼠的器官組織損傷程度也顯著減輕。

    1.3 全基因組序列分析毒力相關(guān)基因 段長松等[5-6]對黑龍江立克次體做全基因組測序,獲得一個全長1 278 471 bp的環(huán)狀基因組,該基因組含有1 333個基因,其中編碼蛋白質(zhì)的基因1 297個。將預(yù)測蛋白與毒力因子數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體有266個潛在的毒力相關(guān)蛋白,16個編碼IV型分泌系統(tǒng)蛋白。該基因組有一個基因組島,全長3 732 bp,包括7個蛋白基因。其中兩個基因編碼已知功能蛋白:一個為IV型分泌系統(tǒng)蛋白VirB1類似物,另一個為轉(zhuǎn)座酶類似物。

    段長松等[6]收集了立克次體屬的43株立克次體的全基因組序列,將這些序列使用統(tǒng)一注釋系統(tǒng)進行注釋,以去除不同注釋標準帶來的差異。分析這些統(tǒng)一注釋的全基因組序列,發(fā)現(xiàn)立克次體泛基因組含有4 737個基因,其中核心基因組有693個基因。將黑龍江立克次體與立氏立克次體強毒株(Sheila Smith)和弱毒株(Iowa)做直系同源ORF比較,發(fā)現(xiàn)它們共享983個直系同源ORF,黑龍江立克次體獨有481個ORF。值得注意的是:黑龍江立克次體與立氏立克次體強毒株共享37個直系同源ORF,這些ORF為立氏立克次體弱毒株所缺失,提示這37個基因可能與黑龍江立克次體毒力密切相關(guān)[6]。

    2 表面蛋白分離鑒定和發(fā)現(xiàn)新保護性抗原

    2.1 表面蛋白分離鑒定 國外學者[7]采用免疫印跡和分子克隆等技術(shù),先后鑒定了外膜蛋白(Omp)A、OmpB、Sac1、Sac2、Adr1、Adr2等斑點熱立克次體表面蛋白,并證明這些表面蛋白與斑點熱立克次體的感染與免疫密切相關(guān)[1]。齊永等[8]采用膜不通透的生物素標記黑龍江立克次體表面蛋白,并用鏈親和素親和層析分離生物素標記的表面蛋白,再將層析分離的表面蛋白做等電聚焦和SDS-PAGE雙向電泳,最后用串聯(lián)質(zhì)譜對電泳分離的表面蛋白進行鑒定,結(jié)果鑒定出黑龍江立克次體的25種表面蛋白。用立克次體感染小鼠血清和患者血清分析黑龍江立克次體重組表面蛋白芯片,發(fā)現(xiàn)多數(shù)表面蛋白為血清學反應(yīng)陽性,其中OmpA-2、OmpB-3、RpsB、SdhB等表面蛋白具有與黑龍江立克次體感染血清反應(yīng)的特異性[9]。

    龔文平等[10]采用同樣方法,鑒定了立氏立克次體的10種表面蛋白。除OmpA、OmpB、GroEL、GroES、DNA-binding protein等5個蛋白在國外已經(jīng)確認存在立氏立克次體表面外,Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC等為首次鑒定的立氏立克次體表面蛋白。采用免疫電鏡對這5種新鑒定的表面蛋白做亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)Porin_4蛋白主要集中在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)膜,其余的4種蛋白在細胞內(nèi)、外膜均有分布[10]。這些表面蛋白在細胞膜上呈點狀分布而非散在分布,這可能與其特殊的功能相關(guān),比如吸附、運動、分子的結(jié)合及運輸?shù)取?/p>

    2.2 保護性表面蛋白抗原的鑒定 國外學者[11]已經(jīng)明確的斑點熱立克次體保護性抗原僅有為OmpA和OmpB。龔文平等[10]將立氏立克次體新發(fā)現(xiàn)表面蛋白的重組蛋白免疫小鼠,用立氏立克次體攻擊免疫小鼠,最后用定量PCR檢測小鼠主要器官的立克次體載量。結(jié)果顯示Adr1、Adr2免疫小鼠的肝臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠;Adr2免疫小鼠的脾臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠;Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫小鼠的肺臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠。與此相反,TolC免疫小鼠的這些器官的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異[10,12]。肺為立克次體感染主要器官,Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫能夠顯著減少小鼠肺部立克次體的載量,證明它們有良好的免疫保護性,為立氏立克次體保護性抗原。

    齊永等[13]將黑龍江立克次體重組表面蛋白YbgF和PrsA分別免疫小鼠,再用黑龍江立克次體攻擊免疫小鼠。定量PCR檢測結(jié)果顯示YbgF免疫小鼠的立克次體載量顯著性低于PrsA免疫小鼠,而PrsA免疫小鼠的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異,證明YbgF為保護性抗原。龔文平等[14]隨后也證明立氏立克次體YbgF也能誘導小鼠有效對抗立氏立克次體感染。另外,他還發(fā)現(xiàn)立氏立克次體外膜蛋白B片段OmpB-4與Adr2聯(lián)合免疫,它們誘導的特異性免疫保護效能顯著強于其單獨免疫[15]。另外,他們還發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體全菌抗原與Adr2聯(lián)合免疫能夠顯著增強Adr2的抗立氏立克次體的免疫保護效能[16]。

    3 保護性抗原的免疫保護機制

    3.1 激活樹突狀細胞 孟艷芬等[17]從小鼠骨髓中分離樹突狀細胞(DC)。將黑龍江立克次體4個重組OmpB(OmpB-P1、OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4)刺激DC,24 h后將DC分別腹腔接種小鼠,14 d后用黑龍江立克次體攻擊DC受體小鼠,攻毒7d后用定量PCR檢查小鼠臟器的立克次體載量。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3或OmpB-P4刺激DC的受體小鼠的立克次體載量顯著低于非抗原刺激DC的受體小鼠或OmpB-P1刺激DC的受體小鼠。該結(jié)果提示OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC能誘導小鼠產(chǎn)生抗黑龍江立克次體免疫應(yīng)答,而OmpB-P1激活DC則不能。

    采用磁珠分選技術(shù)將抗原激活DC的受體小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞分離,再將CD4+和CD8+T細胞分別與同源抗原刺激DC在體外相互作用24 h,然后用流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4表達。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3和OmpB-P4激活DC均能誘導CD4+T細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α,其中IFN-γ水平顯著高于OmpB-P1激活DC作用的CD4+T細胞。另外還發(fā)現(xiàn)OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC均能誘導CD8+T細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α,其水平顯著高于OmpB-P1刺激DC作用的CD8+T細胞[17]。這些提示立克次體保護性抗原激活的DC能夠誘導抗原特異的CD4+和 CD8+T細胞高效表達IFN-γ和TNF-α,使它們分別向Th1細胞和Tc1細胞分化,產(chǎn)生有效的特異性細胞免疫應(yīng)答[17]。

    3.2 激活體液免疫應(yīng)答 齊永等[13]比較黑龍江立克次體YbgF和PrsA誘導小鼠的特異性體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)雖然這兩個蛋白都有能力誘導小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體,但是保護性抗原YbgF免疫血清抑制立克次體入侵人血管內(nèi)皮細胞能力顯著強于非保護性抗原PrsA免疫血清。同樣,龔文平等[10,12]發(fā)現(xiàn)立氏立克次體保護性抗原免疫血清能夠顯著抑制立氏立克次體侵入人血管內(nèi)皮細胞。這些結(jié)果提示這些保護性表面蛋白抗原的特異性抗體可以與立克次體表面相應(yīng)抗原結(jié)合,從而阻止其對人血管內(nèi)皮細胞的粘附和入侵。

    國外研究[18]發(fā)現(xiàn)IgG2a抗體的Fc部分可以與補體相互作用并激活巨噬細胞的Fc受體,誘導Fc受體介導的免疫效應(yīng),其中包括激活抗體依賴的細胞毒作用和調(diào)理巨噬細胞的吞噬作用。齊永[13]和龔文平等[12]研究證明這些保護性抗原均能誘導小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG2a,而非保護性抗原則不能。

    3.3 激活細胞免疫應(yīng)答 齊永等[13]發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體保護性抗原YbgF能特異性誘導感染小鼠CD4+T細胞顯著增殖和TNF-α分泌。龔文平等[12]用立氏立克次體保護性抗原Adr2體外刺激立氏立克次體感染小鼠的CD4+T細胞,發(fā)現(xiàn)該CD4+T細胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD4+T細胞。另外,Adr2刺激的感染小鼠CD8+T細胞分泌IFN-γ和IL-6的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD8+T細胞。

    王穎等[19]在體外將人單核細胞轉(zhuǎn)化為樹突狀細胞(HMDCs),發(fā)現(xiàn)保護性抗原激活的HMDCs能夠誘導人CD4+和 CD8+T細胞激活并表達高水平IFN-γ和TNF-α,驅(qū)使CD4+和 CD8+T細胞分別朝著Th1 和 Tc1 極化。熊小路等[20]發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體保護性蛋白抗原的Th1表位肽混合免疫能夠有效激活小鼠CD4+T細胞,誘導小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答對抗貝氏柯克斯體感染,提示保護性抗原的CD4+和CD8+T細胞表位在誘導抗立克次體的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。

    4 Tim-3增強血管內(nèi)皮細胞殺立克次體效能

    T細胞免疫球蛋白和粘附分子-3 (Tim-3)最初被認為是Th1細胞的特異性受體,它通過調(diào)節(jié)Th1細胞的功能,維持免疫平衡和免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也在多種免疫活性細胞表達,包括斑點熱立克次體的宿主細胞—血管內(nèi)皮細胞。

    楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染C3H/HeN小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)立克次體感染3 d內(nèi),小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時間延長而逐漸增加,Tim-3 mRNA表達水平則逐漸下降。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞,立克次體載量與Tim-3 mRNA表達水平也呈負相關(guān)。體內(nèi)、外實驗結(jié)果一致證明Tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答。

    楊小梅等[21]使用小鼠Tim-3胞外段與人IgG1-Fc的融合蛋白阻斷小鼠的Tim-3信號通路。結(jié)果顯示小鼠脾臟的立克次體載量明顯增多,小鼠外周血中抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18)和趨化因子RANTES表達水平明顯下降。該結(jié)果提示,Tim-3信號通路的阻斷能夠抑制宿主的抗立克次體免疫應(yīng)答。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠,感染后第3 d發(fā)現(xiàn)該小鼠無明顯感染表現(xiàn),而野生型對照小鼠的感染則非常明顯,另外Tim-3高表達小鼠的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達能夠增強宿主抗立克次體的免疫應(yīng)答。

    楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染用Tim-3-人IgG1-Fc融合蛋白封閉了Tim信號通路的血管內(nèi)皮細胞,感染3 d后發(fā)現(xiàn)該細胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對照細胞,提示Tim-3信號通路的阻斷能夠降低血管內(nèi)皮細胞殺立克次體的效能。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達或低表達Tim-3的血管內(nèi)皮細胞,3 d后發(fā)現(xiàn)Tim-3高表達細胞的立克次體數(shù)量顯著低于對照細胞,而Tim-3低表達細胞的立克次體數(shù)量顯著高于對照細胞。這些說明Tim-3高表達能夠增強血管內(nèi)皮細胞殺立克次體作用,而抑制Tim-3表達或阻斷Tim-3信號通路則能抑制血管內(nèi)皮細胞的抗立克次體相關(guān)細胞因子和趨化因子的表達,進而降低血管內(nèi)皮細胞殺傷胞內(nèi)立克次體的效能。

    楊小梅等[21]還發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體感染3 d后,無論是阻斷Tim-3信號通路還是降低Tim-3表達的血管內(nèi)皮細胞,其一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達水平和IFN-γ mRNA表達水平顯著下降。國外研究已經(jīng)證明IFN-γ能夠誘導巨噬細胞增加NO合成去殺傷胞內(nèi)菌,因此該結(jié)果提示Tim-3表達下降或Tim-3信號通路阻斷能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的IFN-γ mRNA表達,進而減少iNOS表達和NO合成去降低血管內(nèi)皮細胞殺立克次體的效能。另外,黑龍江立克次體感染3 d后,Tim-3高表達小鼠的脾臟IFN-γ和TNF-α以及iNOS mRNA表達水平均顯著高于野生型小鼠,而脾臟內(nèi)立克次體數(shù)量則顯著低于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達和Tim-3信號通路激活能夠上調(diào)宿主和宿主細胞IFN-γ和TNF-α表達,進而增加iNOS表達和NO合成去殺傷胞內(nèi)、外的立克次體。

    5 結(jié) 語

    近年來,研究證明我國分離的黑龍江立克次體為毒力較強的致病菌,測定了黑龍江立克次體和立氏立克次體表面蛋白質(zhì)組并發(fā)現(xiàn)了新保護性抗原,同時研究證明這些保護性抗原能夠誘導抗原特異CD4+和CD8+T細胞增殖并產(chǎn)生高水平IFN-γ和/或TNF-α,以及誘導高水平特異性IgG2a,在這些免疫因素的協(xié)同作用下使機體能夠有效抵抗立克次體感染。另外,研究首次證明Tim-3高表達和Tim-3信號通路激活能夠增強宿主和宿主細胞—血管內(nèi)皮細胞清除立克次體感染的能力。

    未來將研究表面蛋白在斑點熱立克次體與宿主細胞相互作用中所扮演角色,以及它們對宿主細胞Tim-3信號通路的影響,并鑒定保護性表面蛋白抗原的CD4+和CD8+T細胞表位。通過這些研究,將進一步闡明斑點熱立克次體的分子致病機制,研發(fā)出有效的斑點熱分子疫苗,并為斑點熱的治療提供新思路。

    [1] Chan YG, Riley SP, Martinez JJ. Adherence to and invasion of host cells by spotted fever group rickettsia species[J]. Front Microbiol, 2010, 1: 139.

    [2] Lou D, Wu YM, Wang B, et al. The isolation and identification of Rickettsia heilongjiangensis, a new member of spotted fever group[J]. Chin J Microbiol Immunol,1985, 7(5): 250-253. (in Chinese)

    婁丹,吳益民,王冰,等. 斑點熱立克次體的一個新成員—黑龍江立克次體分離鑒定[J].中華微生物學和免疫學雜志,1985,7(5):250-253.

    [3] Meng YF, Duan CS, Wang XL, et al. Primary study onRickettsiaheilongjiangensisinfection of vascular endothelial cells[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(6): 6-10. (in Chinese)

    孟艷芬, 段長松, 王錫樂,等. 黑龍江立克次體感染血管內(nèi)皮細胞的初步研究[J]. 中國人獸共患病學報. 2011,27(6): 6-10.

    [4] Duan C, Meng Y, Wang X, et al. Exploratory study on pathogenesis of far-eastern spotted fever[J]. Am J Trop Med Hyg, 2011, 85(3): 504-509.

    [5] Duan C, Tong Y, Huang Y, et al. Complete genome sequence ofRickettsiaheilongjiangensis, an emerging tick-transmitted human pathogen[J]. J Bacteriol, 2011, 193(19): 5564-5565.

    [6] Duan C, Xiong X, Qi Y, et al. Genomic and comparative genomic analyses ofRickettsiaheilongjiangensisprovide insight into its evolution and pathogenesis[J]. Infect Genet Evolut, 2014, 26: 274-282.

    [7] Renesto P, Samson L, Ogata H, et al. Identification of two putative rickettsial adhensins by proteomic analysis[J]. Res Microbiol, 2006, 157, 7: 605-612.

    [8] Qi Y, Xiong X, Wang X, et al. Proteome analysis and serological characterization of surface-exposed proteins ofRickettsiaheilongjiangensis[J]. PLoS ONE, 2013, 8(7): e70440.

    [9] Qi Y, Gong Y, Xiong X, et al. Microarray of surface-exposed proteins of rickettsia heilongjiangensis for serodiagnosis of Far-eastern spotted fever[J]. BMC Infect Dis, 2014, 14: 332.

    [10] Gong W, Xiong X, Qi Y, et al. Identification of novel surface-exposed proteins ofRickettsiarickettsiiby affinity purification and proteomics[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e100253.

    [11] Feng HM, Whitworth T, Olano JP, et al. Fc-dependent polyclonal antibodies and antibodies to outer membrane proteins A and B, but not to lipopolysaccharide, protect SCID mice against fatalRicketssiaconoriiinfection[J]. Infect Immun, 2004, 72(4): 2222-2228.

    [12] Gong W, Xiong X, Qi Yong, et al. Surface protein Adr2 ofRickettsiarickettsiiinduced protective immunity against Rocky Mountain spotted fever in C3H/HeN mice[J]. Vaccine, 2014, 32: 2027-2033

    [13] Qi Y, Xiong X, Duan C, et al. Recombinant protein YbgF induces protective immunity againstRickettsiaheilongjiangensisinfection in C3H/HeN mice[J]. Vaccine, 2013, 31: 5643-5650

    [14] Gong W, Qi Yong, Xiong X, et al. TheRickettsiarickettsiiouter membrane protein YbgF induces protective immunity in C3H/HeN mice[J]. Human Vaccines Immunotherapeutics, 2015, 11(3): 642-649.

    [15] Gong W, Wang P, Xiong X, et al. Enhanced protection againstRickettsiarickettsiiinfection in C3H/HeN mice by immunization with a combination of a recombinant adhesin rAdr2 and a protein fragment rOmpB-4 derived from outer membrane protein B[J]. Vaccine, 2015, 33: 985-992.

    [16] Gong W, Wang P, Xiong X, et al. Chloroform-methanol residue ofCoxiellaburnetiimarkedly potentiated the specific immunoprotection elicited by a recombinant protein fragment rOmpB-4 derived from outer membrane protein B ofRickettsiarickettsiiin C3H/HeN mice[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0124664.

    [17] Meng Y, Xiong X, Qi Y, et al. Protective immunity againstRickettsiaheilongjiangensisin a C3H/HeN mouse model mediated by outer membrane protein B-pulsed dendritic cells[J]. Sci China Life Sci, 2015, 58(3): 287-296.

    [18] Mansueto P, Vitale G, Cascio A, et al. New insight into immunity and immunopathology of rickettsial diseases, clinical and developmental immunology[J]. Clin Dev Immunol, 2012, 2012: 967852.

    [19] Wang Y, Xiong X, Wu D, et al. Efficient activation of T cells by human monocyte-derived dendritic cells (HMDCs) pulsed withCoxiellaburnetiiouter membrane protein Com1 but not by HspB-pulsed HMDCs[J]. BMC Immunol, 2011, 12: 52.

    [20] Xiong X, Qi Y, Gong W, et al. Exploratory study on Th1 epitope-induced protective immunity againstCoxiellaburnetiiinfection[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e87206.

    [21] Yang X, Jiao J, Han J, et al. Enhanced expression of T-cell immunoglobulin and mucin domain protein 3 in endothelial cells facilitates intracellular killing ofRickettsiaheilongjiangensis[J]. J Infect Dis, 2016, 213: 71-79.

    Experimental studies on infection and immunity of spotted fever group rickettsiae in China

    XIONG Xiao-lu, JIAO Jun, WEN Bo-hai

    (StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

    Studies showed thatRickettsiaheilongjiangensiscould infect human vascular endothelial cells (ECs) and BALB/c mice, causing bacteremia and organ damage in mice; whole genomic sequence assay revealed the virulence-associated genes ofR.heilongjiangensis. The study of surface proteome identified the surface proteins ofR.heilongjiangensisandR.rickettsii. By immunization of C3H/HeN mice with the surface proteins, several protective antigens were determined, which could efficiently induce proliferation and secretion of IFN-γ and/or TNF-α of in CD4+and CD8+T cells and elicited production of IgG2a in B cells, by which, the rickettsial organisms were eradicated in mice. We usedR.heilongjiangensisto infect ECs with low expression of Tim-3 and overexpressed Tim-3 or mice with overexpressed Tim-3, our results strongly demonstrated that enhanced Tim-3 expression could inhibit rickettsial growth, bothinvivoin mice andinvitroin ECs.

    spotted fever group rickettsiae; infection; immunity; protective antigen

    Wen Bo-hai, Email: bohaiwen@sohu.com

    10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.013

    國家自然科學基金(No.31470894)

    溫博海,Email: bohaiwen@sohu.com

    軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所,病原生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071

    R376

    A

    1002-2694(2016)10-0917-05

    2016-05-09;

    2016-08-17

    Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31470894)

    猜你喜歡
    立克次體保護性黑龍江
    “擼貓”需當心感染立克次體
    中老年保健(2021年4期)2021-12-01 11:19:40
    Homeless children in India publish newspaper
    Write a caption
    寧夏保護性耕作的必要性及技術(shù)模式探討
    保護性開發(fā)利用高鋁煤炭資源的必要性及相關(guān)建議
    黑龍江棄風博弈
    能源(2016年1期)2016-12-01 05:10:04
    玉米保護性耕作的技術(shù)要領(lǐng)
    立克次體與立克次體病的檢測與鑒定
    保護性耕作機具選型中注意事項
    新發(fā)蜱傳病原體
    ——勞氏立克次體的研究現(xiàn)狀
    日韩大码丰满熟妇| 在线播放国产精品三级| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成人av一区二区三区在线看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一夜夜www| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 99国产精品一区二区三区| 午夜视频精品福利| 精品少妇黑人巨大在线播放| 高清毛片免费观看视频网站 | cao死你这个sao货| 国产激情久久老熟女| 美女福利国产在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久毛片免费看一区二区三区| 男女免费视频国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品国产国语对白av| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久国内视频| 欧美大码av| 精品福利观看| 国产欧美日韩一区二区三| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产成人欧美在线观看 | 丁香六月天网| 精品国产乱码久久久久久男人| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产亚洲精品一区二区www | 99国产精品一区二区蜜桃av | 在线 av 中文字幕| 国产高清激情床上av| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91大片在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 满18在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| av又黄又爽大尺度在线免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久久久久久久久久大奶| 2018国产大陆天天弄谢| 成年版毛片免费区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 黄色视频,在线免费观看| 午夜老司机福利片| 日日爽夜夜爽网站| 免费看a级黄色片| 久久国产精品大桥未久av| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕高清在线视频| 在线观看人妻少妇| a级毛片在线看网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| www日本在线高清视频| videos熟女内射| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人三级做爰电影| 在线观看免费视频日本深夜| 宅男免费午夜| 久久香蕉激情| 中文字幕最新亚洲高清| 另类精品久久| 露出奶头的视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 十八禁高潮呻吟视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品免费视频内射| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一进一出抽搐动态| 高清欧美精品videossex| 丝袜喷水一区| 麻豆av在线久日| 黄色丝袜av网址大全| 又紧又爽又黄一区二区| 捣出白浆h1v1| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜福利视频精品| 国产成人系列免费观看| 亚洲精华国产精华精| 在线播放国产精品三级| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久国产精品麻豆| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品一区二区三卡| 一二三四社区在线视频社区8| 精品人妻在线不人妻| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产欧美日韩一区二区三| 国产男女超爽视频在线观看| 又大又爽又粗| 99久久精品国产亚洲精品| 大片电影免费在线观看免费| 精品第一国产精品| 国产成人免费无遮挡视频| 99九九在线精品视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 欧美在线黄色| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日韩欧美三级三区| 日本a在线网址| 久久香蕉激情| 国产日韩一区二区三区精品不卡| av电影中文网址| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线观看人妻少妇| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 中文欧美无线码| 老司机福利观看| 一级毛片精品| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看一区二区三区激情| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲五月婷婷丁香| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜精品国产一区二区电影| 天堂动漫精品| 麻豆av在线久日| 国产欧美日韩一区二区精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 女性被躁到高潮视频| av天堂在线播放| 天堂动漫精品| 黄片大片在线免费观看| 国产单亲对白刺激| 久久青草综合色| 免费在线观看影片大全网站| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品久久电影中文字幕 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日本中文国产一区发布| 精品久久蜜臀av无| 丝袜在线中文字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线播放国产精品三级| 三上悠亚av全集在线观看| 在线天堂中文资源库| 亚洲黑人精品在线| 黄片播放在线免费| 老司机靠b影院| 亚洲精品一二三| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 9191精品国产免费久久| 国产一卡二卡三卡精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 水蜜桃什么品种好| 大香蕉久久网| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产有黄有色有爽视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久久久国产电影| 一夜夜www| 国产一区二区 视频在线| 亚洲 国产 在线| 久久久久久久精品吃奶| 99国产精品99久久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 国产单亲对白刺激| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费观看人在逋| 性少妇av在线| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品久久久久成人av| 精品人妻1区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品av久久久久免费| 久久性视频一级片| 热99re8久久精品国产| 精品久久蜜臀av无| 看免费av毛片| 久热爱精品视频在线9| 国产又爽黄色视频| 91av网站免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产99久久九九免费精品| 老司机靠b影院| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜两性在线视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 人人澡人人妻人| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美精品一区二区免费开放| 水蜜桃什么品种好| 香蕉丝袜av| 国产一区二区 视频在线| 精品亚洲成a人片在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 大香蕉久久网| 黄片播放在线免费| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99国产综合亚洲精品| 久久热在线av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲人成电影免费在线| 麻豆成人av在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产1区2区3区精品| av在线播放免费不卡| 久久久国产成人免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人妻一区二区av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男女免费视频国产| 咕卡用的链子| 欧美激情极品国产一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 精品一区二区三卡| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久人人97超碰香蕉20202| 麻豆av在线久日| 国产亚洲精品一区二区www | 99久久精品国产亚洲精品| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产男女内射视频| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲熟女毛片儿| 免费观看人在逋| 91老司机精品| 好男人电影高清在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲第一青青草原| av网站免费在线观看视频| 高清av免费在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 美女午夜性视频免费| 国产黄频视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲综合色网址| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久9热在线精品视频| 丁香六月欧美| 久久久久久人人人人人| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲国产av新网站| 超碰成人久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲国产欧美网| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产视频一区二区在线看| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利视频精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www.熟女人妻精品国产| av在线播放免费不卡| 性少妇av在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩福利视频一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产黄色免费在线视频| 在线观看66精品国产| 亚洲av日韩在线播放| 午夜福利视频精品| 国产高清激情床上av| 亚洲五月婷婷丁香| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 91精品三级在线观看| 日本wwww免费看| 国产成人欧美| 香蕉国产在线看| 九色亚洲精品在线播放| cao死你这个sao货| a级毛片黄视频| 免费观看av网站的网址| 无限看片的www在线观看| 久久久国产精品麻豆| 一级毛片女人18水好多| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 高清在线国产一区| 精品人妻在线不人妻| 91麻豆av在线| 国产日韩欧美在线精品| 成人三级做爰电影| 精品视频人人做人人爽| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产日韩欧美亚洲二区| 久9热在线精品视频| 色老头精品视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 97在线人人人人妻| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产成人精品在线电影| 丰满迷人的少妇在线观看| 丁香欧美五月| av福利片在线| 精品国产亚洲在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 正在播放国产对白刺激| 一区二区日韩欧美中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩人妻精品一区2区三区| 99国产精品99久久久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 夫妻午夜视频| 天天影视国产精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品成人在线| 国产精品免费视频内射| 久久久久久久久久久久大奶| 美女国产高潮福利片在线看| 久久中文字幕人妻熟女| 黄色怎么调成土黄色| 他把我摸到了高潮在线观看 | 在线永久观看黄色视频| 亚洲avbb在线观看| 久久亚洲精品不卡| √禁漫天堂资源中文www| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲免费av在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 免费不卡黄色视频| 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 成人国产一区最新在线观看| 最黄视频免费看| 成人av一区二区三区在线看| 视频区图区小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲伊人色综图| 极品人妻少妇av视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费不卡黄色视频| 啦啦啦免费观看视频1| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久国产欧美日韩av| 成人三级做爰电影| 热99久久久久精品小说推荐| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品一区二区在线不卡| 精品乱码久久久久久99久播| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产av精品麻豆| 在线观看舔阴道视频| 天天添夜夜摸| 757午夜福利合集在线观看| 国产成人精品无人区| 精品福利观看| 91国产中文字幕| 婷婷成人精品国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老熟女久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天影视国产精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久精品免费免费高清| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜福利视频精品| 91av网站免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 91国产中文字幕| 免费在线观看影片大全网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| xxxhd国产人妻xxx| 成在线人永久免费视频| 色老头精品视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品亚洲成国产av| 国产亚洲欧美精品永久| 热99久久久久精品小说推荐| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲黑人精品在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 后天国语完整版免费观看| 91字幕亚洲| 在线av久久热| 国产免费av片在线观看野外av| 国产一区二区 视频在线| 在线天堂中文资源库| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久人妻熟女aⅴ| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲人成电影观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲av第一区精品v没综合| 成年人午夜在线观看视频| 日韩大码丰满熟妇| 999久久久国产精品视频| 亚洲免费av在线视频| 男女无遮挡免费网站观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成人永久免费在线观看视频 | 亚洲三区欧美一区| 人人妻人人澡人人看| 精品亚洲成a人片在线观看| 高清av免费在线| 国产精品免费一区二区三区在线 | 岛国在线观看网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 一本色道久久久久久精品综合| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久精品国产欧美久久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| av福利片在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 中文字幕制服av| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜福利一区二区在线看| xxxhd国产人妻xxx| 黄频高清免费视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕制服av| 大型黄色视频在线免费观看| 成人国产av品久久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 一级,二级,三级黄色视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人免费观看mmmm| 他把我摸到了高潮在线观看 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 激情视频va一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| avwww免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女国产高潮福利片在线看| 麻豆国产av国片精品| 十八禁高潮呻吟视频| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大香蕉久久成人网| 涩涩av久久男人的天堂| av一本久久久久| 女人久久www免费人成看片| 高清欧美精品videossex| 国产成人影院久久av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 多毛熟女@视频| 国产在线免费精品| 国产精品熟女久久久久浪| 青草久久国产| 丝袜喷水一区| 人人澡人人妻人| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 午夜两性在线视频| 国产区一区二久久| 日韩欧美三级三区| 日韩免费高清中文字幕av| a级毛片在线看网站| 18禁观看日本| 夫妻午夜视频| 91成年电影在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| 日本欧美视频一区| av国产精品久久久久影院| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产区一区二| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲久久久国产精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 乱人伦中国视频| 国产片内射在线| 嫩草影视91久久| 亚洲精品乱久久久久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 美国免费a级毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 成人特级黄色片久久久久久久 | 亚洲专区中文字幕在线| 多毛熟女@视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品国产av在线观看| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品自拍成人| 成人国产一区最新在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产有黄有色有爽视频| 蜜桃国产av成人99| 老司机福利观看| 国产三级黄色录像| 久热爱精品视频在线9| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲,欧美精品.| 超碰成人久久| av福利片在线| 国产免费av片在线观看野外av| 9191精品国产免费久久| 桃红色精品国产亚洲av| 国产日韩欧美在线精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 大型av网站在线播放| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品av久久久久免费| 妹子高潮喷水视频| 精品久久蜜臀av无| 国产一区二区激情短视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产麻豆69| 日韩欧美三级三区| 在线 av 中文字幕| 热99re8久久精品国产| 国产91精品成人一区二区三区 | 青草久久国产| 啦啦啦免费观看视频1| 黄色a级毛片大全视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美日韩一级在线毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人欧美在线观看 | 欧美午夜高清在线| 最新美女视频免费是黄的| 精品少妇黑人巨大在线播放| 色播在线永久视频| 免费观看人在逋| 下体分泌物呈黄色| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 三级毛片av免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品久久久久久电影网| 免费看a级黄色片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲男人天堂网一区| 91精品国产国语对白视频| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩精品网址| 波多野结衣一区麻豆| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美中文综合在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品国产国语对白av| 精品福利永久在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美久久黑人一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 水蜜桃什么品种好|