櫻花根癌農桿菌拮抗菌的篩選及功能分析

竺芊惠 胡霞 張宇鋆 王天康 邱琳凌

摘要：根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種重要的革蘭氏陰性植物病原細菌，幾乎能侵染所有的雙子葉植物引起根瘤。近年來，科學家們廣泛篩選拮抗微生物來進行櫻花根癌病的防治。本項目從櫻花種植苗圃的發(fā)病植株根際微生物中，分離出了4株對根癌農桿菌At2有著抑菌效果的菌株，其中一株效果最為明顯，將其命名為LW3。經形態(tài)學、生理生化指標初步鑒定其屬于假單胞桿菌（Pseudomonas）。利用細菌16S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌與摩氏假單胞菌（P. mosselii CIP 105259T）高度同源。該菌的成功分離，為生產櫻花根癌病拮抗菌提供了新的菌源，也為早期進行櫻花根癌病的預防提供了可能。

關鍵詞：根癌農桿菌;摩氏假單胞菌;拮抗菌;生物防治

1.引言

櫻歸屬于李屬（Prunus）下的櫻桃亞屬（Cerasus），其原產地主要分布在亞洲的中國、日本、韓國等地[1]。但在櫻花繁育基地，一種土傳病害-根癌病，正嚴重影響著櫻花的生長，制約櫻花產業(yè)的發(fā)展。相關文獻表明，浙江省寧波市櫻花主要栽培區(qū)平均發(fā)病率達30%，重發(fā)區(qū)塊植株患病率甚至高達92%[2]。綜上，櫻花根癌病的早期預防是防治該病的關鍵手段。

生物防治中的拮抗菌預防，因其天然、無污染、效果好的優(yōu)點，成為科研人員的研究對象。在根癌病的防治中，目前應用最廣的是澳大利亞科學家Kerr分離的一種放射土壤桿菌K84，該菌能夠產生核苷酸類細菌素，對根癌病的防治非常有效。當菌液濃度為106個/ml時，即可有效控制根癌病的發(fā)生[3]。K84的改造菌株K1026、WJK84-1能夠成功的用于桃樹等核果類果樹根癌病的防治。

基于以上現(xiàn)狀，本研究分別采集櫻花種植苗圃土壤，從中篩選對致病根癌農桿菌具有拮抗作用的生防菌，得到一株具有較強抑菌活性的細菌LW3。通過生理生化以及分子生物學手段對其進行鑒定，判斷其為摩氏假單胞菌，同時也對該菌進行了離體的拮抗作用分析，為根癌病防治的微生物菌肥生產提供資源。

2.材料與方法

2.1 土壤拮抗菌的分離及篩選

選取櫻花根系附近的土壤，通過梯度稀釋的方法進行稀釋，獲得單克隆。通過抑菌圈實驗，進行拮抗作用分析，觀察抑菌圈的產生并測量抑菌圈的直徑。

2.2拮抗菌的鑒定

拮抗菌的鑒定分別從形態(tài)學、生理生化、分子生物學三個方面進行分析。形態(tài)學：利用透射電子顯微鏡下進行觀察拍照。生理生化指標鑒定項目參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。分子生物學鑒定利用細菌通用16S rRNA引物F8 / R1492進行PCR擴增。

3.結果與分析

3.1 拮抗菌的分離

通過抑菌圈實驗測定，從根際細菌中篩選獲得了一株拮抗菌，將其命名為LW3。該菌株對At2的抑菌圈直徑在共培養(yǎng)4d后，抑菌圈的直徑達到了51mm（圖1a）。

3.2 拮抗菌的鑒定

菌株LW3在YEB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形、光滑，顏色灰白色。革蘭氏染色陰性，透射電鏡觀察顯示，該菌具有極生鞭毛（圖1b）。生理生化特征檢測分析，該菌不能在4℃和42℃生長，氧化酶、水解酶陽性、好氧生長、硝酸鹽還原陰性、檸檬酸鹽利用陽性、可利用甘露醇、麥芽糖、木糖等碳源、不能水解DNA。根據(jù)該菌菌落特征以及生理生化指標，初步判斷LW3為假單胞桿菌（Pseudomonas）。16S rRNA序列分析結果表明，菌株LW3與P. mosselii親緣關系最近，因此，將該菌歸為摩氏假單胞桿菌。

4. 討論

目前，已有報道證明，摩氏假單胞桿菌對多種病原菌具有拮抗作用，拮抗范圍涵蓋人類、昆蟲以及植物相關的病原菌。在這些研究中，僅有兩例關于該菌對植物病原物的拮抗，一個是P. mosselii BS011菌株中的c-xtl基因簇被證明正調控水稻對稻瘟病菌的抗性，另外一個是通過轉基因表達Ralstonia solanacearum ripAA基因，使P. mosselii產生了對煙草細菌性萎蔫病的抗性[4，5]。本研究從櫻花土壤致病菌根癌農桿菌入手，篩選出來一株摩氏假單胞菌LW3，并證明該菌對致病根癌農桿菌的強烈抑菌作用，是之前尚未報道的。通過離體和活體實驗證明，LW3通過抑制根癌農桿菌生長，從而降低其致病性來起作用。但是，該菌具體通過分泌哪種抑菌、抗菌物質來達到此效果，還需要進一步通過實驗來證明。

參考文獻：

[1] Li C L，Bruce B. Flora of China. Beijing：Science Press， 2003， 9： 404-420

[2] 王志龍，金楊唐，譚志文，王國良，林立. 寧波櫻花根癌病病原細菌鑒定，植物保護， 2014，40（3）：147-150

[3] Kerra A. Biological control of crown gall through production of Agrocin 84. Plant Disease，1980， 64（1）， 25-30.

[4] Wu G， Liu L. A selective insecticidal protein from Pseudomonas mosselii for corn rootworm control. Plant Biotechnology Journal. 2018， 16：649-659

[5] Zhou T， Chen ST， Fan XJ， Hu X， Zou， HS. An improved control efficacy against tobacco bacterial wilt by an engineered Pseudomonas mosselii expressing the ripAA gene from phytopathogenic Ralstonia solanacearum. BioRxiv， 2019

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