羊抗人載脂蛋白A1多克隆抗體的制備及免疫佐劑優(yōu)化

鄧碧華　姚明霞　周明旭　盧宇　徐志偉

摘要：載脂蛋白A1（ApoA1）是預(yù)測(cè)冠心?。ˋSCVD）最有價(jià)值的指標(biāo)之一。從人血漿中通過(guò)PEG沉淀法提取ApoA1，經(jīng)過(guò)純化和驗(yàn)證后，選擇不同佐劑進(jìn)行乳化，以不同免疫程序接種成年湖羊，制備羊抗人載脂蛋白A1多克隆抗體。通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)定期檢測(cè)免疫后羊血清中抗人ApoA1多克隆抗體的效價(jià)，比較不同佐劑的免疫效果。結(jié)果顯示，CV13佐劑與弗氏完全佐劑結(jié)合免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到或超越弗氏佐劑組，明顯優(yōu)于ISA206佐劑。本研究結(jié)果可為國(guó)內(nèi)醫(yī)藥企業(yè)自主制備高質(zhì)量羊抗人ApoA1多克隆抗體用于ApoA1檢測(cè)試劑盒提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：載脂蛋白A1;多克隆抗體;CV13佐劑;冠心病

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）19-0180-03

載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，簡(jiǎn)稱ApoA1）的監(jiān)測(cè)有助于某些異常脂蛋白血癥的特異性診斷。已有大量臨床研究表明，ApoA1是預(yù)測(cè)冠心?。ˋSCVD）最有價(jià)值的指標(biāo)之一^[1];同時(shí)，ApoA1也可作為其他脂代謝紊亂疾病，如糖尿病、尿毒癥、腎病綜合征、痛風(fēng)、激素代謝紊亂等的輔助觀察項(xiàng)目^[2-5]。ApoA1檢測(cè)試劑盒是臨床冠心病診斷的最有效方法之一^[6]，其中，羊抗人ApoA1多克隆抗體是該檢測(cè)試劑的關(guān)鍵核心原料。

為了獲得高效價(jià)的羊抗人ApoA1多克隆抗體，在免疫制備過(guò)程中選擇合適的佐劑和免疫程序是該生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前免疫效果最佳的商品化佐劑是弗氏佐劑，其主要免疫程序?yàn)槭状蚊庖卟捎酶ナ贤耆魟?周加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑。但弗氏佐劑成本過(guò)高、毒性強(qiáng)、乳化工藝及粘度高^[7]，使用時(shí)不方便，不適合醫(yī)藥企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)使用。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期自主研發(fā)的CV13佐劑是一種水包油包水佐劑，與弗氏佐劑油包水型佐劑相比，既保留了的免疫增強(qiáng)效果，同時(shí)降低毒性，注射后更容易被動(dòng)物吸收。與CV13同類(lèi)型ISA206佐劑由法國(guó)賽比克公司生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用于獸用疫苗領(lǐng)域。本研究擬比較CV13佐劑與弗氏佐劑在羊抗人ApoA1多克隆抗體制備中的免疫效力，并以商品化的ISA206佐劑作參照，以期能獲得最優(yōu)的免疫佐劑和免疫程序，用于羊抗人ApoA1多克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1主要試劑

弗氏佐劑：弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司;復(fù)乳佐劑1：CV13佐劑，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備提供;復(fù)乳佐劑2：ISA206佐劑，購(gòu)自法國(guó)賽比克公司;瓊脂糖，購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司;聚乙二醇（PEG），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ApoAI抗體偶聯(lián)親和層析柱，購(gòu)自美國(guó)GE公司;羊抗人ApoA1特異性抗體，購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;ApoA1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.2人載脂蛋白A1的提取、純化和驗(yàn)證

采用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的PEG沉淀法^[8]從人血漿中提取所含的高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）并且分離。將PEG沉淀血清后的上清（HDL）用-20 ℃預(yù)冷乙醇再次沉淀、離心，沉淀用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后經(jīng)多次透析，再采用親和層析法，利用抗原抗體可逆性結(jié)合的原理，用ApoA1抗體偶聯(lián)親和層析柱，透析后的上清液多次過(guò)柱反應(yīng)、洗脫、透析，并且用 3 000 ku的超濾管超濾到需要的濃度，從而得到ApoA1天然抗原。將純化的蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液制樣，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離鑒定。然后，將SDS-PAGE結(jié)束后的膠轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western-blot。使用羊抗人ApoA1特異性抗體，與上述的轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行孵育，ECL曝光后驗(yàn)證提取的蛋白大小。

1.3佐劑與抗原乳化

弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑分別與ApoA1蛋白1 ∶1混合，高剪切力攪拌乳化，制備油包水型免疫抗原。CV13佐劑和ISA206佐劑分別與ApoA1蛋白1 ∶1混合，低剪切力攪拌乳化，制備水包油包水型免疫抗原。不同疫苗中使用的ApoA1抗原量一致。

1.4佐劑乳化后性能

將弗式完全佐劑、CV13佐劑和206佐劑分別與ApoA1蛋白乳化后，乳液滴于冷水表面，根據(jù)擴(kuò)散情況，判定劑型。

1.5動(dòng)物免疫程序

成年健康湖羊20只，于2019年8月購(gòu)自徐州市蘇羊羊業(yè)有限公司，體質(zhì)量35 kg左右，打上耳標(biāo)標(biāo)記，隨機(jī)分為4組，每組5只。使用上一步中用不同佐劑制備的疫苗分別于0、7、14、21、28、35、42、49 d 進(jìn)行免疫，具體分組見(jiàn)表1。免疫后定期采集湖羊的免后血清。本動(dòng)物試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)下，在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物房開(kāi)展。試驗(yàn)結(jié)束后，所有試驗(yàn)動(dòng)物按照法律法規(guī)進(jìn)行無(wú)害化處理。

1.6瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)

在100 mL 8%氯化鈉溶液中加入1.0 g優(yōu)質(zhì)瓊脂糖，加熱融化后，加入終濃度為0.01%硫柳汞防腐，澆制凝膠板（約3 mm厚）。按六角形打孔，孔徑為5.0 mm、孔距為3.0 mm。將血清用生理鹽水進(jìn)行2倍系列稀釋。中央孔加入ApoA1抗原，周?chē)追謩e依次加入各稀釋度采集的湖羊血清。加樣后置于35～37 ℃濕盒中孵育，出現(xiàn)特異條帶判定為陽(yáng)性，出現(xiàn)條帶的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)。

1.7多克隆抗體的特異性檢測(cè)

將不同的濃度的ApoA1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與SDS上樣緩沖液配合制樣，SDS-PAGE后Western-bolt轉(zhuǎn)印到膜上。使用本研究制備的羊抗人ApoA1多克隆抗體進(jìn)行孵育，最后ECL曝光檢測(cè)制備抗體的特異性。

2結(jié)果與分析

2.1人載脂蛋白A1提取物的檢驗(yàn)

對(duì)本研究中方法提取的ApoA1天然抗原進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，提取純化的蛋白條帶單一，大小約28 ku，與目標(biāo)蛋白ApoA1大小一致（圖1-A）。Western-blot通過(guò)ApoA1特異性抗體檢測(cè)本試驗(yàn)提取物為ApoA1（圖1-B）。

2.2佐劑乳化性狀

弗氏完全佐劑與ApoA1抗原乳化后，乳液滴于冷水表面，液滴呈圓點(diǎn)狀浮于水表面，可判定為油包水劑型（圖2-A）;CV13佐劑和206佐劑分別與ApoA1抗原乳化后，乳液滴于冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散，可判定為水包油包水劑型（圖2-B、C）。

2.3瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)

采集免疫后羊血清，選擇不同濃度稀釋后進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示，制備的羊抗人ApoA1抗體對(duì)ApoA1抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖3）。

2.4不同佐劑和免疫程序抗體效價(jià)對(duì)比

從圖4可見(jiàn)，2、4、6免后，A組血清的瓊擴(kuò)效價(jià)最高，達(dá)到1 ∶24;B組血清抗體效價(jià)次之，達(dá)到1 ∶23.8;C組、D組免后的羊血清抗體效價(jià)最低。8免后，A組、B組的血清抗體效價(jià)明顯高于C組、D組。

2.5抗體的特異性檢測(cè)

Western-blot結(jié)果顯示，制備的羊抗人ApoA1多克隆抗體可以特異性結(jié)合ApoA1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白，抗體結(jié)合量依賴ApoA1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白的濃度增加（圖5）。

3討論

ApoA1是ApoA族中占比最多的一種組分。ApoA1為單一多肽鏈，由243個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為28.3 ku，是高密度脂蛋白（HDL）的主要載脂蛋白。HDL具有防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用，因此，測(cè)定血清（漿）中ApoA1的含量已成為防止心腦血管疾病的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目^[9-10]。羊抗人ApoA1多克隆抗體是該檢測(cè)試劑的關(guān)鍵核心原料，目前80%依賴進(jìn)口，核心問(wèn)題是缺乏產(chǎn)業(yè)化的人ApoA1的規(guī)?；?、快速提取工藝和高活性、高純度的多克隆抗體制備工藝技術(shù)^[11-12]。此外，前期的研究表明，佐劑的選擇是影響多克隆抗體的產(chǎn)量和抗體效價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)，因此如何提高免疫效果，提高產(chǎn)品質(zhì)量也是目前需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

筆者所在團(tuán)隊(duì)專門(mén)從事疫苗佐劑研究，對(duì)復(fù)乳佐劑及其他佐劑進(jìn)行了大量研究，已獲得了一個(gè)復(fù)乳佐劑CV13佐劑。該配方以礦物油為基礎(chǔ)油相，加入適宜的表面活性劑和助溶劑，使佐劑能與水相快速乳化，形成W/O/W型佐劑。該佐劑可一步乳化，工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)生產(chǎn)使用。制備的疫苗粒徑比較均一，大小在100～200 nm，更易被機(jī)體抗原提呈，激活宿主免疫系統(tǒng)。前期已通過(guò)多次動(dòng)物試驗(yàn)檢驗(yàn)，均有良好的安全性和免疫效果^[13]。CV13佐劑與弗氏佐劑比較，由于W/O/W劑型比O/W劑型容易吸收，更加安全，成本也相對(duì)便宜。本研究中，制備羊抗人ApoA1多克隆抗體時(shí)可選擇首次免疫使用弗氏完全佐劑，2～8加強(qiáng)免疫使用CV13佐劑的免疫程序，抗體效價(jià)略高于弗氏佐劑組，但鑒于CV13價(jià)格低、乳化工藝簡(jiǎn)便和弱毒性的特點(diǎn)，較弗氏佐劑存在較大優(yōu)勢(shì)，從而可降低總生產(chǎn)成本，值得在企業(yè)生產(chǎn)中推廣。該工藝技術(shù)可為我國(guó)醫(yī)藥企業(yè)自主制備高質(zhì)量的羊抗人ApoA1多克隆抗體，生產(chǎn)廉價(jià)、穩(wěn)定的ApoA1檢測(cè)試劑盒提供技術(shù)支撐;同時(shí)減少羊抗人ApoA1多克隆抗體的進(jìn)口依賴，降低我國(guó)該領(lǐng)域被國(guó)外“卡脖子”的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

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基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（20）2009];江蘇省鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃（編號(hào)：SH2020001）。

作者簡(jiǎn)介：鄧碧華（1981—），男，江蘇無(wú)錫人，碩士，副研究員，主要從事疫苗佐劑研究。E-mail：dengbihua2000@163.com。

通信作者：徐志偉，副研究員，主要從事畜禽高效養(yǎng)殖等研究。E-mail：xzw1729@sina.com。