黑枸杞花青素的提取及其抗氧化性分析

劉玉玲 張秋紅 徐帆

摘要：黑枸杞作為原料，用超聲輔助法提取黑枸杞花青素，設(shè)計單因素實驗和正交試驗來探究黑枸杞花青素提取的最適條件。結(jié)果表明：提取黑枸杞花青素最佳的工藝條件是1%HCL提取溶劑和70%C2H5OH之比為50：50，溫度為40℃，超聲波提取時間為45min，超聲波提取功率為480W，料液比為1：40（g/ml）。黑枸杞花青素具有較強清除DPPH的能力，且高于對照組VC，黑枸杞花青素對·OH也有較強清除作用，只是黑枸杞花青素的清除能力沒有VC的清除能力強。

關(guān)鍵詞：黑枸杞;花青素;抗氧化;超聲波提取;正交試驗

1 材料

1.1 試驗原料與試劑

黑枸杞（粉碎、干燥）。

70%C2H5OH、HCL溶液、C2H4O2溶液、KCL溶液、CH3COONa溶液、DPPH·溶液、C7H6O3溶液、FeSO4溶液、H2O溶液、VC溶液（均為分析純）。

1.2 試驗儀器

starter3C實驗室pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司;RHP-2000A粉碎機：浙江榮浩股份有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市友聯(lián)儀器研究所;DHCT-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司;TCL-16高速離心機：金壇市恒豐儀器廠;TGL-16aR高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠;752紫外分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司。

2 試驗方法

2.1 黑枸杞花青素超聲波提取工藝流程

黑枸杞清洗→烘干、粉碎→過篩→稱取黑枸杞粉末→超聲波提?。尤胍掖迹闉V→高速離心→濃鹽酸調(diào)至pH =1→重復(fù)提取3次→合并提取液→冷凍離心→黑枸杞花青素提取液。

2.2 黑枸杞花青素單因素試驗設(shè)計

黑枸杞作為原料，在吸收波長為525nm處，超聲輔助提取的條件下，進行單因素試驗，單因素分別為提取劑、溫度、時間、料液比和超聲功率。

黑枸杞花青素單因素的確定：

準確稱取1.0g干燥粉碎過的黑枸杞，初步設(shè)定花青素的提取料液比1：30（g/m L），提取溫度60℃、超聲波功率360W、提取時間30 min、提取劑0.1%HCL與70%乙醇之比為50∶50，保持其中四個因素不變，改變一個因素，重復(fù)操作實驗五次，確定出提取黑枸杞花青素的最佳提取料液比、溫度、超聲波功率、提取時間、以及提取劑0.1%HCL與70%乙醇之比。

2.3 黑枸杞花青素正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，計算出五個單因素中對黑枸杞花青素提取影響效果較大的前四個單因素，分別為A（溫度）、B（時間）、C（功率）、D（料液比）四因素來進行四因素三水平試驗。

2.4 黑枸杞中花青素的測定

緩沖溶液的配置：pH1.0緩沖溶液：4.0ml0.5mol/L氯化鉀溶液、2.0ml0.5mol/L鹽酸溶液，避光放置備用。pH4.5緩沖溶液：量取9.8ml的C2H4O2，稱取CH3COONa18g，用去離子水定容至1000ml容量瓶中，避光放置。

吸取1ml花青素提取液，移液至50ml的容量瓶中，用配置好的pH1.0的緩沖溶液定容，避光平衡90min，用分光光度計測量吸光值;再取花青素提取液1ml，用50ml容量瓶以pH4.5的緩沖溶液定容，避光靜置平衡90min，測定其吸光值;按公式（1-1）代入數(shù)值計算結(jié)果，得出花青素含量。

（1-1）

式中：ΔT-p H 1.0緩沖溶液的吸光值和pH 4.5的緩沖溶液的吸光值的差值;V-為花青素提取液被緩沖溶液稀釋的體積數(shù)，L：F-為花青素提取液被緩沖溶液稀釋的倍數(shù);M1-449.2，即矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量;ε-29600，即矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù);M2-稱取黑枸杞的重量，g。

2.5 黑枸杞花青素對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除測定

（1）以無水C2H5OH配制溶液濃度為0.1mol/L DPPH·，避光放置。

（2）將花青素提取液稀釋為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35mg/ml溶液。量取不同梯度提取液1ml，分別與5mlDPPH·溶液均勻混合，放置暗處平衡30 min，在525nm處測定吸光值，按公式（1-2）計算DPPH·清除率。

清除率=（WA-WB）/WA×100%（1-2）

式中WA：為DPPH·溶液和去離子水的吸光值;WB為DPPH·溶液和花青素混合溶液的吸光值。

（3）避光快速稱取維生素C粉末，加入去離子水把維生素C溶解稀釋，配制濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml維生素C溶液，按照（2）操作，繪制維生素C曲線。

2.6 黑枸杞花青素水楊酸法對羥基自由基（·OH）清除率測定

（1）利用水楊酸法測定羥基自由基（·OH）被花青素清除的清除率，用去離子水把花青素提取液依次稀釋，配置濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml。采用水楊酸法[8]37℃條件下，水浴15 min，在525nm下測其吸光值，按照下式（1-3）計算·OH清除率

（1-3）

式中A樣品：為樣品的吸光值;A空白：為不加顯色劑H2O2吸光值;A對照：為空白對照的吸光值。

（2）稱取維生素C粉末，加入去離子水把維生素C溶解稀釋，配制濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml維生素C溶液，按照（1）操作，繪制維生素C曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對黑枸杞花青素提取效果的影響

3.1.1 提取溶劑對黑枸杞花青素提取量的影響

提取率隨著1%鹽酸和70%乙醇比例的增加先增加后減少，在1%鹽酸和70%乙醇只比為50：50時，提取率最高。提取劑的最優(yōu)選擇為60%C2H5OH，而試驗采用的是酸化C2H5OH，目的是調(diào)節(jié)pH值，以達到提取花青素的最適提取條件。

3.1.2 料液比對黑枸杞花青素提取量的影響

花青素提取率隨著料液比的增加而逐漸增加，隨后趨于平穩(wěn)。在物液比為1：30（g/ml）時，可以明顯看出提取高峰值，花青素提取率效果最好。結(jié)合文獻鞏芳芳等人研究結(jié)果對比可知，研究結(jié)果一致。

3.1.3 提取溫度對黑枸杞花青素提取量的影響

花青素提取率隨著溫度的升高，提取率先升高后降低，黑枸杞花青素在溫度為50℃時，提取率最高。由文獻可知花青素結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定性，較高的溫度會破壞花青素的結(jié)構(gòu)，從而降低了花青素的提取率。結(jié)合文獻崔逸，蔣彩云，張翔等人的研究結(jié)果對比可知，結(jié)果一致。

3.1.4 提取時間對黑枸杞花青素提取量的影響

花青素提取率隨著提取時間的延長，提取率先升高后降低，當時間在45min時，提取率最高。結(jié)合文獻張玲艷的研究結(jié)果可知，最佳提取時間為25min，與試驗結(jié)果有偏差，綜合分析可知，張玲艷的提取方法為乙醇提取法，本試驗采用到酸化乙醇提取法，需時間稍長一些使其充分提取，以達到最大提取量。

3.1.5 超聲波功率對黑枸杞花青素提取量的影響

花青素含量隨著超聲波功率的增大，提取率先顯著升高后顯著降低，在超聲功率360W時，提取率最高。當提取功率慢慢增加，會對提取的花青素有一定影響，使之發(fā)生熱效應(yīng)，而熱效應(yīng)會阻礙花青素的提取。不過隨著時間的延長，溶液中的花青素會與蛋白纖維發(fā)生反應(yīng)，兩者聚集結(jié)合，就又會被提取出來，所以提取率也會發(fā)生變化，慢慢升高?？芍?，試驗結(jié)果的可行性無問題。

3.1.6 正交試驗

根據(jù)正交試驗分析可知，最優(yōu)組合方案是A1B3C3D3，為提取花青素溫度40℃，提取花青素時間45min，提取花青素功率480W，提取花青素料液比

1：40時，黑枸杞花青素的提取率最高。通過對最優(yōu)組合的驗證試驗，吸光值為0.493高于正交試驗的最高吸光值0.474，所以該組合為最優(yōu)組合方案。四因素的主要影響次序為A>B>D>C，即溫度>時間>料液比>功率。

3.2 花青素在黑枸杞中的含量

通過正交試驗的最優(yōu)組合，取得提取率最高的花青素提取液，通過計算可知，黑枸杞中花青素含量為168mg/100g。結(jié)合文獻可知，在正常范圍內(nèi)，結(jié)果一致。

3.3 黑枸杞花青素抗氧化性的研究

3.3.1 對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除能力

隨著濃度的增加，VC和花青素提取液對DPPH·的清除能力都呈上升趨勢，但同濃度的情況下，VC的清除效果沒有花青素的清除效果顯著，在濃度在0.35時，花青素對清除率為90%，而VC的清除率只有百分之七十，所以，對DPPH·的清除能力花青素大于VC。

3.3.2 對羥基自由基（·OH）清除率測定

隨著濃度的增加，VC和花青素提取液對·OH的清除能力都呈上升趨勢，可在同等濃度的下，花青素清除·OH的能力遠不如VC，當濃度在0.35時，VC對·OH幾乎徹底被VC清除，而花青素對·OH的清除率僅為百分之六十，顯然對·OH的清除能力VC大于花青素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素在體外活性氧模型中表現(xiàn)出較強的還原力和清除羥基自由基的能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，與試驗結(jié)論保持一致。

4 結(jié)論

黑枸杞花青素提取最佳工藝條件為提取溶劑1%HCL和70%C2H5OH比為50：50，溫度為40℃，超聲波提取時間為45min，超聲波提取功率為480W，花青素提取料液比值為1：40（g/ml）。

黑枸杞花青素具有較強清除DPPH·和·OH的能力，隨著黑枸杞花青素濃度的增加，清除能力越來越強，只是花青素的清除·OH能力沒有維生素C的清除能力強?？偟膩碚f黑枸杞花青素具有較強的抗氧化性。

參考文獻

[1] 楊斌，王向未.黑枸杞及其功能性成分在食品工業(yè)中的應(yīng)用及開發(fā)進展[J].輕工科技，2014，30（10）：22-23.

[2] 閆亞美，羅青，冉林武，等.黑果枸杞功效研究進展及產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景[J].寧夏農(nóng)林科技，2015，56（01）：21-24，57.