廣藿香多酚類成分的提取工藝及其黃嘌呤酶抑制活性研究*

洪 玲，張遠(yuǎn)芳，許明媚，劉 芳

(湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000)

廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth.)為唇形科雌蕊草屬植物的地上干燥部分，廣東的道地藥材，“十大廣藥”之一，主產(chǎn)于廣東、海南等地，植物資源豐富，是一種非常重要的傳統(tǒng)中藥。廣藿香的活性成分是哪些呢？一直以來，廣藿香研究的焦點(diǎn)主要集中在揮發(fā)油部分，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)廣藿香非揮發(fā)油部分也具有較好的生物活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)廣藿香多酚類成分在某些方面較揮發(fā)油部分具有更好的生物活性，同時，文獻(xiàn)調(diào)研也顯示廣藿香大極性成分具有較好生物活性，如Su-Young Park等[1]的研究表明廣藿香水提物對TNBS誘導(dǎo)的UC有改善作用；廣藿香水提物可以抑制因鋅(Zn)不正常引起腸道絨毛損害[2]；任恒鑫等發(fā)現(xiàn)廣藿香黃酮類化合物有可能是其治療腸易激綜合癥的藥效成分[3]；Kim EK等[4]發(fā)現(xiàn)廣藿香黃酮類成分具有良好抗氧化和肝細(xì)胞保護(hù)作用。另外，2015版《中國藥典》收錄含廣藿香的50余種成方制劑中，24種以藥材磨粉制丸的形式入藥，19種以藥材水提液加水蒸汽蒸餾液的形式入藥(即以水提物和揮發(fā)油成分共同入藥)，1種(鼻炎康片)直接以藥材水提液入藥，僅有4種是直接以廣藿香油入藥，2種以乙醇浸出物入藥，提示廣藿香的藥效成分不僅是揮發(fā)油成分，揮發(fā)油以外的成分也具有重要的地位。

廣藿香藥材中具有大量多酚類成分[5]，植物多酚類成分具有多種藥理活性[6-8]如抗氧化、抗癌、抗病毒、抗心腦血管疾病、調(diào)血脂、抗炎等，但對廣藿香多酚提取工藝、抗氧化作用及黃嘌呤氧化酶抑制活性等研究還未見報道。本文以多酚類成分得率為考察指標(biāo)系統(tǒng)優(yōu)化了從廣藿香藥材中提取多酚類成分，并對提取得到的多酚類成分進(jìn)行了抗氧化作用和黃嘌呤氧化酶抑制作用進(jìn)行了研究。為廣藿香藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

本研究對象為廣藿香，為河北金葉子藥業(yè)有限公司所生產(chǎn)，產(chǎn)地為廣東，批號190202C043。實(shí)驗(yàn)所用水為超純水；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級純，福州飛凈生物科技有限公司；福林酚試劑，生物試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸，純度99%，阿拉丁；無水乙醇，無水碳酸鈉，水楊酸，硫酸亞鐵，3%過氧化氫，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃嘌呤氧化酶，貨號X1875-5UN，sigma；黃嘌呤，高級純，薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司。

1.1.2 儀 器

UV-9000型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；HWA-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA223S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CS-10B高純水發(fā)生儀，力辰科技；PTHW HEATER電熱套，河南愛博特科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品11 mg于100 mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，得到濃度為0.11 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2以及3.6 mL置于50 mL的容量瓶中，以蒸餾水補(bǔ)至12.0 mL，加入福林酚試劑1.0 mL，充分混勻，在5 min內(nèi)加入3.0 mL 20%的碳酸鈉溶液，混合后用再用蒸餾水定容，50 ℃避光水浴20 min，以蒸餾水為空白對照，在760 nm下測定吸光值，每個樣品平行測定3次。以沒食子酸在反應(yīng)體系中的濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的平均吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 廣藿香多酚的提取方法與多酚含量的測定

取廣藿香樣品，密封備用。對乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%，30%，40%，50%，60%，70%)料液比(g/mL)(1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，1:60，1:70)、提取時間(20，40，60，80，100，120，140 min)以及提取溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)這幾個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度和時間為廣藿香多酚的 4 個影響因素，每個因素設(shè) 3 個水平，采用 L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。稱取廣藿香樣品5 g，放入圓底燒瓶瓶中，按上述單因素及正交試驗(yàn)設(shè)定的條件加入提取劑，放入電熱套中，恒溫冷凝回流提取一定時間，取出冷卻，過濾，洗滌殘渣，濾液合并定容至提取劑原體積。吸取提取液適量按“2.2”的方法測定，計算多酚得率：

多酚得率(mg/g)=c×V×n/m

式中：c 為樣液多酚的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V 為提取液體積/(mL)；n 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定

按最佳條件提取廣藿香多酚，所得樣液用于進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。參照參考文獻(xiàn)[9]的方法稍作修改，將0.1 mg/mL DPPH·的無水乙醇溶液 1 mL和樣液 1 mL 混勻，室溫下避光反30 min，在 517 nm 處測定吸光度。清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中：A1為樣液與DPPH·溶液的吸光度；A2 為樣液的吸光度；A3為 DPPH·溶液的吸光度。

1.2.4 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

實(shí)驗(yàn)設(shè)有B1、B2、B3、B4四組，每組所加試劑不同，具體所加試劑操作如表1所示。在加入黃嘌呤氧化酶后均需于 37 ℃水浴10 min，水浴結(jié)束后立即加入1 mL鹽酸(1 mol/L)使反應(yīng)終止，于290 nm處測定吸光度。

表1 抗黃嘌呤氧化酶實(shí)驗(yàn)試劑操作Table 1 Operation of antixanthine oxidase reagents (mL)

每個樣品平行三次實(shí)驗(yàn)，計算平均吸光度代入酶抑制率公式：

酶抑制率=(1-(B1-B3)/(B2-B4))×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

沒食子酸線性關(guān)系的考察：以沒食子酸質(zhì)量濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)平均吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，計算得線性回歸方程為：y=89.5427x+0.0474，相關(guān)系數(shù)R2=0.99903在0.0018～0.008 mg/mL范圍內(nèi)，沒食子酸質(zhì)量濃度與其吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 廣藿香多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比的影響

圖2為料液比對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖2 料液比對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.2 Effect of material liquid ratio on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖2可以看出，料液比(g/mL)從 1:10 到 1:50，廣藿香多酚的得率逐漸增加，說明增加溶劑用量有助于多酚類物質(zhì)的溶出；但料液比繼續(xù)增大，多酚得率反而稍微降低，說明多酚類物質(zhì)已基本提取完全，繼續(xù)增大溶劑反而會增大損耗。所以料液比確定為1:50。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

圖3為乙醇體積分?jǐn)?shù)對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.3 Effect of the ratio of ethanol to water on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖3可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，廣藿香多酚的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時，廣藿香多酚的得率最高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)再增大，得率逐漸降低。多酚是多羥基酚類化合物的混合物，不同的物質(zhì)其多酚物質(zhì)的組成不同，因而極性不同，需要選擇與其極性相適應(yīng)的溶劑使其溶出率最高。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%最適合提取廣藿香多酚。

2.2.3 提取時間的影響

圖4為提取時間對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖4 提取時間對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖4可以看出，廣藿香多酚的得率隨時間的延長先升高降低，100 min時得率最高，可能是提取時間長會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化等反應(yīng)使其結(jié)構(gòu)被破壞。后續(xù)試驗(yàn)選擇提取時間為100 min。

2.2.4 提取溫度的影響

圖5為提取溫度對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖5 提取溫度對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，廣藿香多酚的得率先增加后逐漸降低，可能是溫度越高，多酚物質(zhì)越不穩(wěn)定。在60 ℃時得率最高，所以選擇提取溫度為60 ℃。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的結(jié)果，設(shè)計L9(34)正交表，以廣藿香多酚的提取率作為評價指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交設(shè)計如表2所示，結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表 3。極差分析結(jié)果表明，料液比對廣藿香多酚得率的影響較大，提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度對廣藿香多酚得率的影響依次減少，因素主次順序?yàn)椋築>D>A>C。根據(jù)正交表，從廣藿香中提取多酚的最佳方案為：A3B3C3D2，即50%乙醇，料液比(g/mL)1:60，提取溫度50 ℃，提取時間120 min，按此優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，廣藿香多酚的得率為(10.652±0.06)mg/g。

2.4 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定

圖6為廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定。

表5 廣藿香多酚對DPPH·自由基的清除能力Table 5 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

圖6 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

DPPH·自由基清除試驗(yàn)是評價天然產(chǎn)物抗氧化活性的一種常用方法。由圖6可以看出，廣藿香多酚能清除DPPH·自由基，且在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH·自由基的清除能力都隨質(zhì)量濃度的升高逐漸增強(qiáng)，IC50=0.0064 mg/mL。

2.5 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

對含有不同濃度的廣藿香多酚提取物(mg/mL)進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示，IC50=0.0224 mg/mL。

表6 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Table 6 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

圖7 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

3 結(jié) 論

黃嘌呤氧化酶的活性對體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生有至關(guān)重要的作用，核酸分解代謝過程中的中間產(chǎn)物黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下可氧化生成尿酸，隨尿排出，因尿酸溶解度較小，體內(nèi)過多時可形成尿路結(jié)石或痛風(fēng)[10]。黃嘌呤氧化酶在氧化黃嘌呤時也產(chǎn)生過氧化物質(zhì)。過氧化物是在代謝過程中產(chǎn)生的一類能損傷蛋白質(zhì)、DNA、酶活性的物質(zhì)，與炎癥、衰老、退行性病變及腫瘤等病理過程有關(guān)[11]?？寡趸锿ㄟ^抑制過氧化物的產(chǎn)生及及時轉(zhuǎn)變過氧化物質(zhì)而對機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用?？寡趸瘎┛赏ㄟ^測定還原力來表示抗氧化活性的強(qiáng)弱，抗氧化物質(zhì)自身具有給出電子的能力，繼而清除自由基發(fā)揮抗氧化作用，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。

在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)廣藿香水提物具有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)水提物中含有大量的酚酸類成分，推測廣藿香酚酸類成分具有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制作用。為驗(yàn)證推測本文以多酚類成分得率為考察指標(biāo)對廣藿香進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，得到的最優(yōu)提取工藝為：在50 ℃的溫度下，以50%乙醇為提取溶劑，料液比(g/mL)為1:60，提取時間為120 min時，廣藿香多酚的得率最高為(10.652±0.06)mg/g。對采用優(yōu)化后的提取工藝獲得的廣藿香多酚提取物進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制作用研究時顯示廣藿香多酚具有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，其IC50=0.0224 mg/mL，驗(yàn)證了之前的推測，說明廣藿香多酚可以通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性減少尿酸的形成而降低血中尿酸的含量，從而對痛風(fēng)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生有效的預(yù)防和治療作用。同時實(shí)驗(yàn)顯示廣藿香多酚對DPPH·自由基具有較強(qiáng)的清除能力，最大清除率可達(dá)98.86%，可以減少炎癥的發(fā)生及減少組織的損傷?？傊?，本研究為廣藿香多酚預(yù)防和治療痛風(fēng)和痛風(fēng)性關(guān)鍵炎奠定了扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為廣藿香藥材的開發(fā)利用提供了研究方向。