復(fù)合益生菌對(duì)大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼魚免疫及抗病力的影響

■產(chǎn)啟霞 王福強(qiáng)* 憨素連 李 坤

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116622）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）原產(chǎn)于歐洲，適宜在低溫環(huán)境生活，是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一[1-2]。日益發(fā)展的大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)面臨著患病率高的突出問(wèn)題，這極大地限制了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-7]。

益生菌是一種通過(guò)改善動(dòng)物周圍環(huán)境或增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)疾病應(yīng)答力的活菌制劑[8-10]，已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用[11-12]。研究表明，芽孢桿菌能顯著提高病原菌哈氏弧菌感染蝦的成活率[13]，當(dāng)大菱鲆仔魚被病原弧菌感染時(shí)，乳酸菌能有效降低其死亡率[14]。然而，關(guān)于復(fù)合益生菌對(duì)大菱鲆免疫及抗病力的影響知之甚少。本研究在飼料中添加不同比例的由枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和酵母菌等復(fù)合而成的益生菌，評(píng)估其對(duì)大菱鲆幼魚免疫和抗病力的影響，旨在為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用大菱鲆幼魚由大連天正實(shí)業(yè)有限公司提供，運(yùn)往大連海洋大學(xué)暫養(yǎng)7 d后在遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

復(fù)合益生菌粉由大連陽(yáng)光白奧科技有限公司提供，由枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，（6.7±1.8）×107CFU/g]、嗜酸乳桿菌[Lactobacilli acidophilus，（2.1±0.6）×108CFU/g]和釀酒酵母[Saccharomyces cerevisiae，（8.4±2.3）×106CFU/g]組成?；罹鷶?shù)計(jì)算采用稀釋平板法[15]。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將375尾體重為(8.94±0.02)g大菱鲆幼魚隨機(jī)分成5組：Z0組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；Z1、Z2、Z3、Z4組為試驗(yàn)組，分別投喂含復(fù)合益生菌粉0.2%（2 g/kg）、0.4%（4 g/kg）、0.6%（6 g/kg）、0.8%（8 g/kg）的飼料，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾魚。所有飼料原料經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，按飼料配方稱重，混合均勻，再加入適量的水。用JZL型擠壓造粒機(jī)（購(gòu)自常州品正干燥設(shè)備有限公司）制作直徑為2.0 mm的飼料，在室內(nèi)陰干后（低于20℃）置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆??；A(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平（%）

試驗(yàn)在循環(huán)控溫養(yǎng)殖水槽（100 cm×60 cm×30 cm）中進(jìn)行，養(yǎng)殖期間全天充氣，水溫控制在（18±1）℃，pH為7.35～7.42、鹽度為30.6‰～31.2‰。每天以幼魚體重的3%投喂日糧，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整飼喂量，達(dá)到飽食投喂，每天飼喂2次（分別為8：00和17：00），投喂后0.5 h清理殘餌糞便，并換水1/2，養(yǎng)殖周期為60 d。

1.2.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束前對(duì)大菱鲆幼魚進(jìn)行24 h饑餓處理，隨機(jī)從各組中選取5尾大菱鲆，尾靜脈取血（3～4 mL），用低溫離心機(jī)離心（12 000 r/min，15 min）后取血清，置于-80℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫指標(biāo)的測(cè)定

大菱鲆血清的溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和總抗氧化力（T-AOC）測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.2.4 攻毒試驗(yàn)

60 d飼養(yǎng)結(jié)束后對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的大菱鲆進(jìn)行為期14 d的攻毒試驗(yàn)，攻毒菌株為遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda），菌株來(lái)自大連海洋大學(xué)病害實(shí)驗(yàn)室。分別從各水槽取13尾魚，采用腹腔注射法每尾魚注射0.1 mL菌懸液（1×108CFU/mL），攻毒試驗(yàn)期間大菱鲆停止飼喂，記錄各組魚在7 d和14 d內(nèi)的累積死亡率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)使用SPSS 22.0軟件和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，在差異顯著時(shí)，采用Duncan’s法對(duì)平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆幼魚免疫酶活性的影響（見(jiàn)表2）

表2 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆免疫酶活性的影響(N=3)

由表2可知，與Z0組相比，Z1、Z2、Z3組中的大菱鲆血清ACP活性有增高的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。Z4組ACP活性和Z0組相比也沒(méi)有顯著差異（P>0.05），但卻顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。

Z2組大菱鲆血清AKP活性顯著高于Z0組和其他試驗(yàn)組（P<0.05）。Z3組大菱鲆血清LZM活性顯著高于Z0組（P<0.05），但和其他試驗(yàn)組差異不顯著（P>0.05）。

各試驗(yàn)組的大菱鲆血清CAT活性均顯著高于Z0組（P<0.05），Z2、Z3組也顯著高于Z1、Z4試驗(yàn)組（P<0.05）。Z1、Z2、Z3組的大菱鲆血清SOD活性顯著高于Z0組和Z4組（P<0.05），但Z1、Z2、Z3組之間差異不顯著（P>0.05）。

Z1、Z2、Z3組的大菱鲆血清T-AOC顯著高于Z0組（P<0.05），且Z3組大菱鲆血清T-AOC也顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05），其他試驗(yàn)組之間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆幼魚攻毒試驗(yàn)的影響（見(jiàn)表3、圖1）

圖1 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆抗病力的影響

表3 不同復(fù)合益生菌粉添加量對(duì)攻毒后大菱鲆成活率的影響(N=3，%)

如表3所示，飼料中添加復(fù)合益生菌粉對(duì)攻毒7 d和14 d的大菱鲆存活率均有影響。Z0組和Z4組在攻毒7 d后，大菱鲆幼魚的成活率顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。Z0組和Z4組在攻毒14 d后，大菱鲆幼魚的成活率也顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。

由圖1和表3可見(jiàn)，在大菱鲆幼魚注射遲鈍愛(ài)德華菌的前5 d，Z1、Z2、Z3組沒(méi)有死亡，而Z0組和Z4組的大菱鲆死亡率達(dá)到35%以上。攻毒7 d后，Z1、Z2、Z3組的大菱鲆幼魚存活率仍然在90%左右，而Z0組的大菱鲆存活率不到20%。攻毒14 d后，Z0組和Z4組的大菱鲆已幼魚全部死亡，而Z1、Z2、Z3組的大菱鲆成活率仍然有40%～50%左右。總的趨勢(shì)是，隨著復(fù)合益生菌添加量的增加，大菱鲆累積死亡率逐漸下降，達(dá)到最小值后又上升。這表明復(fù)合益生菌粉對(duì)用遲鈍愛(ài)德華菌攻毒的大菱鲆幼魚有一定的保護(hù)作用。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆幼魚免疫酶活性的影響

魚類的非特異性免疫比特異性免疫系統(tǒng)更重要，尤其在抗病能力上更是如此[16]。LZM是水產(chǎn)動(dòng)物重要的非特異性免疫因子之一，存在于組織、體液和分泌物中。是水生動(dòng)物對(duì)抗傳染性病原體至關(guān)重要的工具酶[17]。AKP和ACP是溶酶體酶的重要組成部分，在生物體免疫反應(yīng)中具有重要作用[18]。魚體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)，如CAT和SOD等是水生動(dòng)物重要的抗氧化酶，可通過(guò)清除氧自由基來(lái)阻止生物分子損傷[19-20]。抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物形成的指標(biāo)可由TAOC表示[21]。這些免疫相關(guān)酶與抗氧化酶作為魚體免疫系統(tǒng)的組成部分，其活性的高低直接反映了魚體非特異性免疫防御能力。

研究證實(shí)，單種益生菌可以提高水生動(dòng)物的LZM水平。乳酸乳球菌、清酒乳桿菌、腸膜明串珠菌可以使褐鱒（Salmo trutta）血清LZM水平升高[22]。在飼料中添加高劑量的滅活乳桿菌同樣能提高刺參（Apos?tichopus japonicus）AKP的活性[23]。凡納濱對(duì)蝦（Litope?naeus vannamei）日糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高血清SOD和T-AOC活性[24]。把枯草芽孢桿菌直接投入水體中也能提高魚類的血清T-AOC[25]。這些研究表明益生菌能提高水產(chǎn)動(dòng)物血清的免疫酶活性。然而，復(fù)合益生菌粉是否能夠進(jìn)一步對(duì)大菱鲆非特異性免疫防御能力有改善作用仍鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究表明，飼料中添加復(fù)合益生菌粉能夠提高大菱鲆血清LZM、ACP、AKP、CAT、SOD活性和T-AOC，尤其是添加量為0.6%時(shí)效果最為顯著。刺參飼料中添加6 g/kg的復(fù)合益生菌顯著提高了刺參體腔液的ACP活性，而其他添加量則對(duì)ACP活性沒(méi)有顯著影響，投喂復(fù)合益生菌組的刺參體腔液中CAT活性與對(duì)照組也沒(méi)有顯著差異[26]。這可能與益生菌的種類、試驗(yàn)水產(chǎn)動(dòng)物種類以及添加量有關(guān)。

3.2 復(fù)合益生菌粉對(duì)大菱鲆抗病力的影響

遲鈍愛(ài)德華菌是一種能引起水產(chǎn)動(dòng)物腹水癥的致病菌，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已引起了20多種魚類患病，如鰻鱺（Anguilla spp）、中華鱉（Trionyx sinensis）、牙鲆（Paralichthys olivaeus）等，造成了巨大損失。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加0.2%～0.6%的復(fù)合益生菌粉，將攻毒后大菱鲆成活率提高到90%左右，而對(duì)照組不到20%。這表明在飼料中添加復(fù)合益生菌能增強(qiáng)大菱鲆幼魚的抗病力。這些結(jié)果和徐琴等[27]的研究一致，其發(fā)現(xiàn)在中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）養(yǎng)殖中用鰻弧菌攻毒后，添加微生物制劑的3個(gè)試驗(yàn)組的中國(guó)明對(duì)蝦存活率都顯著高于對(duì)照組。同樣，用哈維氏弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦攻毒后，益生菌組的凡納濱對(duì)蝦死亡率顯著低于對(duì)照組[28]。大菱鲆攻毒后的存活與非特異性免疫酶和抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)基本一致，這有力地表明復(fù)合益生菌能通過(guò)提高大菱鲆的非特異性免疫防御能力，從而明顯改善其生存狀況。

4 結(jié)論

飼料中添加復(fù)合益生菌粉能增強(qiáng)大菱鲆免疫酶活性和抗病力。復(fù)合益生菌粉添加量為0.6%時(shí)，大菱鲆幼魚的免疫酶活性和抗病力達(dá)到最佳狀態(tài)。