生物預(yù)處理對(duì)油樟精油組成、油細(xì)胞和內(nèi)生菌群的影響

程 賢,畢良武*,李勝男,陳玉湘,趙振東,莫開林

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京210042;2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都610081)

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)是中國(guó)特有的樟科樟屬樹種,主要分布在我國(guó)的四川省,此外,湖南、廣東、重慶等省市也有種植[1]。油樟精油的主要成分包括醇類、烴類、酯類、醛類等[2],醇類成分以1,8-桉葉素和α-松油醇為主,烴類以萜類為主,包括γ-松油烯、α-蒎烯和石竹烯等[3]。研究表明油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用,應(yīng)用前景廣闊[4-6]。目前油樟精油的生產(chǎn)還是沿襲傳統(tǒng)的蒸餾工藝,導(dǎo)致粗油提取效率普遍偏低,因此,如何提高油樟精油提取得率,保障油樟資源高效利用值得深入思考和研究[7]。隨著多學(xué)科的相互滲透和交叉,生物技術(shù)與天然產(chǎn)物研究的結(jié)合日益密切,微生物輔助技術(shù)已經(jīng)開始作為生物預(yù)處理手段,應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離[8-10]。李軍集等[11]以桂葉渣為原料進(jìn)行生物發(fā)酵,結(jié)果發(fā)現(xiàn):發(fā)酵后桂葉渣的化學(xué)成分發(fā)生明顯變化,產(chǎn)生了其他具有揮發(fā)性芳香氣味的化學(xué)成分,該研究表明生物預(yù)處理使桂葉渣生成了酯、烯、醛等具有芳香氣味的有機(jī)化合物,使無(wú)味的桂葉渣具有了芳香氣味。梁開朝等[12]利用微生物菌株M-5對(duì)K326煙葉進(jìn)行預(yù)處理后,煙葉提取物中苯乙醇、丁酸乙酯等天然香精、精油成分顯著提高,該研究說(shuō)明M-5菌株不僅可以進(jìn)一步用于煙葉純化還具有生產(chǎn)香精香料的能力。因此,本研究以新鮮采集的油樟葉為研究對(duì)象,分別進(jìn)行水預(yù)處理、酵母菌預(yù)處理和復(fù)合菌預(yù)處理,并從精油提取得率、精油成分組成、油細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)等多方面探索預(yù)處理對(duì)油樟葉的影響,揭示生物預(yù)處理促進(jìn)油樟精油提取的潛在作用機(jī)制,以期為油樟葉生物預(yù)處理技術(shù)的開發(fā)提供理論參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮油樟葉,春季采集于四川省宜賓市翠屏區(qū)思坡鎮(zhèn)會(huì)詩(shī)村。油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H.W.Li.),樹齡10年。

無(wú)水乙醇、甲醇均為市售分析純;無(wú)菌水,上海麥克林生化科技有限公司;高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;腐熟劑,河南沃寶生物科技有限公司;PCR擴(kuò)增引物,美國(guó)Omega生物科技公司;AxyPrep DAN Gel提取試劑盒,美國(guó)Axygen生物科技公司。

島津GC-2014AF氣相色譜儀,配有Rtx-5型石英毛細(xì)管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 mm),FID檢測(cè)器,日本島津儀器有限公司;QuantiFluorTM-ST微型熒光計(jì),美國(guó)TurnerBio Systems公司;7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀,美國(guó)安捷倫公司;LD-UPW-V超純水制備儀;FZ102型植物粉碎機(jī);TGL-16B高速離心機(jī)。

1.2 油樟葉的生物預(yù)處理

1.2.1水預(yù)處理首先準(zhǔn)確稱取40 g新鮮的油樟葉置于燒杯中備用,然后準(zhǔn)確量取8 mL蒸餾水并均勻噴灑在油樟葉表面,平行制備4份;置于燒杯中,并用封口膜密封,陰涼的環(huán)境中靜置一周,預(yù)處理結(jié)束。

1.2.2酵母菌預(yù)處理首先準(zhǔn)確稱取40 g新鮮的油樟葉置于燒杯中備用,然后準(zhǔn)確稱量40 mg高活性干酵母菌溶解于8 mL蒸餾水中,迅速攪拌使其充分溶解,將酵母溶液均勻噴灑在油樟葉表面,平行制備4份;置于燒杯中,并用封口膜密封,陰涼的環(huán)境中靜置一周,預(yù)處理結(jié)束。

1.2.3復(fù)合菌預(yù)處理以腐熟劑作為復(fù)合菌種,參照1.2.2節(jié)的方式進(jìn)行預(yù)處理。同時(shí)準(zhǔn)確稱取40 g新鮮的油樟葉4份,不做任何處理,作為空白對(duì)照。

1.3 油樟精油的提取及成分研究

1.3.1精油的提取將油樟葉片適度粉碎,碎片約5 mm×5 mm,準(zhǔn)確稱量40 g粉碎后的葉片放入蒸餾器中,連接好揮發(fā)油提取器,開始加熱蒸餾,待揮發(fā)油提取器中有冷凝水流出開始計(jì)時(shí),5 h后停止加熱,收集上層精油,并精確稱質(zhì)量,在2～8℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。針?duì)3種預(yù)處理后的油樟葉和新鮮的油樟葉分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),以油樟葉片的濕質(zhì)量計(jì)算精油的提取得率。

1.3.2GC-MS分析 將提取所得油樟精油樣品用乙醇稀釋5倍,使用0.45μm濾頭過(guò)濾,采用7890A-5975C型GC-MS分析其化學(xué)成分和相對(duì)峰面積。GC-MS分析所采用的氣相色譜條件:色譜柱為石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);載氣為He,1.6 mL/min;進(jìn)樣口溫度為280℃;進(jìn)樣量為0.2μL;分流比為100∶1;色譜柱升溫程序?yàn)?0℃保持2 min,以5℃/min的速率升至280℃保持20 min。質(zhì)譜條件:EI電離源,電離源溫度為230℃,電子轟擊能量為70 eV,掃描質(zhì)核比范圍為50～500。

1.4 油樟油細(xì)胞形態(tài)研究

分別將油樟鮮葉和3種不同預(yù)處理后的油樟葉表面清洗干凈,在油樟葉片中下部且無(wú)葉脈處,剪取5 mm×5 mm的樣本,浸泡在5%的氫氧化鈉水溶液中,在65℃恒溫箱內(nèi)放置48 h。取出后先用水沖洗2次,然后于雙氧水中浸泡15 min,最后取出樣本置于載玻片上,小心蓋上蓋玻片,避免產(chǎn)生氣泡,盡快使用生物顯微鏡對(duì)處理好的樣本進(jìn)行觀察和拍攝。在10倍視野下拍攝樣本,并記錄油細(xì)胞數(shù)目作為該樣本中油細(xì)胞的密度[13]。

1.5 油樟葉內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)研究

1.5.1DNA提取 先用無(wú)菌水洗凈油樟葉表面的預(yù)處理溶液和灰塵,以75%的乙醇進(jìn)一步除去油樟葉表面的細(xì)菌,然后用無(wú)菌棉球吸干殘留在油樟葉表面的乙醇溶液,將油樟葉片適度粉碎,碎片約1 cm×1 cm。參照該方法將3種預(yù)處理后的油樟葉和新鮮的油樟葉完成滅菌,并將每組油樟葉均分成6份(每份6 g,總共24份)。最后使用MP-soil試劑盒,按照說(shuō)明書流程提取24份油樟葉樣本的內(nèi)生菌的DNA[14]。

1.5.2PCR擴(kuò)增和Miseq測(cè)序 使用引物799F(5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)和1193R(5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’)對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌16SrRNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增[15-17],利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化;然后利用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量,根據(jù)Illumina Miseq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE文庫(kù)(2×300 bp);最后利用Illumina公司的MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5.3生物信息學(xué)分析原始測(cè)序序列借助美吉生物交互式微生物群落多樣性云分析平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用RDPclassifier(版本號(hào):2.11)貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行物種分類注釋,通過(guò)比對(duì)16s細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)(Silva和RDP),統(tǒng)計(jì)油樟葉樣本經(jīng)過(guò)不同生物預(yù)處理后在綱水平含有何種微生物以及各種微生物的相對(duì)豐度。利用R語(yǔ)言(版本號(hào):3.3.1)vegan包對(duì)油樟葉樣本內(nèi)生菌群與生物預(yù)處理影響因子進(jìn)行距離冗余分析(dbRDA)和相關(guān)性熱圖分析(heatmap)分析,獲取菌群與生物預(yù)處理方式之間的關(guān)系,生物預(yù)處理影響因子見表1。

表1 生物預(yù)處理影響因子Table 1 Impact factor of biological pretreatment

2 結(jié)果與討論

2.1 油樟精油提取得率及成分分析

2.1.1油樟精油提取得率通過(guò)計(jì)算可知,新鮮油樟葉、水預(yù)處理油樟葉、酵母菌預(yù)處理油樟葉和復(fù)合菌預(yù)處理油樟葉的油樟精油提取得率(以濕質(zhì)量計(jì))分別為2.71%、2.97%、3.62%和4.06%。酵母菌預(yù)處理和復(fù)合菌預(yù)處理使得油樟精油提取得率提高分別提高了33.6%和49.8%,水預(yù)處理的作用效果不明顯。

2.1.2油樟精油化學(xué)成分將新鮮油樟葉、水預(yù)處理油樟葉、酵母菌預(yù)處理油樟葉和復(fù)合菌預(yù)處理油樟葉提取所得精油進(jìn)行GC-MS分析,通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)及Pub Med數(shù)據(jù)庫(kù),共鑒定出16個(gè)化合物,利用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)峰面積,結(jié)果見表2。

表2 不同生物預(yù)處理后樟葉精油的成分分析Table 2 Volatile compounds identified in C.longepaniculatum leaves after different pretreatment

由表2可知,不同預(yù)處理油樟葉及新鮮油樟葉精油的主要化學(xué)成分相同,1,8-桉葉素為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的成分,超過(guò)50%,其次為α-松油醇(＞20%),β-水芹烯5%左右,其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)1%的化合物分別為β-蒎烯、4-松油醇和γ-松油烯。生物預(yù)處理會(huì)導(dǎo)致主成分1,8-桉葉素的相對(duì)峰面積略有降低,β-蒎烯、α-松油醇和γ-松油烯成分略有提高。

2.2 油細(xì)胞形態(tài)分析

不同預(yù)處理油樟葉油細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡10倍視野下呈現(xiàn)的形態(tài)見圖1。

圖1 不同預(yù)處理后油樟葉片中油細(xì)胞形態(tài)(×10)Fig.1 Oil cell morphology in leaves of C.longepaniculatum under different pretreatment(×10)

由圖可知,油細(xì)胞以單個(gè)的形式分散于薄壁組織中,與其他組織細(xì)胞分布有明顯的區(qū)別。統(tǒng)計(jì)10倍視野下輪廓清晰的油細(xì)胞的數(shù)量作為細(xì)胞密度,結(jié)果表明:新鮮油樟葉(空白)、水預(yù)處理油樟葉、酵母菌預(yù)處理油樟葉和復(fù)合菌預(yù)處理油樟葉油細(xì)胞密度分別為(37±3)、(37±2)、(27±2)和(25±5)個(gè)/mm2。由圖1(c)可以看出,酵母菌預(yù)處理油樟葉的少部分油細(xì)胞在10倍視野下的細(xì)胞邊緣不明確,數(shù)量不便于統(tǒng)計(jì),因此導(dǎo)致油細(xì)胞密度降低。圖1(d)中大部分油細(xì)胞輪廓不清晰,導(dǎo)致復(fù)合菌預(yù)處理油樟葉的油細(xì)胞密度相對(duì)于新鮮油樟葉顯著降低。由此推測(cè):酵母菌和復(fù)合菌的預(yù)處理可能對(duì)油細(xì)胞的細(xì)胞壁造成一定程度的破壞,甚至導(dǎo)致油細(xì)胞的破裂,最終促進(jìn)了油樟精油提取得率的提高,并且復(fù)合菌的作用更明顯。

2.3 內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)在綱的水平上統(tǒng)計(jì)了不同預(yù)處理后油樟葉的內(nèi)生菌相對(duì)豐度,并與新鮮油樟葉進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見表3。

由表3可見,新鮮油樟葉(空白)、水預(yù)處理和酵母菌預(yù)處理油樟葉內(nèi)生菌以γ-變形菌為主,相對(duì)豐度均超過(guò)40%,其次為放線菌,相對(duì)豐度分別為15.22%、26.74%和22.94%。與新鮮油樟葉相比,水預(yù)處理油樟葉類桿菌相對(duì)豐度顯著提高,由2.64%提高到22.74%。與新鮮油樟葉相比,酵母菌預(yù)處理油樟葉α-變形菌相對(duì)豐度發(fā)生顯著性變化,由1.32%提高到6.04%。復(fù)合菌預(yù)處理對(duì)油樟葉內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)影響最明顯:1)α-變形菌的相對(duì)豐度接近50%,成為最主要的菌群;2)γ-變形菌的相對(duì)豐度下降至16%,導(dǎo)致其他菌群相對(duì)豐度均有所提高;3)藍(lán)細(xì)菌(17.88%)和酸桿菌(9.99%)的相對(duì)豐度相對(duì)于其他3組有顯著提高。由此表明:3種預(yù)處理方式對(duì)油樟葉的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)影響較大,其中γ-變形菌、α-變形菌、藍(lán)細(xì)菌和酸桿菌為受影響最大的菌群。

表3 不同預(yù)處理方式油樟葉片中內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)Table.3 Endophyte community structure in C.longepaniculatum under different pretreatment

2.3.2內(nèi)生菌群落與生物預(yù)處理的相關(guān)性為了進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)變化與生物預(yù)處理的相關(guān)性,在對(duì)不同預(yù)處理后油樟葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行距離冗余分析(dbRDA)時(shí),加入生物預(yù)處理影響因子(表1)進(jìn)行約束,分析結(jié)果見圖2。

通過(guò)樣本點(diǎn)的空間距離可以判斷樣本間的聚類情況,由圖2可知,4組樣本都有較好的聚類,表明同一組樣本中樣品間的差異較小。3個(gè)生物預(yù)處理組與空白組(B)都有分離,表明生物預(yù)處理對(duì)油樟內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。復(fù)合菌預(yù)處理組(C)和其他3組分離最明顯,說(shuō)明復(fù)合菌預(yù)處理對(duì)油樟內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的影響最顯著。上述結(jié)果與油樟葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。通過(guò)箭頭的長(zhǎng)短可以判斷影響因子對(duì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的程度,3種預(yù)處理方式影響程度的大小順序?yàn)閺?fù)合菌預(yù)處理＞酵母菌預(yù)處理(Y)=水預(yù)處理(W)。樣本點(diǎn)向生物預(yù)處理影響因子做垂線,投影點(diǎn)在箭頭方向上,表示為影響因子與樣本之間呈正相關(guān),反之呈負(fù)相關(guān),由圖2可知,復(fù)合菌預(yù)處理組的油樟葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)到影響因子向量的投影點(diǎn)在箭頭方向上,而大部分水預(yù)處理組和酵母菌預(yù)處理組的投影點(diǎn)不在影響因子向量箭頭方向上,表明只有復(fù)合菌預(yù)處理組的油樟葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)與影響因子呈正相關(guān)。

圖2 油樟葉內(nèi)生菌群落的距離冗余分析Fig.2 Distance-based redundancy analysis of bacterial community in C.longepaniculatum

在種水平上相對(duì)豐度前20的細(xì)菌是內(nèi)生菌群落的核心物種,本研究對(duì)核心物種進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析,獲得相關(guān)性P值,并用相關(guān)性熱圖直觀展現(xiàn)計(jì)算結(jié)果,如圖3,紅色部分表示正相關(guān),藍(lán)色部分表示負(fù)相關(guān)。圖3表明復(fù)合菌種的加入與多種核心內(nèi)生菌種顯著相關(guān),尤其是對(duì)浮霉菌、酸桿菌和梭狀芽孢桿菌豐度的影響最為顯著,并且呈現(xiàn)正相關(guān)。相關(guān)研究表明,酸桿菌和浮霉菌容易產(chǎn)生纖維素酶[18],因此可以推斷油樟葉內(nèi)生菌群中酸桿菌和浮霉菌相對(duì)豐度的提高促進(jìn)了油細(xì)胞的裂解,從而有助于油樟精油提取得率的提高。

圖3 內(nèi)生菌分類與預(yù)處理相關(guān)性熱圖Fig.3 Spearman correlation heatmap between pretreatment and bacterial community

3 結(jié) 論

3.1對(duì)新鮮油樟葉進(jìn)行生物預(yù)處理,然后提取油樟精油,并鑒定其化學(xué)成分。結(jié)果表明:酵母菌和復(fù)合菌預(yù)處理使油樟精油提取得率分別提高了33.6%和49.8%,水預(yù)處理的作用效果不明顯;生物預(yù)處理使主成分1,8-桉葉素的含量略有降低,β-蒎烯、α-松油醇和γ-松油烯含量略有提高。

3.2新鮮油樟葉,以及水、酵母菌和復(fù)合菌預(yù)處理油樟葉油細(xì)胞密度分別為(37±3)、(37±2)、(27±2)和(25±5)個(gè)/mm2。由于酵母菌和復(fù)合菌預(yù)處理導(dǎo)致細(xì)胞邊緣不明確、細(xì)胞輪廓不清晰,因此統(tǒng)計(jì)所得油細(xì)胞密度偏低。

3.33種預(yù)處理方式對(duì)油樟葉的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)影響較大,其中γ-變形菌、α-變形菌、藍(lán)細(xì)菌和酸桿菌為受影響最大的菌群,3種預(yù)處理方式對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)影響的程度從大到小順序?yàn)閺?fù)合菌預(yù)處理＞酵母菌預(yù)處理=水預(yù)處理,復(fù)合菌種的加入與多種核心內(nèi)生菌種顯著相關(guān),尤其是對(duì)浮霉菌、酸桿菌和梭狀芽孢桿菌豐度的影響最為顯著。