木糖酸輔助水解木聚糖制備低聚木糖及其分離與回收工藝研究

黃 天,張曉彤,趙江琳,郭健銘,周 鑫,徐 勇

(南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心;化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京210037)

低聚木糖(XOS),又稱木寡糖,是一類由2～7個(gè)木糖單元通過糖苷鍵連接而成的功能性糖,它具有比其他功能性寡糖更強(qiáng)的益生菌增殖能力,國際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(huì)于2017年明確了低聚木糖是有益于宿主健康的“超強(qiáng)益生元”[1]。目前,低聚木糖已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域,尤其在功能性食品和飼料中的應(yīng)用十分普遍[2]。低聚木糖的制備方法主要為含木聚糖原料的酶水解和酸水解,其中酶水解法反應(yīng)條件溫和且具有選擇性,但反應(yīng)周期長、成本高,相比之下,酸水解法工藝簡單、生產(chǎn)周期短,因此更適合低聚木糖的規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)[3]。其中無機(jī)酸與有機(jī)酸均可用于水解木聚糖制備低聚木糖,但無機(jī)酸通常為強(qiáng)酸,容易使木聚糖過度水解,造成木糖和糠醛等副產(chǎn)物大量累積,且無機(jī)酸更易腐蝕設(shè)備[4-6]。有機(jī)酸由于活化能較低,具有更高的選擇性,能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的可控生產(chǎn)[7],其中如乙酸、馬來酸和草酸等有機(jī)酸,均被報(bào)道可用于制備低聚木糖[8-10]。然而,酸法生產(chǎn)低聚木糖的主要缺陷在于酸水解木聚糖原料生成低聚木糖的同時(shí)會(huì)伴有大量的副產(chǎn)品木糖產(chǎn)生,因此,為提高低聚木糖產(chǎn)品純度通常需要通過物理或生物法將木糖脫除[11-12]。本課題組前期研究[13]表明利用氧化葡萄糖酸桿菌生物氧化作用可將木糖轉(zhuǎn)化為木糖酸,木糖酸是一種溫和無毒的水溶性有機(jī)酸,可以用于輔助水解木聚糖原料生產(chǎn)低聚木糖。為了探討木糖酸輔助水解木聚糖原料生產(chǎn)高純度低聚木糖的可行性,本研究首先通過響應(yīng)面法(RSM)對(duì)木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化以獲得最優(yōu)的低聚木糖得率,同時(shí)聯(lián)合使用氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵與電滲析分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)副產(chǎn)品木糖制備木糖酸,以及木糖酸與低聚木糖的分離,以期為建立一條基于可回收木糖酸的生產(chǎn)高純度低聚木糖的工藝路線提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯堿抽提木聚糖(純度70%),江蘇康維生物有限公司;木糖標(biāo)準(zhǔn)品、酵母粉,上海Sigma-Aldrich公司;木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)品,Megazyme公司;木糖酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所自制。其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L、山梨醇50 g/L、瓊脂20 g/L?；罨囵B(yǎng)基:酵母粉5 g/L、山梨醇50 g/L。增殖培養(yǎng)基為:酵母粉10 g/L、山梨醇100 g/L[14]。氧化葡萄糖酸桿菌(ATCC 621H),由美國ATCC提供,在-4℃下保存在斜面培養(yǎng)基上。

內(nèi)外循環(huán)恒溫?cái)?shù)顯不銹鋼油浴鍋;高效陰離子交換色譜ICS-3000(配備CarboPacTMPA200色譜柱和PAD檢測器)、Ledend Mach 1.6R型冷凍離心機(jī),美國賽默飛公司;自制電滲析裝置,配有聚苯醚雙極膜(膜面積90×210 mm2),山東天維膜技術(shù)有限公司;Agilent1260型高效液相色譜(HPLC),配備Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱及RID示差折光檢測器,美國安捷倫科技公司;Spectrumlab 752s型紫外可見分光光度(UV-Vis)計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1木聚糖酸水解將1.5 g木聚糖粉加入30 mL不銹鋼管式反應(yīng)器中,按固液比1∶10(g∶mL)加入15 mL木糖酸溶液,混合并潤脹1 h,隨后將密封罐體置于設(shè)定溫度的油浴中反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后將罐體置于冷水浴中迅速降溫,待冷卻后打開反應(yīng)器將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,在10 000 r/min離心5 min。收集上清液并分析低聚木糖(XOS)及副產(chǎn)物的含量,離心剩余固體渣廢棄。

1.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化選取木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、4%、8%、12%和16%)、反應(yīng)溫度(110、130、150、170和190℃)、反應(yīng)時(shí)間(5、20、35、50和65 min)做單因素試驗(yàn)分別考察這3個(gè)因素對(duì)XOS得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以反應(yīng)溫度(X1)、木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)和反應(yīng)時(shí)間(X3)為自變量,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平數(shù),以XOS得率(Y)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過Design-Expert(版本11.0)軟件,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型,以預(yù)測木糖酸水解木聚糖制備XOS的最佳條件。

1.2.3氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵水解液 將氧化葡萄糖酸桿菌菌種接入載有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在150 r/min、30℃下活化培養(yǎng)16 h;在5 000 r/min下對(duì)活化后的種子培養(yǎng)液離心5 min收集菌體,然后在超凈工作臺(tái)中將菌體接入裝有250 mL增殖培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中,在220 r/min、30℃下增殖培養(yǎng)20 h;在5 000 r/min條件下對(duì)增殖培養(yǎng)的菌液離心5 min后收集菌體。發(fā)酵選取在最優(yōu)木糖酸水解低聚木糖的條件下制備的酸水解液原液(即包含XOS、木糖與木糖酸的混合液)50 mL裝入250 mL的錐形瓶中,發(fā)酵前使用50%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)水解液原液的pH值至6.5,隨后接入4 g/L的氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞在220 r/min、30℃發(fā)酵12 h,發(fā)酵過程中采用50%NaOH調(diào)節(jié)pH值在5～7。

1.2.4電滲析分離發(fā)酵后的水解液(主要包含木糖酸鈉與XOS)電滲析過程具體可見圖1。在電極室中添加0.3 mol/L的硫酸鈉溶液以提高電導(dǎo)率并降低膜疊層的電阻,在自制的電滲析裝置中,額定電壓60 V、電流10 A、電流密度50 mA/cm2下試驗(yàn)30 min。首先,通過泵將鹽室中的發(fā)酵液直接泵入雙極膜電滲析裝置中,木糖酸根離子(XA-)通過陰離子交換膜運(yùn)輸?shù)剿崾?并與電解產(chǎn)生的H+結(jié)合后轉(zhuǎn)化為木糖酸(XA-H),同時(shí)在堿室中形成NaOH,最后含有XOS的水溶液可以保留在鹽室中[15]。

圖1 發(fā)酵水解液電滲析過程圖Fig.1 Diagram of electrodialysis process of fermentation hydrolysate

1.3 分析方法

1.3.1木聚糖含量測定木聚糖的含量采用美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)標(biāo)準(zhǔn)方法測定[16]。

1.3.2色譜分析采用高效陰離子交換色譜測定XOS、木糖和木糖酸的含量,以100 mmol/L的NaOH與500 mmol/L的醋酸鈉作為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,柱溫為30℃[17]。以木糖酸、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)分別測定樣品中各組分的含量。木糖、XOS和木糖酸的得率按照以下公式計(jì)算。

式中:yX—木糖得率,%;yXOS—低聚木糖得率,%;yXAH—木糖酸得率,%;m0—初始原料中木聚糖的總質(zhì)量,g;m1—水解液中木糖的總質(zhì)量,g;m2—水解液中木二糖至木六糖質(zhì)量總和,g;m3—發(fā)酵液中新增木糖酸的質(zhì)量,g;1.1—木糖至木糖酸的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酸水解單因素試驗(yàn)

前期研究[18]表明反應(yīng)溫度、酸濃度和水解時(shí)間是影響木聚糖水解的3個(gè)關(guān)鍵性因素,因此,首先分別探討了這3個(gè)工藝條件對(duì)木糖酸水解木聚糖制備低聚木糖的影響,主要結(jié)果如圖2所示。可見低聚木糖的得率在一定條件范圍內(nèi)(反應(yīng)溫度＜150℃、木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜8%、反應(yīng)時(shí)間＜35 min)會(huì)隨著條件的增強(qiáng)而提高;然而,隨著反應(yīng)條件的繼續(xù)增強(qiáng),低聚木糖會(huì)發(fā)生進(jìn)一步水解,導(dǎo)致副產(chǎn)物木糖的大量生成。因此,綜合考慮確定以反應(yīng)溫度130、150和170℃,木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、8%和12%,反應(yīng)時(shí)間10、35和60 min用于響應(yīng)面分析。

圖2 反應(yīng)條件對(duì)木聚糖降解的影響Fig.2 Effect of reaction conditions on xylan degradation

2.2 木聚糖酸水解的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定3因素3水平的試驗(yàn)組合,共運(yùn)行15組試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1,方差分析見表2。

表1 響應(yīng)面分析的結(jié)果Table 1 Results of response surface analysis

表2 響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)的方差分析Table 2 ANOVA for response surface model

由表2方差分析可知,一次項(xiàng)X1與二次項(xiàng)的P值小于0.05,表明其對(duì)低聚木糖得率影響顯著,的P值均小于0.01,表明對(duì)低聚木糖得率影響極顯著,根據(jù)P值大小判斷各因素對(duì)低聚木糖得率的影響大小為:反應(yīng)溫度＞木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞反應(yīng)時(shí)間。而交互項(xiàng)X2X3的P值小于0.05,表明其對(duì)低聚木糖得率影響顯著,X1X2、X1X3的P值均小于0.01,表明對(duì)低聚木糖得率具有極顯著影響。各項(xiàng)因素對(duì)低聚木糖得率影響經(jīng)回歸擬合后得到的二次多項(xiàng)回歸模型:該模型的F值為51.12(P＜0.01),表明方程達(dá)到極顯著。此外,該響應(yīng)面的分析決定系數(shù)R2值為0.936 3,在預(yù)期范圍,表明預(yù)測模型擬合性良好,且呈現(xiàn)合理的線性相關(guān)性;校正決定系數(shù)為0.974 1,進(jìn)一步說明模型擬合度良好。因此,該模型可用于對(duì)木糖酸輔助水解木聚糖制備低聚木糖進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2響應(yīng)曲面圖與等高線圖分析3個(gè)交互項(xiàng)X1X2、X1X3和X2X3均存在顯著的交互作用,其三維響應(yīng)曲面的等高線呈橢圓狀,表示任意2因素中某一因素(條件)的改變會(huì)影響到另一因素(條件)的選取。此外,如圖3所示,在保證低聚木糖得率的情況,高反應(yīng)溫度和短反應(yīng)時(shí)間的組合更適于木聚糖的水解,且效率更高。

圖3 兩因素交互作用對(duì)低聚木糖得率的影響Fig.3 Effects of interaction of any two factors on the yield of xylooligosaccharides

2.2.3優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用Design-Expert 11.0軟件,從回歸模型中求得木糖酸輔助水解木聚糖的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度170℃、木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.942%、反應(yīng)時(shí)間22.124 min,在此條件下模型預(yù)估的低聚木糖得率為55.7%。為便于實(shí)際操作,將參數(shù)修正為170℃、6.0%、22 min,并據(jù)此進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在此條件下,水解物中的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的質(zhì)量濃度分別為18.5、10.9、8.9、7.7、5.6和5.3 g/L,其中低聚木糖(木二糖～木六糖)總質(zhì)量濃度為38.4 g/L,對(duì)應(yīng)低聚木糖得率為54.9%,即實(shí)際測定結(jié)果值與理論值相差0.8個(gè)百分點(diǎn)(＜5%),該結(jié)果與預(yù)測值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明上述響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)合理,且具有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 木糖酸水解液的發(fā)酵與分離

2.3.1木糖發(fā)酵在最優(yōu)條件下進(jìn)行木聚糖的木糖酸輔助降解,可獲得包含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.85%木糖,3.8%低聚木糖與6%木糖酸的多組分混合水解液。為進(jìn)一步提升低聚木糖產(chǎn)品質(zhì)量,首先以氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)木糖酸,原水解液的各組分在細(xì)胞催化反應(yīng)中的變化如圖4所示,發(fā)酵12 h,18.5 g/L木糖被發(fā)酵為18.2 g/L的木糖酸(木糖酸的增量為1.8%),木糖利用率91.6%,木糖酸得率為90.9%,累積木糖酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)由初始6%提升至7.8%。此外,由圖4可以看出木糖僅被發(fā)酵為木糖酸而沒有進(jìn)一步分解代謝,且各低聚木糖組分在發(fā)酵過程中也未能被氧化葡萄糖酸桿菌利用,低聚木糖總的質(zhì)量濃度依然為38.4 g/L。綜上所述,經(jīng)過氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵,原水解液變?yōu)橐再|(zhì)量分?jǐn)?shù)7.8%木糖酸與3.8%低聚木糖為主的混合液。

2.3.2電滲析分離經(jīng)過氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵后,木糖酸水解液中主要成分為低聚木糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.8%)與木糖酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.8%),其中有效成分低聚木糖(聚合度2～6)約占干基成分的30%(干燥后測定)。Liu等[11]研究表明:通過雙極膜電滲析法可以有效實(shí)現(xiàn)水解液中組分的分離與同步回收,得到有機(jī)酸和低聚木糖。因此,為了進(jìn)一步提高低聚木糖成分的有效占比,通過電滲析對(duì)發(fā)酵過的水解液中的低聚木糖和木糖酸進(jìn)行分離和回收試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵液中近95%的木糖酸被分離并在酸室中回收,98%的低聚木糖仍然被保留水解液中。經(jīng)發(fā)酵與電滲析后的水解液中殘余的木糖酸與低聚木糖質(zhì)量濃度分別為3.91和37.6 g/L,即通過電滲析處理后,干燥處理,其低聚木糖(木二糖～木六糖)組分均占干基總質(zhì)量的75%。

3 結(jié) 論

3.1以低聚木糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化,得到木糖酸輔助水解木聚糖制備低聚木糖的最佳條件為:反應(yīng)溫度170℃,木糖酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,反應(yīng)時(shí)間22 min,該條件所獲得的低聚木糖的得率為54.9%。

3.2氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵和雙極膜電滲析分離實(shí)現(xiàn)了木聚糖酸水解液中副產(chǎn)物木糖的有效轉(zhuǎn)化以及木糖酸與低聚木糖的分離回收,其中木糖轉(zhuǎn)化率為91.6%,木糖酸回收率為95%,低聚木糖純度由30%提高到75%。