基于COI基因分析長(zhǎng)江下游典型水域翹嘴鲌的遺傳多樣性

張桂寧，方弟安

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,江蘇無(wú)錫 214081；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306)

翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)隸屬鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)鲌屬(Culter)，分布廣泛，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[1]。近年來(lái)針對(duì)翹嘴鲌的研究較多集中在形態(tài)特征[2]、營(yíng)養(yǎng)成分[3]、年齡結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)特性[4]、人工養(yǎng)殖[5]、育種[6]和遺傳多樣性[7]等方面，但基于COI基因?qū)βN嘴鲌自然種群間遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究較少[8]。魚類遺傳多樣性研究有利于了解現(xiàn)有物種的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為資源的合理利用和保護(hù)提供正確的理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)[9]。遺傳多樣性的研究方法有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等，基于分子水平的研究方法中，利用線粒體DNA作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳多樣性的研究較多[10]。魚類線粒體DNA(mtDNA)分子小且有長(zhǎng)度多態(tài)性、母系遺傳和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，是群體遺傳學(xué)中常用的遺傳標(biāo)記[11]。細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(COI)基因是線粒體DNA上的一段蛋白質(zhì)編碼基因，具有引物通用性高、長(zhǎng)度適宜和進(jìn)化速率適中等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究[12]。

長(zhǎng)江是我國(guó)淡水魚類的種質(zhì)資源庫(kù)和基因庫(kù)[13]，20世紀(jì)80年代以來(lái)，長(zhǎng)江魚類資源出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。實(shí)施長(zhǎng)江春季禁漁后，經(jīng)濟(jì)魚種所占比例明顯增多，較大規(guī)格經(jīng)濟(jì)魚類比例增加[14]。太湖是中國(guó)五大淡水湖之一，翹嘴鲌是著名的“太湖三白”之一。淀山湖和長(zhǎng)漾湖均是長(zhǎng)江下游的典型湖泊，是翹嘴鲌的適宜生存水域，生態(tài)地位突出，翹嘴鲌是上述湖區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)物種，近幾年翹嘴鲌群體資源呈現(xiàn)衰退嚴(yán)重，種群低齡化和小型化趨勢(shì)[15]。因此，本研究擬利用COI基因序列分析長(zhǎng)江水域江蘇段和長(zhǎng)江下游3個(gè)典型湖泊(淀山湖、太湖和長(zhǎng)漾湖)的翹嘴鲌群體的遺傳多樣性和遺傳變異，以期為翹嘴鲌群體進(jìn)行針對(duì)性保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

利用常規(guī)漁業(yè)資源調(diào)查的方法，使用定制絲網(wǎng)，分別于淀山湖(DSH)、太湖(TH)、長(zhǎng)漾湖(CYH)和長(zhǎng)江江蘇段(CJ)隨機(jī)捕獲翹嘴鲌，剪取尾鰭浸泡于95%的無(wú)水乙醇中保存，其中長(zhǎng)江江蘇段翹嘴鲌91尾，淀山湖66尾，太湖69尾，長(zhǎng)漾湖67尾，共計(jì)293尾，采樣水域如圖1所示。

圖1 翹嘴鲌采樣水域Fig.1 Sampling waters for C.alburnus

1.2 DNA提取

將備用的鰭條樣品剪取約30 mg的組織樣品于離心管中，使用試劑盒法提取DNA(海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒DP324，北京天根生化有限公司)，并用濃度1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，合格的DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR和DNA測(cè)序

依據(jù)翹嘴鲌線粒體基因序列(GenBank登錄號(hào)：KX244762.1)，利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)COI基因的引物,由亦欣生物科技(上海)有限公司合成。引物序列為COI-F:5′-CCGAACTTAGCCAACCCG-3′COI-R:5′-GACGGCGGTAATAAGGAC-3′。

PCR反應(yīng)體系:總體積25 μL,包括 dNTP Mixture 12 μL，上、下游引物各0.5 μL(50 μmol/L)，DNA 2 μL，ddH2O 10 μL。

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃結(jié)束。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，將條帶清晰、擴(kuò)增有效的PCR產(chǎn)物送亦欣生物科技(上海)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用MEGA7.0.26軟件中的Align by clustal W軟件進(jìn)行COI基因原始序列的比對(duì)、剪切。用DNASPv5[16]軟件計(jì)算群體單倍型，DNASPv5軟件進(jìn)行Tajima′sD和FuLiF的中性檢驗(yàn)，以衡量群體是否發(fā)生了擴(kuò)張。采用Arlequin3.5軟件[17]進(jìn)行遺傳多樣性、群體的分子方差分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)、遺傳距離和基因流(Nm)值的計(jì)算。在MEGA7.0.26軟件中以Kimura雙參數(shù)法(Kimura-2-parameter)為替代模型，采用Neighbour-joining(NJ)法構(gòu)建翹嘴鲌不同種群?jiǎn)伪缎偷姆肿泳垲悩?，從分支關(guān)系分析各群體之間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 線粒體COI堿基組成與序列變異分析

利用Clustal X軟件對(duì)測(cè)序所獲的目的片段進(jìn)行校對(duì)剪切，獲得長(zhǎng)度為816 bp的同源序列。4個(gè)群體共777個(gè)位點(diǎn)，共檢測(cè)到302個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的38.87%，定義了43個(gè)單倍型。COI序列中堿基A、T、C和G的平均含量分別為 26.3%、28.7%、26.8%和18.2%，其中T堿基含量最高，G堿基含量最低，且A+T的平均含量(55%)高于C+G的平均含量(45%)，表現(xiàn)出明顯的AT偏倚性。

2.2 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

293尾翹嘴鲌的單倍型多樣性是0.639～0.912，核苷酸多樣性是0.005 2～0.087 4(表1)。CJ群體總共91尾，34個(gè)單倍型，300個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單倍型多樣性是0.912±0.000 32，核苷酸多樣性0.087 4。所有湖泊的翹嘴鲌樣本共有293尾，單倍型多樣性是0.851±0.001 9，核苷酸多樣性是0.008 54；CYH群體共67尾，12個(gè)單倍型，172個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單倍型多樣性是0.877±0.000 36，核苷酸多樣性0.005 6；DSH群體共66尾，16個(gè)單倍型，261個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單倍型多樣性是0.855±0.001 07，核苷酸多樣性是0.047 2；TH群體共69尾，8個(gè)單倍型，54個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單倍型多樣性是0.639～0.912，核苷酸多樣性是0.005 2～0.087 4。CJ群體的遺傳多樣性最高，CYH群體次之，DSH群體和TH群體最低(表1)。

表1 基于COI基因序列的4個(gè)群體遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of four populations based on COI gene sequences

由MEGA7.0.26軟件中的Data-distance計(jì)算出的4個(gè)地理群體的遺傳距離(表2)，種內(nèi)遺傳距離的范圍是0.01～0.04(對(duì)角線黑體加粗)，其中TH群體的種內(nèi)遺傳距離是0.01，CJ群體的種內(nèi)遺傳距離最大，是0.04。4個(gè)群體的種間遺傳距離0.086～0.153，TH群體和CJ群體的種間遺傳距離最遠(yuǎn)是0.153。群體間的遺傳距離由大到小依次是CJ-TH>CYH-TH>CJ-DSH>DSH-TH>CYH-DSH>CJ-CYH(表3)。

表2 基于COI基因序列的不同翹嘴鲌群體遺傳距離Tab.2 Pairwise genetic distances of different C.alburnus populations based on COI gene sequences

表3 基于COI基因序列的4個(gè)群體間的遺傳分化參數(shù)Tab.3 Four populations genetic differentiation parameters based on COI gene sequences

翹嘴鲌4個(gè)不同地理群體基因流和遺傳分化指數(shù)如表4所示，兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)范圍為0.015 9～0.249 3。基因流值的范圍為0.772 3～15.473，其中CJ和TH群體的基因流值最小(0.7723)，CJ與CYH群體的基因流值最大(15.473)。AMOVA分析結(jié)果表明，來(lái)自于群體間的遺傳變異(10.16%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于翹嘴鲌群體內(nèi)的遺傳變異(89.84%)(表5)。

表4 基于COI基因序列的不同翹嘴鲌群體基因流與遺傳分化指數(shù)Tab.4 Gene flow and genetic differentiation index of different C.alburnus populations based on COI gene sequences

表5 基于COI基因序列的分子方差分析Tab.5 Analysis of molecular variance(AMOVA) based on COI gene sequences

293個(gè)翹嘴鲌個(gè)體共有43個(gè)單倍型，14個(gè)共享單倍型，其中Hap1在CJ群體、CYH群體和TH群體共享，Hap2、Hap5和Hap10在CJ和TH群體中共享，Hap3、Hap4和Hap6在4個(gè)群體中共享，Hap7在CJ群體、DSH群體和TH群體中共享，Hap8在CJ群體和DSH群體中共享，Hap9在CJ、CYH和DSH群體中共享，Hap12 和Hap19在CYH和DSH群體中共享，Hap13 和Hap14在CYH和TH群體中共享，其余29個(gè)單倍型分別在3個(gè)地理群體中獨(dú)有，占單倍型總數(shù)的67.44%， Hap11、Hap15～Hap18和Hap20在CYH群體中特有，Hap21～Hap27是DSH群體特有，Hap28～Hap43是TH群體特有(表6)。

應(yīng)用MEGA7.0.26軟件對(duì)293個(gè)翹嘴鲌個(gè)體的COI的序列進(jìn)行聚類分析，得出4個(gè)翹嘴鲌群體43個(gè)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。不同地理來(lái)源的單倍型總共分成2個(gè)大分支，不同地理群體的單倍型交叉散亂分布。

圖2 基于線粒體 COI基因序列構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ molecular phylogenetic tree based on COI gene sequences

2.3 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

翹嘴鲌4個(gè)群體的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CJ群體、TH群體和DSH群體的Tajima′sD均為負(fù)值，且DSH群體和TH群體差異顯著(表1)，CJ群體和DSH群體FuLiF均為負(fù)值，且DSH群體差異顯著。用DNASPv5軟件分析得到錯(cuò)配分布圖，圖中觀測(cè)值表現(xiàn)出多峰狀態(tài)(圖3)。

圖3 基于 COI基因序列的翹嘴鲌群體核苷酸不匹配分析Fig.3 Nucleotide mismatch analysis in the C.alburnus populations based on COI gene sequences

3 討論

3.1 不同群體翹嘴鲌的遺傳多樣性

本研究中COI序列中堿基A、T、C和G的平均含量分別為 26.3%、28.7%、26.8%和18.2%，其中T堿基含量最高，G堿基含量最低，與汪曦等[18]的研究結(jié)果一致，且A+T的平均含量(55%)高于 C+G的平均含量(45%)，與施文瑞等[19]的研究結(jié)果一致，符合脊椎動(dòng)物線粒體DNA的特點(diǎn)[20]。

在293個(gè)翹嘴鲌個(gè)體共有43個(gè)單倍型，每個(gè)群體特有的單倍型有29個(gè)，占單倍型總數(shù)的67.44%，不同地理群體享有較多的特有單倍型，說(shuō)明可能蘊(yùn)藏著較大的進(jìn)化潛能和更豐富的種質(zhì)資源[21]。小規(guī)模魚類群體快速擴(kuò)張后其群體通常表現(xiàn)為高的單倍型和中或低的核苷酸多樣性[19]。本研究中4個(gè)群體均表現(xiàn)高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，說(shuō)明這些水域的翹嘴鲌群體可能沒有受到環(huán)境壓力的影響。翹嘴鲌群體中性檢驗(yàn)Tajima′sD為負(fù)值，但差異不顯著，加之整體的錯(cuò)配分布圖是多峰[21]，因此推測(cè)該翹嘴鲌群體沒有經(jīng)歷種群擴(kuò)張。

由Grant等[21]的研究可知，單倍型多樣性與核苷酸多樣性的臨界值分別為0.5和0.005，值越大則表明遺傳多樣性越高。本研究中4個(gè)翹嘴鲌群體均表現(xiàn)出高的遺傳多樣性(0.851) 和高的核苷酸多樣性(0.057 0)。這一結(jié)果與王丹等[8]利用線粒體COI基因序列研究的三峽庫(kù)區(qū)鲌屬魚類具有高的核苷酸多樣性0.030 1(Pi>0.005)和較高的單倍型多樣性0.986 9(Hd>0.5)一致，與黃小彧[13]的結(jié)果(Hd為0.866，Pi為0.003 30) 存在差異，造成這種差異的原因可能是不同群體翹嘴鲌的種質(zhì)資源狀況不同所致[14]。本研究結(jié)果與楊子拓等[22]研究珠江翹嘴鲌的遺傳多樣性結(jié)果一致(Hd為0.875 1，Pi為0.007 0)，都表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性。

太湖水域地理位置優(yōu)越，然而到20世紀(jì)80年代以來(lái)，太湖水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，翹嘴鲌等漁獲物產(chǎn)量下降，隨著水域保護(hù)強(qiáng)度的增大，增殖放流等措施的開展，太湖魚類資源有一定程度的增加[15]。本研究表明，太湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性高于前期的研究結(jié)果[23]。自2006年，漁業(yè)主管部門對(duì)淀山湖持續(xù)進(jìn)行翹嘴鲌?jiān)鲋撤帕鞯葷O業(yè)資源保護(hù)措施，其資源量明顯增加[24]，其遺傳多樣性水平也一直保持較高水平。2018年長(zhǎng)漾湖被列為第三批國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，翹嘴鲌成為該水域禁捕保護(hù)對(duì)象之一，加大魚類保護(hù)力度是保護(hù)魚類遺傳多樣性的主要方法[25]?？梢姡茖W(xué)的漁業(yè)資源增殖放流和合理的資源保護(hù)策略可以有效地提高物種的遺傳多樣性水平。

3.2 群體遺傳分化分析

遺傳分化系數(shù)(Fst)是反映群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)[26,27]，較高水平的Fst表明群體間具有較高水平的遺傳分化，F(xiàn)st為0～0.05時(shí)為低度分化，0.05～0.15為中度分化，0.15～0.25為高度分化。本研究中4個(gè)不同的地理群體的兩兩群體之間的Fst均為正值(0.015 9～0.249 3)，CJ群體和CYH群體之間(Fst=0.015 9)與CYH群體和DSH群體間(Fst=0.036 5<0.05)，呈現(xiàn)低度遺傳分化；DSH群體與CJ群體之間(Fst=0.066 6)和DSH群體與TH群體之間(Fst=0.092 7)呈現(xiàn)中度分化，TH群體與其它群體之間遺傳分化指數(shù)較大，介于0.0927～0.2493，但不存在顯著性差異。從地圖上看，4個(gè)水域的相對(duì)距離較近但不能形成頻繁的基因交流，結(jié)合翹嘴鲌4個(gè)群體的遺傳距離結(jié)果分析可見，地理距離與遺傳距離沒有明顯的相關(guān)關(guān)系[28]。

3.3 翹嘴鲌的保護(hù)管理

本研究中長(zhǎng)江流域江蘇段及其下游湖泊的翹嘴鲌不同群體，遺傳多樣性程度較高，每個(gè)群體都可作為一個(gè)保護(hù)單位。對(duì)比其他有關(guān)翹嘴鲌的遺傳多樣性研究，本研究為第一次對(duì)上述水域翹嘴鲌種群進(jìn)行多樣性檢測(cè)，尚不能準(zhǔn)確界定近年來(lái)人工捕撈和增殖放流對(duì)其遺傳多樣性的影響，因此后續(xù)研究需要進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)江流域較多江段和更多的典型淡水湖泊開展翹嘴鲌的資源調(diào)查和詳細(xì)的遺傳多樣性評(píng)估研究，根據(jù)遺傳多樣性的變化趨勢(shì)采取相應(yīng)的保護(hù)措施。

綜上所述，本研究基于COI基因分析翹嘴鲌不同群體遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)翹嘴鲌群體均表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，結(jié)果表明，本研究的研究水域可能蘊(yùn)含較大進(jìn)化潛能和豐富的翹嘴鲌種質(zhì)資源，研究結(jié)果可以為今后翹嘴鲌遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。然而僅選擇單個(gè)線粒體基因的分子標(biāo)記和有限個(gè)體難以反映真正的群體遺傳關(guān)系，其真實(shí)親緣關(guān)系的探究仍需結(jié)合較多分子標(biāo)記和樣本進(jìn)行深入研究。因此，在翹嘴鲌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中，尋找遺傳信息豐富和進(jìn)化速率適宜的基因序列和可靠的分子標(biāo)記方法仍是今后此項(xiàng)研究工作的重點(diǎn)任務(wù)之一。