硫磺菌子實(shí)體多糖的提取及其抗氧化活性

楊 娟, 林佩婷, 賴瀅妮, 吳敏文, 劉新銳, 江玉姬,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 福州 350000；3.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002)

大型真菌的次生代謝產(chǎn)物豐富多樣，部分具有顯著的生物活性，是開發(fā)新藥或特效藥的重要來源[1].其中，真菌多糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，且具有良好的生物活性，已成為當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域共同關(guān)注的焦點(diǎn)[2].

硫磺菌(Laetiporussulphureus)又名硫磺多孔菌，是一種珍稀藥食兼用的大型真菌[3-4].硫磺菌含有多糖、三萜等活性成分[5].研究表明，硫磺菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等功效[6]；閆梅霞等[7]發(fā)現(xiàn)，硫磺菌菌絲體粗多糖對(duì)小鼠Lewis肺癌具有一定的體內(nèi)抑制作用；王娟等[8]發(fā)現(xiàn)，硫磺菌發(fā)酵液產(chǎn)物有抗菌作用；胡亞平等[3]研究了硫磺菌多糖的分離純化方法，且發(fā)現(xiàn)純化后的硫磺菌多糖對(duì)胃癌有一定抑制作用.

多糖主要以熱水、微波、有機(jī)溶劑及超聲輔助等方法提取[9-11].其中，超聲輔助提取是利用超聲引起的空化效應(yīng)，使原料的微顆粒發(fā)生碰撞，增加溶劑的提取面積，從而釋放出活性成分[12].超聲波提取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、提取條件溫和、提取物結(jié)構(gòu)不被破壞等優(yōu)點(diǎn)[13].此外，各提取方法可以通過優(yōu)化工藝參數(shù)達(dá)到提高得率的目的.常見的優(yōu)化方法有正交設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面法:正交設(shè)計(jì)有局限性，選取的代表點(diǎn)并不能完全反映整體情況，且獲得的最佳結(jié)果只是測(cè)試水平的其中一種組合；而響應(yīng)面法將數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合后，以圖形表達(dá)函數(shù)關(guān)系，使結(jié)果簡(jiǎn)單明了，易于發(fā)現(xiàn)各影響因素與得率的交互關(guān)系[14-16].目前，有關(guān)硫磺菌子實(shí)體多糖(polysaccharides from the fruiting body ofL.sulphureus, LSP)提取條件的優(yōu)化鮮見報(bào)道.本試驗(yàn)以超聲輔助法提取LSP，以響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，以期為后續(xù)的LSP結(jié)構(gòu)鑒定和免疫活性的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

硫磺菌子實(shí)體購(gòu)買于黑龍江省雙鴨山繞河供應(yīng)商.

DPPH標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司；乙醇、鄰苯三酚、Tris-HCl緩沖溶液、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽緩沖溶液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、抗壞血酸(分析純)購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；離心機(jī)，Thermo Scientific ST40；KQ-500VDE超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；UV-2601紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 LSP提取 硫磺菌子實(shí)體粉末制備：將硫磺菌子實(shí)體在70 ℃烘箱中烘2 h，用植物粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩，備用.

LSP的提取參照侯笑笑等[17]的水提醇沉法，并稍作修改.精確稱取10 g硫磺菌子實(shí)體粉末，超聲波輔助提取2次(料液比1∶20、提取時(shí)間50 min、提取溫度50 ℃ 超聲頻率55 kHz)，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原來體積的1/3，加入5倍體積無水乙醇，4 ℃條件下靜置12 h，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄除上清液；采用Sevage法除蛋白[18]，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，去離子水進(jìn)行透析，真空冷凍干燥后即得到LSP.

1.2.2 單因素試驗(yàn) 稱取5份10 g硫磺菌子實(shí)體粉末,依次放入1～5編號(hào)的錐形瓶中，考察料液比(1∶10、1∶15 、1∶20、1∶25、1∶30)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時(shí)間(30、40、50、60、70 min)對(duì)LSP得率的影響，每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值.

1.2.3 優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken的中心組合方法，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)作為考察因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)試驗(yàn)水平(表1).

表1 Box-Behnken中心試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Behnken design

1.2.4 LSP得率的計(jì)算 LSP得率的計(jì)算公式[19]:LSP得率/%=LSP質(zhì)量/硫磺菌粉末質(zhì)量×100.

1.2.5 LSP體外抗氧化活性測(cè)定 (1)LSP對(duì)DPPH自由基的清除率:參照Tang et al[20]的方法略作修改，分別配制不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)樣品溶液.取上清液1 mL，分別加0.1 mmol·L-1DPPH(1 mL)充分混勻，避光靜置30 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，記為Di值；同一操作條件下，用1 mL 95%乙醇代替DPPH溶液與1 mL樣品混合均勻?yàn)闃悠穮⒈纫?，記為Dj值； 1 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇混合液為空白對(duì)照，記為D0值.Vc為陽(yáng)性對(duì)照，每組至少重復(fù)3次.按以下公式計(jì)算LSP對(duì)DPPH自由基的清除率.

DPPH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(1)

式中：Di為樣品管的光密度，Dj為樣品參比液的光密度，D0為空白對(duì)照的光密度.

(2)LSP對(duì)羥基(·OH)自由基的清除率:參考Liu et al[21]的方法稍作修改，配制不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)樣品溶液.在試管中分別加入0.3 mL水楊酸鈉(20 mmol·L-1)、1.0 mL硫酸亞鐵(1.5 mmol·L-1)、1.0 mL不同濃度的樣品溶液和0.7 mL H2O2(6 mmol·L-1)，迅速混勻，37 ℃避光反應(yīng)1 h，于 510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度，記為Di值；同一操作條件下，以55%乙醇代替水楊酸鈉溶液為樣品參比液，記為Dj值；以55%乙醇代替樣品為空白對(duì)照，記為D0值.以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，每組至少重復(fù)3次.按照以下公式計(jì)算LSP對(duì)·OH自由基的清除率.

·OH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(2)

式中：Di為樣品管的光密度，Dj為樣品參比液的光密度，D0為空白對(duì)照的光密度.

(3)

式中：Di為樣品管的光密度，D0為空白對(duì)照的光密度.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果和抗氧化活性結(jié)果作圖，用Design Expert 8.0軟件對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果作響應(yīng)面圖和等高線圖，用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著,半最大效應(yīng)濃度(EC50)通過Graphpad 7.0軟件計(jì)算.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)LSP得率的影響 由圖1A可知：當(dāng)料液比在1∶10～1∶20之間時(shí)，隨著料液比的增大，LSP的得率逐漸增大；當(dāng)料液比為1∶20時(shí)(提取溫度50 ℃、提取時(shí)間50 min)，LSP得率達(dá)到最大值(8.42%)，顯著高于其他料液比的LSP得率(P<0.05)；當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，LSP得率顯著降低(P<0.05).因此，選取料液比為1∶20.

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)LSP得率的影響 設(shè)定料液比1∶20、提取溫度50 ℃，測(cè)定提取時(shí)間對(duì)LSP得率的影響.由圖1B可知：當(dāng)提取時(shí)間為30～50 min時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，LSP得率逐漸增大；當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，LSP得率達(dá)到最大值(8.51%)；當(dāng)提取時(shí)間大于50 min時(shí)，LSP得率顯著下降.因此，選取提取時(shí)間為50 min.

2.1.3 提取溫度對(duì)LSP得率的影響 設(shè)定料液比1∶20、提取時(shí)間50 min，測(cè)定提取溫度對(duì)LSP得率的影響.如圖1C所示：當(dāng)提取溫度為30～50 ℃時(shí)，隨著溫度升高，LSP得率逐漸增大；當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，LSP得率達(dá)到最大值(8.53%)；當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí)，LSP得率顯著下降.因此，選取50 ℃為適宜提取溫度.

A.料液比；B.提取時(shí)間；C.提取溫度. 圖中不同字母表示在0.05水平上差異顯著，相同字母表示差異不顯著.圖1 LSP提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor experiment results of LSP extraction

2.2 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert對(duì)BBD(Box-Behnken)試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合分析，得到回歸方程：Y=8.2+0.13A+0.2B+0.24C-0.18AB+0.051AC-0.12BC-0.58A2-0.43B2-0.57C2，方差分析見表3.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design matrix and results of Box-Behnken design experiment

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析1)Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

由圖2可知，響應(yīng)面均向下開口且曲面較陡，隨著各因素的水平逐漸提高，LSP得率先增加后減少，均出現(xiàn)LSP得率的最大值.料液比與提取時(shí)間、料液比與提取溫度、提取時(shí)間與提取溫度的等高線均呈橢圓形，說明各因素交互作用對(duì)LSP得率的影響顯著，這與表3中結(jié)果相符合.

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Interactive response surface and contour map of various factors

應(yīng)用分析軟件Design Expert 8.0，由RSM(響應(yīng)曲面法)預(yù)測(cè)最優(yōu)值，給出優(yōu)化后的LSP提取條件：料液比為1∶20.46，提取時(shí)間為51.89 min，提取溫度為51.95 ℃，預(yù)測(cè)的LSP得率為8.24%.

為便于操作，將最佳提取條件設(shè)置為料液比1∶20、提取時(shí)間50 min、提取溫度50 ℃進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，LSP平均得率為8.12%.與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差小于1%，說明上述模型能較好地反映LSP得率與其影響因素之間的關(guān)系.

2.3 LSP體外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力 由圖3A可知，隨著LSP質(zhì)量濃度增大，其對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，LSP質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)的清除率達(dá)到95.05%.這說明LSP對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力，但清除率略低于Vc. LSP清除DPPH自由基率的EC50為1.26 mg·mL-1.

2.3.2 清除·OH自由基能力 由圖3B可知，LSP對(duì)·OH自由基具有一定的清除作用，且清除率隨LSP質(zhì)量濃度的增大而提高，LSP質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)的清除率達(dá)到98.16%.LSP清除·OH自由基的EC50為3.67 mg·mL-1.

A.DPPH自由基清除率；B.·OH自由基清除率；自由基清除率.圖3 LSP的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of LSP

3 討論與結(jié)論

本研究基于實(shí)驗(yàn)室條件對(duì)LSP的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但如果將其應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，則可能存在局限性.在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)綜合考慮提取條件的適用性和各種因素的合理性.此外，LSP得率與各因素之間的具體作用關(guān)系尚不清楚，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)行深入研究，以為硫磺菌資源的高效利用提供更多理論依據(jù).