非洲豬瘟病毒逃避宿主天然免疫機制的研究進展

洪錦旋, 李婷婷, 池曉娟, 陳吉龍, 王 松

(福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002)

1 非洲豬瘟研究現(xiàn)狀

1.1 非洲豬瘟的流行史

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)最初于20世紀20年代在肯尼亞暴發(fā)，隨后在南非和東非地區(qū)迅速蔓延；1957年該病首次在非洲以外的地區(qū)(葡萄牙)暴發(fā)，隨后歐洲的一些國家都報道了ASF疫情；2007年，ASF傳入高加索地區(qū)的格魯吉亞，之后進一步跨地域傳播，并逐漸演變?yōu)榈胤叫粤餍胁1].由于確診和防控不及時，ASF在國與國之間廣泛傳播，嚴重影響了該病流行地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展.2018年8月3日我國沈陽發(fā)現(xiàn)首例ASF病例，該病在接下來幾個月內(nèi)蔓延至全國[2].但我國還沒有出現(xiàn)大面積的ASF疫情，大部分疫情為點狀散發(fā).目前，ASF已在亞洲地區(qū)廣泛傳播，2018—2019年越南、柬埔寨等其他亞洲國家相繼報道了ASF暴發(fā)的案例[3].

1.2 非洲豬瘟病毒的分子病原學

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是一種結(jié)構(gòu)復雜的雙股線狀DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，病毒結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次為外囊膜、衣殼、內(nèi)囊膜、核殼以及類核.Wang et al[4]解析了該病毒的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病毒的衣殼由主要的衣殼蛋白p72和4個次要衣殼蛋白M1249L、p17、p49和H240R組成.其基因組長度在170(BA71V毒株)～193 kb(Kenya 1950毒株)之間，能夠編碼151～167種蛋白，基因組長度及編碼蛋白數(shù)量取決于編碼的多基因家族的數(shù)量.根據(jù)衣殼蛋白p72可以將ASFV分為24個基因型[5].分子流行病學研究表明，在我國傳播的ASFV毒株屬于基因Ⅱ型、血清學8型，與格魯吉亞、俄羅斯、波蘭公布的全基因組序列同源性達99.5%左右[6].

1.3 宿主抗ASFV天然免疫應答的機制

天然免疫應答是機體對抗病原體的第一道防線，對防止病原微生物入侵至關(guān)重要.天然免疫不僅可以消滅大量的病原體，還能激活機體的適應性免疫反應[6].哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)可通過激活宿主的模式識別受體消滅入侵的病原體并引發(fā)相關(guān)免疫反應[7].目前已發(fā)現(xiàn)Toll-like receptors(TLRs)、C-type lectin receptors(CLRs)、NOD-like receptors(NLRs)、RIG-I-like Receptors(RLRs)以及DNA相關(guān)受體等5種模式識別受體.這些模式識別受體被激活后，能夠啟動多種天然免疫信號通路，誘導促炎細胞因子和干擾素(interferons, IFNs)的產(chǎn)生[8].

對外來DNA的識別是宿主防御病原微生物最基本的機制之一，宿主細胞已經(jīng)進化出相應策略檢測來自病原體的DNA.在這個過程中，細胞內(nèi)的酶cGMP-AMP synthase(cGAS)是不可或缺的.它與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合后，啟動一系列受到嚴格調(diào)控的信號級聯(lián)反應，誘導干擾素等細胞因子的表達，從而觸發(fā)機體的防御機制[9].研究發(fā)現(xiàn):ASFV感染能夠激活cGAS-STING信號通路，誘導STING和IRF3的磷酸化，刺激下游IFNβ的表達和分泌;但是,ASFV強毒株對cGAS-STING信號通路的激活作用遠低于弱毒株，并且在感染6 h后強毒株對STING和IRF3的激活作用完全消失[10].這可能與STING的磷酸化和胞內(nèi)轉(zhuǎn)導有關(guān).然而，目前還未發(fā)現(xiàn)調(diào)控該過程的ASFV蛋白.ASFV編碼的蛋白質(zhì)還能夠抑制除cGAS-STING外的天然免疫信號通路，但這些信號通路是否參與抵抗ASFV感染還需要進一步研究.

干擾素誘導的宿主天然免疫應答是一種復雜的早期防御機制，其功能是對抗病原微生物感染，并協(xié)助啟動適應性免疫反應[11].許多病毒感染能刺激宿主細胞產(chǎn)生干擾素，干擾素信號再介導下游的干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的轉(zhuǎn)錄；隨后這些ISGs將靶向病毒復制的各個階段，發(fā)揮抗病毒作用.IFNα和IFNγ預處理非傳代豬肺泡巨噬細胞(PAM)后，能抑制ASFV在細胞中的復制；同樣，家豬在感染ASFV后肌肉注射IFNα和IFNγ能夠誘導下游的ISG15、OASL、CXCL10等ISGs的表達，這有效抑制了ASFV在家豬體內(nèi)的復制[12-13].

病毒在適應宿主的過程中會不斷進化，許多病毒如Influenza A virus(IAV)、Hepatitis C virus(HCV)等已經(jīng)進化出能夠逃避、破壞或直接干擾其宿主干擾素信號通路的策略[14-15].ASFV也編碼了多個能夠調(diào)控干擾素表達的蛋白.

1.4 逃避宿主抗ASFV天然免疫應答的蛋白

ASFV是一種免疫抑制病毒.試驗表明：ASFV強毒株在感染早期能通過抑制干擾素和細胞因子的分泌逃避宿主的天然免疫系統(tǒng)；在感染后期，ASFV能夠誘導細胞因子大量表達，形成細胞因子風暴，導致感染家豬體內(nèi)實質(zhì)器官的損傷[16].

ASFV能夠編碼抑制TLR信號通路的相關(guān)病毒蛋白.ASFV編碼的I329L蛋白能與TLR3信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白Toll/IL-1R domain-containing adaptor-inducing IFN-β(TRIF)互作，使下游的核轉(zhuǎn)錄因子不能被激活，從而抑制IFNβ和CCL5的表達[17].但是，該研究只在Vero細胞上證明了I329L的功能，該蛋白在ASFV宿主細胞上的功能還需要進一步研究.

A238L是一種典型的多功能蛋白，它能通過多種途徑調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子的活性.首先，A238L蛋白能與p300氨基末端的拓撲結(jié)構(gòu)域(topologically associated domains， TAD)相結(jié)合，使p300的Ser384位點磷酸化受到干擾.p300蛋白能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用并增強其反式激活.當p300的磷酸化被抑制時，受其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(NF-ATC2、NF-κB以及C-Jun)乙?；突钚员灰种?，導致下游多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄受到影響，如TNF-α、COX2等[18].其次，A238L與豬的IκB-α的同源性為40%，其能夠與NF-κB相互作用，使NF-κB不能與DNA結(jié)合，從而影響炎癥因子的產(chǎn)生[19].再次，A238L通過競爭性地與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶結(jié)合，占據(jù)其底物結(jié)合位點，進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，導致下游的細胞因子(如IL-2)合成減少[20].

ASFV多基因家族蛋白在病毒感染中也具有重要作用.MGF360和MGF505家族位于ASFV基因組兩端的高度可變區(qū)，與ASFV的毒力密切相關(guān).MGF360和MGF505家族的某些成員缺失能夠使ASFV的毒力下降；同時，缺失多基因家族能夠使干擾素及ISGs(如ISG15、IFIT1、ISG43)的表達顯著上升：這提示多基因家族MGF360和MGF505具有拮抗宿主天然免疫反應的功能[21-22].研究證實，MGF505家族的A528R和MGF360家族的A276R、MGF360-12L都能夠抑制干擾素的產(chǎn)生，但是這3種蛋白的作用機制并不相同.A276R能夠通過調(diào)控IRF3信號通路抑制poly(I∶C)誘導的干擾素分泌；A528R不僅能夠抑制干擾素的產(chǎn)生，還能夠抑制下游JAK-STAT信號通路的激活[23].研究表明，ASFV缺失MGF360-12L基因時能夠誘導IFN-I產(chǎn)生[22].在這基礎(chǔ)上Zhuo et al[24]研究發(fā)現(xiàn)，MGF360-12L基因能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB入核，該功能可能是通過MGF360-12L上的核內(nèi)定位序列(nuclear localization signal, NLS)與Karyopherins家族的核轉(zhuǎn)運蛋白Importin α2 (KPNA2)、Importin α4 (KPNA3)和 Importin α3 (KPNA4)相互作用實現(xiàn)的.

O′Donnell et al[25]研究發(fā)現(xiàn)，將ASFV中的DP96R基因和B119L基因進行雙敲除，能夠成功制備ASFV弱毒株，對感染家豬起到一定的保護作用.接種這種基因缺失疫苗的家豬在發(fā)病過程中血清中干擾素水平有所回升[22,24].已有研究證實，在細胞中高表達DP96R基因能夠抑制TBK1的磷酸化，使cGAS-STING-TBK1信號通路受到干擾，從而抑制干擾素啟動子的激活[26].目前，有關(guān)B119L基因的作用機理尚不清楚.

EP420R基因編碼的CD2v蛋白位于ASFV外囊膜，與ASFV引起的紅細胞吸附現(xiàn)象密切相關(guān).CD2v蛋白與T淋巴細胞和NK細胞表面的糖蛋白受體CD2具有同源性.試驗表明，感染缺失EP420R基因的ASFV后，家豬發(fā)病延遲，并且在其淋巴結(jié)內(nèi)分離到的ASFV滴度下降，而淋巴結(jié)是ASFV在機體內(nèi)的一級復制場所，因此EP420R基因在病毒入侵機體及調(diào)控機體免疫方面起著重要作用[27].但具體的作用機制還有待深入研究.

雖然目前已經(jīng)報道了多種ASFV編碼的蛋白(表1)能夠抑制宿主天然免疫反應，但是這些蛋白的作用機制及其在其他方面的功能仍在研究之中.

表1 非洲豬瘟病毒編碼的免疫逃避蛋白Table 1 Immune escape proteins encoded by African swine fever virus

2 基于ASFV逃避宿主天然免疫機制的基因缺失疫苗研發(fā)進展

ASFV編碼了大量拮抗宿主天然免疫反應的蛋白，如DP96R及多基因家族MGF505和MGF360的基因等，這些基因被用于設(shè)計有效的基因缺失疫苗.滅活苗及亞單位疫苗已被證實不能為家豬提供有效的保護[28-29]，而基因缺失疫苗是一種可行的保護方式.

單基因缺失疫苗的研究通常選擇敲除病毒的毒力因子.從BA71毒株中敲除編碼CD2v的EP402R基因不僅能夠為家豬抗ASFV提供一定的保護作用，還可以提供有效的交叉保護，但是該弱毒疫苗存在一定的生物安全隱患[28-29].B119L和DP148R基因缺失疫苗雖然能夠?qū)Σ糠衷囼灱邑i產(chǎn)生保護作用，但是存在使免疫家豬帶毒的問題[30-31].A238L單基因缺失疫苗，雖然能夠在同基因型強毒株的感染下保護家豬，但是存在隱性感染及保護作用不全面的問題；A276R、EP153R、A224L基因缺失疫苗在接種過程中可能使家豬出現(xiàn)慢性感染，并且這些基因缺失疫苗都不能產(chǎn)生有效的交叉保護作用[32].

多基因缺失疫苗的設(shè)計大多與多基因家族MGF360和MGF505有關(guān).雖然敲除這些基因能夠?qū)邑i產(chǎn)生一定的保護作用，但并不能提供完全的保護作用[33].因此，多基因缺失疫苗的設(shè)計除了針對多基因家族的成員，還涉及其他ASFV基因，如同時敲除多基因家族MGF360和MGF505的成員及B119L基因，這種基因缺失疫苗安全性雖然較之前的疫苗有所提升，但是在親本強毒株Georgia 2007的感染中并不能為家豬提供有效的保護作用[34].最新研究表明，在敲除多基因家族MGF505和MGF360成員的同時敲除EP420R基因能夠為家豬提供有效的保護作用，并且這種弱毒疫苗的安全性得到了大幅度提升[35].

3 小結(jié)與展望

ASFV擁有龐大的基因組，編碼多個調(diào)控宿主天然免疫應答的基因，從而使病毒成功入侵機體.ASFV能夠通過多種途徑調(diào)控干擾素的合成，如通過抑制STING和TBK1的磷酸化干擾cGAS-STING信號通路、與TRIF蛋白結(jié)合抑制TLR3信號通路等.但是，是否存在cGAS-STING以外的其他信號通路參與抵抗ASFV的感染還需要進一步探討；同時，ASFV逃避宿主天然免疫反應的機制尚不明確.因此，尋找能夠調(diào)控宿主天然免疫反應的ASFV蛋白并解析其作用機制是ASFV研究的熱點和重點.

雖然基因缺失疫苗仍存在安全性等問題，但就現(xiàn)有的研究成果來看，基因缺失疫苗是防治ASF較為可行的研究方向.然而，基因缺失疫苗普遍存在缺少交叉保護的問題，可能會加大疫苗研發(fā)的難度.加快ASFV編碼蛋白的功能研究，有助于研發(fā)更加安全、有效的疫苗.當然，隨著科學技術(shù)的深入發(fā)展，越來越多的技術(shù)被應用于疫苗的生產(chǎn)中，如mRNA疫苗，這將進一步推動ASFV疫苗的研發(fā)，促進ASF的防控工作.