非洲豬瘟病毒逃避宿主天然免疫機(jī)制的研究進(jìn)展

洪錦旋, 李婷婷, 池曉娟, 陳吉龍, 王 松

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002)

1 非洲豬瘟研究現(xiàn)狀

1.1 非洲豬瘟的流行史

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)最初于20世紀(jì)20年代在肯尼亞暴發(fā)，隨后在南非和東非地區(qū)迅速蔓延；1957年該病首次在非洲以外的地區(qū)(葡萄牙)暴發(fā)，隨后歐洲的一些國家都報(bào)道了ASF疫情；2007年，ASF傳入高加索地區(qū)的格魯吉亞，之后進(jìn)一步跨地域傳播，并逐漸演變?yōu)榈胤叫粤餍胁1].由于確診和防控不及時(shí)，ASF在國與國之間廣泛傳播，嚴(yán)重影響了該病流行地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展.2018年8月3日我國沈陽發(fā)現(xiàn)首例ASF病例，該病在接下來幾個(gè)月內(nèi)蔓延至全國[2].但我國還沒有出現(xiàn)大面積的ASF疫情，大部分疫情為點(diǎn)狀散發(fā).目前，ASF已在亞洲地區(qū)廣泛傳播，2018—2019年越南、柬埔寨等其他亞洲國家相繼報(bào)道了ASF暴發(fā)的案例[3].

1.2 非洲豬瘟病毒的分子病原學(xué)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙股線狀DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，病毒結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次為外囊膜、衣殼、內(nèi)囊膜、核殼以及類核.Wang et al[4]解析了該病毒的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病毒的衣殼由主要的衣殼蛋白p72和4個(gè)次要衣殼蛋白M1249L、p17、p49和H240R組成.其基因組長度在170(BA71V毒株)～193 kb(Kenya 1950毒株)之間，能夠編碼151～167種蛋白，基因組長度及編碼蛋白數(shù)量取決于編碼的多基因家族的數(shù)量.根據(jù)衣殼蛋白p72可以將ASFV分為24個(gè)基因型[5].分子流行病學(xué)研究表明，在我國傳播的ASFV毒株屬于基因Ⅱ型、血清學(xué)8型，與格魯吉亞、俄羅斯、波蘭公布的全基因組序列同源性達(dá)99.5%左右[6].

1.3 宿主抗ASFV天然免疫應(yīng)答的機(jī)制

天然免疫應(yīng)答是機(jī)體對(duì)抗病原體的第一道防線，對(duì)防止病原微生物入侵至關(guān)重要.天然免疫不僅可以消滅大量的病原體，還能激活機(jī)體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[6].哺乳動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)可通過激活宿主的模式識(shí)別受體消滅入侵的病原體并引發(fā)相關(guān)免疫反應(yīng)[7].目前已發(fā)現(xiàn)Toll-like receptors(TLRs)、C-type lectin receptors(CLRs)、NOD-like receptors(NLRs)、RIG-I-like Receptors(RLRs)以及DNA相關(guān)受體等5種模式識(shí)別受體.這些模式識(shí)別受體被激活后，能夠啟動(dòng)多種天然免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和干擾素(interferons, IFNs)的產(chǎn)生[8].

對(duì)外來DNA的識(shí)別是宿主防御病原微生物最基本的機(jī)制之一，宿主細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出相應(yīng)策略檢測來自病原體的DNA.在這個(gè)過程中，細(xì)胞內(nèi)的酶cGMP-AMP synthase(cGAS)是不可或缺的.它與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合后，啟動(dòng)一系列受到嚴(yán)格調(diào)控的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)干擾素等細(xì)胞因子的表達(dá)，從而觸發(fā)機(jī)體的防御機(jī)制[9].研究發(fā)現(xiàn):ASFV感染能夠激活cGAS-STING信號(hào)通路，誘導(dǎo)STING和IRF3的磷酸化，刺激下游IFNβ的表達(dá)和分泌;但是,ASFV強(qiáng)毒株對(duì)cGAS-STING信號(hào)通路的激活作用遠(yuǎn)低于弱毒株，并且在感染6 h后強(qiáng)毒株對(duì)STING和IRF3的激活作用完全消失[10].這可能與STING的磷酸化和胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān).然而，目前還未發(fā)現(xiàn)調(diào)控該過程的ASFV蛋白.ASFV編碼的蛋白質(zhì)還能夠抑制除cGAS-STING外的天然免疫信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路是否參與抵抗ASFV感染還需要進(jìn)一步研究.

干擾素誘導(dǎo)的宿主天然免疫應(yīng)答是一種復(fù)雜的早期防御機(jī)制，其功能是對(duì)抗病原微生物感染，并協(xié)助啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[11].許多病毒感染能刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾素信號(hào)再介導(dǎo)下游的干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的轉(zhuǎn)錄；隨后這些ISGs將靶向病毒復(fù)制的各個(gè)階段，發(fā)揮抗病毒作用.IFNα和IFNγ預(yù)處理非傳代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)后，能抑制ASFV在細(xì)胞中的復(fù)制；同樣，家豬在感染ASFV后肌肉注射IFNα和IFNγ能夠誘導(dǎo)下游的ISG15、OASL、CXCL10等ISGs的表達(dá)，這有效抑制了ASFV在家豬體內(nèi)的復(fù)制[12-13].

病毒在適應(yīng)宿主的過程中會(huì)不斷進(jìn)化，許多病毒如Influenza A virus(IAV)、Hepatitis C virus(HCV)等已經(jīng)進(jìn)化出能夠逃避、破壞或直接干擾其宿主干擾素信號(hào)通路的策略[14-15].ASFV也編碼了多個(gè)能夠調(diào)控干擾素表達(dá)的蛋白.

1.4 逃避宿主抗ASFV天然免疫應(yīng)答的蛋白

ASFV是一種免疫抑制病毒.試驗(yàn)表明：ASFV強(qiáng)毒株在感染早期能通過抑制干擾素和細(xì)胞因子的分泌逃避宿主的天然免疫系統(tǒng)；在感染后期，ASFV能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子大量表達(dá)，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致感染家豬體內(nèi)實(shí)質(zhì)器官的損傷[16].

ASFV能夠編碼抑制TLR信號(hào)通路的相關(guān)病毒蛋白.ASFV編碼的I329L蛋白能與TLR3信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白Toll/IL-1R domain-containing adaptor-inducing IFN-β(TRIF)互作，使下游的核轉(zhuǎn)錄因子不能被激活，從而抑制IFNβ和CCL5的表達(dá)[17].但是，該研究只在Vero細(xì)胞上證明了I329L的功能，該蛋白在ASFV宿主細(xì)胞上的功能還需要進(jìn)一步研究.

A238L是一種典型的多功能蛋白，它能通過多種途徑調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子的活性.首先，A238L蛋白能與p300氨基末端的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域(topologically associated domains， TAD)相結(jié)合，使p300的Ser384位點(diǎn)磷酸化受到干擾.p300蛋白能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用并增強(qiáng)其反式激活.當(dāng)p300的磷酸化被抑制時(shí)，受其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(NF-ATC2、NF-κB以及C-Jun)乙?；突钚员灰种疲瑢?dǎo)致下游多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄受到影響，如TNF-α、COX2等[18].其次，A238L與豬的IκB-α的同源性為40%，其能夠與NF-κB相互作用，使NF-κB不能與DNA結(jié)合，從而影響炎癥因子的產(chǎn)生[19].再次，A238L通過競爭性地與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶結(jié)合，占據(jù)其底物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，導(dǎo)致下游的細(xì)胞因子(如IL-2)合成減少[20].

ASFV多基因家族蛋白在病毒感染中也具有重要作用.MGF360和MGF505家族位于ASFV基因組兩端的高度可變區(qū)，與ASFV的毒力密切相關(guān).MGF360和MGF505家族的某些成員缺失能夠使ASFV的毒力下降；同時(shí)，缺失多基因家族能夠使干擾素及ISGs(如ISG15、IFIT1、ISG43)的表達(dá)顯著上升：這提示多基因家族MGF360和MGF505具有拮抗宿主天然免疫反應(yīng)的功能[21-22].研究證實(shí)，MGF505家族的A528R和MGF360家族的A276R、MGF360-12L都能夠抑制干擾素的產(chǎn)生，但是這3種蛋白的作用機(jī)制并不相同.A276R能夠通過調(diào)控IRF3信號(hào)通路抑制poly(I∶C)誘導(dǎo)的干擾素分泌；A528R不僅能夠抑制干擾素的產(chǎn)生，還能夠抑制下游JAK-STAT信號(hào)通路的激活[23].研究表明，ASFV缺失MGF360-12L基因時(shí)能夠誘導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生[22].在這基礎(chǔ)上Zhuo et al[24]研究發(fā)現(xiàn)，MGF360-12L基因能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB入核，該功能可能是通過MGF360-12L上的核內(nèi)定位序列(nuclear localization signal, NLS)與Karyopherins家族的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importin α2 (KPNA2)、Importin α4 (KPNA3)和 Importin α3 (KPNA4)相互作用實(shí)現(xiàn)的.

O′Donnell et al[25]研究發(fā)現(xiàn)，將ASFV中的DP96R基因和B119L基因進(jìn)行雙敲除，能夠成功制備ASFV弱毒株，對(duì)感染家豬起到一定的保護(hù)作用.接種這種基因缺失疫苗的家豬在發(fā)病過程中血清中干擾素水平有所回升[22,24].已有研究證實(shí)，在細(xì)胞中高表達(dá)DP96R基因能夠抑制TBK1的磷酸化，使cGAS-STING-TBK1信號(hào)通路受到干擾，從而抑制干擾素啟動(dòng)子的激活[26].目前，有關(guān)B119L基因的作用機(jī)理尚不清楚.

EP420R基因編碼的CD2v蛋白位于ASFV外囊膜，與ASFV引起的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象密切相關(guān).CD2v蛋白與T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的糖蛋白受體CD2具有同源性.試驗(yàn)表明，感染缺失EP420R基因的ASFV后，家豬發(fā)病延遲，并且在其淋巴結(jié)內(nèi)分離到的ASFV滴度下降，而淋巴結(jié)是ASFV在機(jī)體內(nèi)的一級(jí)復(fù)制場所，因此EP420R基因在病毒入侵機(jī)體及調(diào)控機(jī)體免疫方面起著重要作用[27].但具體的作用機(jī)制還有待深入研究.

雖然目前已經(jīng)報(bào)道了多種ASFV編碼的蛋白(表1)能夠抑制宿主天然免疫反應(yīng)，但是這些蛋白的作用機(jī)制及其在其他方面的功能仍在研究之中.

表1 非洲豬瘟病毒編碼的免疫逃避蛋白Table 1 Immune escape proteins encoded by African swine fever virus

2 基于ASFV逃避宿主天然免疫機(jī)制的基因缺失疫苗研發(fā)進(jìn)展

ASFV編碼了大量拮抗宿主天然免疫反應(yīng)的蛋白，如DP96R及多基因家族MGF505和MGF360的基因等，這些基因被用于設(shè)計(jì)有效的基因缺失疫苗.滅活苗及亞單位疫苗已被證實(shí)不能為家豬提供有效的保護(hù)[28-29]，而基因缺失疫苗是一種可行的保護(hù)方式.

單基因缺失疫苗的研究通常選擇敲除病毒的毒力因子.從BA71毒株中敲除編碼CD2v的EP402R基因不僅能夠?yàn)榧邑i抗ASFV提供一定的保護(hù)作用，還可以提供有效的交叉保護(hù)，但是該弱毒疫苗存在一定的生物安全隱患[28-29].B119L和DP148R基因缺失疫苗雖然能夠?qū)Σ糠衷囼?yàn)家豬產(chǎn)生保護(hù)作用，但是存在使免疫家豬帶毒的問題[30-31].A238L單基因缺失疫苗，雖然能夠在同基因型強(qiáng)毒株的感染下保護(hù)家豬，但是存在隱性感染及保護(hù)作用不全面的問題；A276R、EP153R、A224L基因缺失疫苗在接種過程中可能使家豬出現(xiàn)慢性感染，并且這些基因缺失疫苗都不能產(chǎn)生有效的交叉保護(hù)作用[32].

多基因缺失疫苗的設(shè)計(jì)大多與多基因家族MGF360和MGF505有關(guān).雖然敲除這些基因能夠?qū)邑i產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，但并不能提供完全的保護(hù)作用[33].因此，多基因缺失疫苗的設(shè)計(jì)除了針對(duì)多基因家族的成員，還涉及其他ASFV基因，如同時(shí)敲除多基因家族MGF360和MGF505的成員及B119L基因，這種基因缺失疫苗安全性雖然較之前的疫苗有所提升，但是在親本強(qiáng)毒株Georgia 2007的感染中并不能為家豬提供有效的保護(hù)作用[34].最新研究表明，在敲除多基因家族MGF505和MGF360成員的同時(shí)敲除EP420R基因能夠?yàn)榧邑i提供有效的保護(hù)作用，并且這種弱毒疫苗的安全性得到了大幅度提升[35].

3 小結(jié)與展望

ASFV擁有龐大的基因組，編碼多個(gè)調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答的基因，從而使病毒成功入侵機(jī)體.ASFV能夠通過多種途徑調(diào)控干擾素的合成，如通過抑制STING和TBK1的磷酸化干擾cGAS-STING信號(hào)通路、與TRIF蛋白結(jié)合抑制TLR3信號(hào)通路等.但是，是否存在cGAS-STING以外的其他信號(hào)通路參與抵抗ASFV的感染還需要進(jìn)一步探討；同時(shí)，ASFV逃避宿主天然免疫反應(yīng)的機(jī)制尚不明確.因此，尋找能夠調(diào)控宿主天然免疫反應(yīng)的ASFV蛋白并解析其作用機(jī)制是ASFV研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn).

雖然基因缺失疫苗仍存在安全性等問題，但就現(xiàn)有的研究成果來看，基因缺失疫苗是防治ASF較為可行的研究方向.然而，基因缺失疫苗普遍存在缺少交叉保護(hù)的問題，可能會(huì)加大疫苗研發(fā)的難度.加快ASFV編碼蛋白的功能研究，有助于研發(fā)更加安全、有效的疫苗.當(dāng)然，隨著科學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，越來越多的技術(shù)被應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)中，如mRNA疫苗，這將進(jìn)一步推動(dòng)ASFV疫苗的研發(fā)，促進(jìn)ASF的防控工作.