不同肩袖肌腱損傷動(dòng)物模型建立與評(píng)價(jià)

于承浩 王磊 彭海寧 張益 于騰波

[摘要] 目的 應(yīng)用兔肩胛下肌肌腱建立肩袖肌腱不同損傷自然愈合模型，并進(jìn)行生物力學(xué)、組織學(xué)評(píng)價(jià)。

方法 將18只4周齡兔隨機(jī)分為部分組、新月組和L型組，分別建立左側(cè)肩胛下肌部分損傷、新月型損傷和L型損傷模型，右側(cè)實(shí)施假手術(shù)作為對(duì)照側(cè)。術(shù)后4個(gè)月采用蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色觀察肌腱愈合情況，采用強(qiáng)力儀檢測(cè)肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度。

結(jié)果 兔肩胛下肌不同損傷模型建立成功，HE、Masson染色可見各組損傷部位被瘢痕組織填充。生物力學(xué)強(qiáng)度測(cè)試顯示，部分組、L型組與新月組比較，實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大負(fù)荷百分比、實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)楊氏模量百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.292、18.876，P<0.05）。

結(jié)論 不同肩袖損傷方式對(duì)肩袖自然愈合可產(chǎn)生不同影響，新月型損傷愈合較部分損傷及L型損傷更好。

[關(guān)鍵詞] 回旋套損傷;腱;模型，動(dòng)物;兔

[中圖分類號(hào)] R684.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）05-0703-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.142

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1546.004.html;2021-07-07 10：29：40

ESTABLISHMENT OF ANIMAL MODELS OF DIFFERENT ROTATOR CUFF TENDON INJURIES AND THEIR EVALUATIONS

YU Chenghao， WANG Lei， PENG Haining， ZHANG Yi， YU Tengbo

（Department of Sports Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT] Objective To establish natural healing models of different rotator cuff tendon injuries using the subscapularis tendons of rabbits， and to perform biomechanical and histological evaluations.

Methods Eighteen 4-week-old rabbits were randomly divided into partial group， crescent group， and L-shaped group， in which partial injury， crescent injury， and L-shaped injury were made in the subscapularis muscle on the left side， while sham procedures were performed on the right side as controls. At 4 months after operation， hematoxylin-eosin （HE） staining and Masson staining were performed to observe the tendon healing; the biomechanical strength of the tendons was measured by a strength analyzer.

Results Different subscapularis injury models were established successfully. HE and Masson staining showed scar tissue filling in the injured parts in each group. The biological strength testing showed that the partial group and the L-shaped group had significant differences in the percentages of maximum load and Youngs modulus on the experimental side/control side as compared with the crescent group （F=36.292，18.876;P<0.05）.

Conclusion

Different types of rotator cuff injuries have different effects on the natural healing of rotator cuffs， and crescent injuries heal better than partial injuries and L-shaped injuries.

[KEY WORDS] rotator cuff injuries; tendons; models， animal; rabbits

肩袖撕裂是肩袖及其鄰近軟組織損傷的總稱，可以導(dǎo)致肩的疼痛和功能障礙。肩袖由岡上肌、岡下肌、肩胛下肌和小圓肌的肌腱以及肩關(guān)節(jié)囊等組成，對(duì)限制肩關(guān)節(jié)的過度活動(dòng)和維持功能穩(wěn)定性具有重要作用。肩袖撕裂在肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中占有很大的比例。在美國(guó)每年超過25萬人因?yàn)榧缧鋼p傷接受了手術(shù)治療，并且肩袖損傷的發(fā)生率逐年增加[1-2]。肩袖撕裂的類型往往不同，根據(jù)Ellman分型可將肩袖撕裂分為新月型撕裂、L型撕裂、反L型撕裂、梯形撕裂和巨大型撕裂[3]。不同的撕裂類型可導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)。

目前，有多種動(dòng)物可以被用作比較與評(píng)價(jià)不同類型肩袖損傷愈合狀況的模型動(dòng)物，例如大鼠[4]、兔[5-6]、狗[7-8]、小牛[9]和綿羊[10-12]等。研究表明，雖然大鼠岡上肌在向前運(yùn)動(dòng)過程中會(huì)穿過纖維骨隧道，但是，穿過該隧道的是肌肉而不是肌腱[13]。此外，大鼠的岡上肌太小，造模困難。兔體型居中，價(jià)格低廉，易于飼養(yǎng)，目前兔肩袖已有多處肌腱用于肩袖損傷模型的建立，包括岡上肌[14-15]、岡下肌[16]以及肩胛下肌[17]。

其中兔肩胛下肌肌腱與人岡上肌肌腱的位置與解剖結(jié)構(gòu)相似，大小尚可，適合制備肩袖損傷模型進(jìn)行研究[18]。故本研究以兔為模型動(dòng)物，建立肩胛下肌的部分損傷、L型損傷和新月型損傷模型，通過生物力學(xué)與組織學(xué)評(píng)價(jià)，分析不同撕裂類型對(duì)肩袖損傷自然愈合的影響，以探尋適合今后實(shí)驗(yàn)的肩袖損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用18只體質(zhì)量2.0～3.0 kg的成年雄性新西蘭大白兔由青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;美國(guó)Instron-3300萬能材料試驗(yàn)機(jī)由青島大學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 將18只大白兔隨機(jī)分為部分組、L型組和新月組，每組6只。以大白兔左側(cè)肩胛下肌為實(shí)驗(yàn)側(cè)，右側(cè)肩胛下肌為對(duì)照側(cè)。應(yīng)用100 g/L水合氯醛（2.5 mL/kg）行腹腔注射麻醉，待兔角膜反射及夾捏反應(yīng)消失后，將兔固定于手術(shù)臺(tái)上，進(jìn)行備皮、碘附消毒，鋪無菌洞巾。于肩關(guān)節(jié)部位注射20 g/L利多卡因2 mL進(jìn)行局部麻醉。于肩關(guān)節(jié)外側(cè)做一長(zhǎng)約3 cm縱形切口，分離三角肌及岡上肌，顯露肩胛下肌。測(cè)量兔肩胛下肌肌腱在肱骨小結(jié)節(jié)止點(diǎn)寬度;部分組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處滑囊側(cè)切斷約50%;L型組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處一側(cè)切斷約50%;新月組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處中間部分切斷約50%（圖1）。逐層縫合，關(guān)閉切口，覆蓋紗布。對(duì)照側(cè)進(jìn)行假手術(shù)，顯露肩胛下肌肌腱后關(guān)閉切口。術(shù)后給予青霉素4×105 U后肢肌注預(yù)防感染，持續(xù)3 d;允許兔籠內(nèi)自由活動(dòng)，未見活動(dòng)障礙。

1.2.2 組織學(xué)觀察 術(shù)后4個(gè)月，從3組中各取1只兔，以左側(cè)肩胛下肌損傷處為中心，截取肩胛下肌肌腱損傷處組織，用于觀察肌腱愈合情況。標(biāo)本經(jīng)冷凍、包埋后切成6 μm厚的連續(xù)切片。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色，在光鏡下觀察肩胛下肌肌腱損傷后愈合的組織學(xué)變化。

1.2.3 生物力學(xué)測(cè)試 術(shù)后4個(gè)月，從3組中各取5只兔，以肩胛下肌止點(diǎn)為中心，截取整塊肩胛下肌及近端肱骨（雙側(cè)全部截?。?，處理肩胛下肌肌肉，留肌腱與近端肱骨，進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。肌腱側(cè)采用“三明治”（砂紙-萬能膠-肌腱-萬能膠-砂紙）方法固定，近端肱骨采用麻繩固定。調(diào)整合適后，在美國(guó)Instron-3300萬能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行拉力測(cè)試，載荷率為0.4 mm/s，詳細(xì)觀察記錄肩胛下肌肌腱被拉斷時(shí)的斷裂部位、最大載荷（N）及楊氏模量（MPa）。為消除個(gè)體間的差異，以肩胛下肌實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大載荷及實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)楊氏模量的百分比作為生物力學(xué)強(qiáng)度指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組整體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)（LSD法）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 組織學(xué)觀察

2.1.1 大體觀察 肌腱損傷處可清晰辨認(rèn)，部分可見結(jié)節(jié)形成，肌肉周圍出現(xiàn)脂肪浸潤(rùn)，未見明顯肌肉萎縮（圖2a～c）。

2.1.2 染色觀察 部分組實(shí)驗(yàn)側(cè)HE染色可見損傷處被致密結(jié)締組織填充，與周圍正常肌腱組織分界清晰;Masson染色可見損傷處結(jié)締組織排列紊亂，膠原含量較正常肌腱組織少（圖2d、g）。新月組實(shí)驗(yàn)側(cè)HE染色可見損傷處組織較正常肌腱組織疏松，走行不規(guī)則;Masson染色可見損傷處膠原含量與周圍正常組織接近，但組織更為疏松（圖2e、h）。L型組實(shí)驗(yàn)側(cè)HE染色可見致密結(jié)締組織堆積，與周圍正常組織分界清晰;Masson染色可見損傷處結(jié)締組織排列不規(guī)則，膠原含量較周圍正常肌腱組織少（圖2f、i）。

2.2 生物力學(xué)測(cè)試

在生物力學(xué)拉伸測(cè)試中，3組標(biāo)本在承受最大負(fù)荷時(shí)的撕裂部位均為手術(shù)損傷處。3組肩胛下肌實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大載荷及實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)楊氏模量的百分比相比較，差異均具有顯著性（F=36.292、18.876，P<0.05）。組間兩兩比較，部分組和L型組肩胛下肌實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大載荷百分比均顯著低于新月組（t=8.023、6.494，P<0.05），而部分組與L型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.529，P>0.05）;同樣，部分組和L型組肩胛下肌的實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大楊氏模量百分比均顯著低于新月組（t=5.781、4.963，P<0.05），而部分組與L型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.088，P>0.05）。見表1。

3 討? 論

兔肩胛下肌已被證明具有與人類岡上肌相似的解剖學(xué)和生物力學(xué)特性[19]。同時(shí)，兔的體型中等，價(jià)格低廉，飼養(yǎng)方便，具有進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的天然優(yōu)勢(shì)。不同的是，人肩關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜和活動(dòng)范圍大，肩袖肌腱的血運(yùn)少，因此人的肩袖撕裂一般很難愈合[20]。本研究以兔為模型動(dòng)物，建立了兔肩胛下肌肌腱損傷的3種動(dòng)物模型（部分、新月、L型），并使其自然愈合，探討不同的損傷類型對(duì)肩袖損傷自然愈合的影響。

肌腱細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型膠原和糖蛋白組成。Ⅰ型膠原約占所有膠原蛋白的95%，占肌腱干質(zhì)量的65%～80%[21]。其他類型膠原蛋白的含量雖然較低，但也起著重要作用。肌腱損傷后，損傷部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞可清除并稀釋有害物質(zhì)，防止損傷的進(jìn)一步發(fā)展，新生血管形成為運(yùn)輸修復(fù)所需的大量氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及凝血因子等提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在正常的組織愈合過程中，炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入損傷部位，消化并清除凝塊，提供生長(zhǎng)因子，且成纖維細(xì)胞逐漸增多，血管增多，氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送得到滿足;在肌腱重塑過程中，肉芽組織逐漸被新合成的膠原所替代，成纖維細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，最終形成細(xì)胞密度較低的瘢痕組織。Ⅲ型膠原的合成在早期的修復(fù)過程中會(huì)有所增加，但隨著新的Ⅰ型膠原的合成并參與組織修復(fù)過程，Ⅲ型膠原會(huì)逐漸減少[22]。

本研究中，損傷后愈合部位的組織主要為致密的瘢痕組織，且其抗拉能力較正常肌腱組織弱。這一結(jié)果與BUTLER等[23]的研究報(bào)道相同。一項(xiàng)涉及綿羊模型跟腱橫斷和部分切除的研究結(jié)果表明，傷口部位似乎可在沒有術(shù)后固定的情況下自動(dòng)愈合，并在12個(gè)月內(nèi)獲得了足夠的穩(wěn)定性，而不需要手術(shù)重新建立組織連接[24]。所有的綿羊在至少6周后都恢復(fù)了部分負(fù)重能力，并且在至少8周后沒有表現(xiàn)出跛行或步態(tài)限制，然而與正常組織相比，傷口部位仍然較弱（承受最大載荷較低）。另一項(xiàng)兔臏腱損傷模型實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在造成髕腱缺損損傷僅1.5個(gè)月后，修復(fù)組織就達(dá)到了正常組織最大載荷的7%～9%，然而，到損傷后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，修復(fù)組織最大載荷分別僅為正常組織的11%和8%[25]。本研究結(jié)果表明，不同肌腱損傷所致的肩袖損傷自然愈合結(jié)果是不同的。部分損傷和L型損傷后，肩胛下肌實(shí)驗(yàn)側(cè)/對(duì)照側(cè)最大載荷百分比均低于新月型損傷，3組間楊氏模量比較也得到相同的結(jié)果。其主要原因是肩袖損傷類型的不同，不同的損傷類型可導(dǎo)致肌腱下肌不同程度的收縮，損傷處分離，出現(xiàn)缺口，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)締組織浸潤(rùn)的范圍不同。其中以L型損傷收縮最為明顯，因此結(jié)締組織填充較多，愈合后承受負(fù)荷的能力較弱。新月型損傷愈合良好的原因可能是，兩邊的肌腱組織為結(jié)締組織的浸潤(rùn)填充起到了框架的作用，肩胛下肌收縮較少。損傷愈合較差的次要原因是脂肪浸潤(rùn)，脂肪浸潤(rùn)是肩袖撕裂中肩袖肌肉的主要退行性改變之一，且已被證明對(duì)肌腱修復(fù)愈合的結(jié)果有負(fù)面影響[26]。脂肪浸潤(rùn)的一個(gè)可能原因是肌腱損傷后肌肉萎縮，牽拉神經(jīng)，使神經(jīng)肌軸受損，繼而出現(xiàn)脂肪細(xì)胞堆積浸潤(rùn)[6]。本實(shí)驗(yàn)缺陷為樣本量小且未對(duì)脂肪浸潤(rùn)進(jìn)行定量檢測(cè);另外，與人不同的是，兔肩關(guān)節(jié)基本不進(jìn)行外展活動(dòng)，而人的肩關(guān)節(jié)損傷后有可能活動(dòng)范圍增大而導(dǎo)致進(jìn)一步損傷。

綜上所述，本研究建立了不同類型兔肩袖損傷模型，并進(jìn)行了生物力學(xué)與組織學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明不同損傷類型對(duì)肩袖損傷自然愈合的影響不同，新月型損傷愈合較部分損傷及L型損傷更好。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，可建立不同時(shí)間的不同類型的肩袖損傷模型，探究損傷類型對(duì)肌腱脂肪浸潤(rùn)的影響;或是建立不同損傷類型模型后，給予相同的修復(fù)處理，觀察不同損傷類型對(duì)修復(fù)效果的影響。

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（本文編輯 馬偉平）