11501例不同臨床指征單胎孕婦NIPT臨床應(yīng)用效力比較*

王 玉，李 娜，張麗華，宋 珍，楊瑞芳，孫 平

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心，濟南 250012)

目前，面向低齡、低危孕婦的一線血清學(xué)篩查存在檢出率偏低、假陽性率高的問題[1]。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)以對T21、T18、T13具有較高的篩查敏感度和特異度被迅速推廣，成為產(chǎn)前血清學(xué)篩查-診斷體系的有力補充[2]。行NIPT的孕婦臨床指征復(fù)雜，如何對不同指征的孕婦進行準(zhǔn)確的遺傳咨詢是臨床工作的難點，而NIPT篩查效率及目標(biāo)疾病發(fā)病率的比較對于不同孕婦群體的臨床管理具有重要的參考價值。早期大樣本的研究多關(guān)注NIPT的總體篩查效率，近年來該技術(shù)在不同臨床指征孕婦群體中的應(yīng)用逐漸成為研究的焦點，但研究中少見對血清學(xué)篩查高風(fēng)險、T21臨界風(fēng)險孕婦及超聲軟指標(biāo)異常的孕婦進行綜合分類比較[3-8]。鑒于此，本研究收集并分析了11501例孕婦的NIPT數(shù)據(jù)，結(jié)合產(chǎn)前診斷及新生兒隨訪等結(jié)果，對不同臨床指征組中NIPT的篩查效率和目標(biāo)疾病發(fā)病率進行了分析比較，并同時探討了不同臨界風(fēng)險截斷值下目標(biāo)疾病發(fā)病率的差異，以期為NIPT技術(shù)的臨床應(yīng)用及臨界風(fēng)險孕婦的管理提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年6月至2020年3月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受NIPT的單胎孕婦11501例，孕齡12+1～29+6周，年齡18～45歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕周小于12周；(2)夫婦一方有明確染色體異常；(3)有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風(fēng)險；(4)影像學(xué)檢查提示胎兒有結(jié)構(gòu)異?；驊岩商河形⑷笔?、微重復(fù)綜合征或其他染色體異常需行產(chǎn)前診斷；(5)1年內(nèi)接受過異體輸血或4周內(nèi)接受過免疫治療；(6)接受過器官移植、干細(xì)胞治療；(7)孕期合并惡性腫瘤；(8)試管嬰兒多胎減至一胎，雙胎妊娠其中一胎消亡；(9)重度脂血。本研究經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院科研倫理委員會的批準(zhǔn)(批號：KYLL-202008-035)。

1.2 方法

1.2.1 孕婦分組 根據(jù)臨床指征分為7組：(1)血清學(xué)篩查T21高風(fēng)險組；(2)血清學(xué)篩查T18高風(fēng)險組；(3)血清學(xué)篩查T21臨界風(fēng)險組(風(fēng)險值為1/270～1/1000)；(4)高齡組(預(yù)產(chǎn)期年齡≥35周歲)；(5)NT增厚組(NT≥2.5mm)；(6)其它超聲軟指標(biāo)異常(主要包括側(cè)腦室增寬、左心室點狀強回聲、脈絡(luò)叢囊腫、腸管強回聲、鼻骨顯示不清等)；(7)無指征組(自愿選擇、錯過血清學(xué)篩查時間等)。除(4)組外，其余組孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡均小于35周歲。增加3個截斷值1/350、1/500、1/750，將血清學(xué)篩查T21臨界風(fēng)險組孕婦劃分為4個臨界風(fēng)險亞區(qū)間。入組孕婦的血清學(xué)篩查均采用時間分辨熒光法。

1.2.2 NIPT 采用Cell Free DNA Tube(ARtechTM)，抽取孕婦肘靜脈血5mL，孕婦均簽署知情同意書。測序儀器為Illumina公司NextSeq 550。測序數(shù)據(jù)分析采用無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體分析軟件，測序試劑為胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)，均為安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司開發(fā)。僅報告提示為T21、T18、T13高風(fēng)險的計入陽性結(jié)果。自采樣后10個工作日內(nèi)出具臨床報告。綜合敏感度、特異度和陽性預(yù)測值(positive predictive value，PPV)三項指標(biāo)對NIPT篩查效率進行分析比較。

1.2.3 羊水細(xì)胞產(chǎn)前診斷 對NIPT高風(fēng)險孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水21mL，進行染色體核型分析、未培養(yǎng)細(xì)胞的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測及染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)，若孕周超過26周則不做染色體核型分析。羊水細(xì)胞培養(yǎng)基購自杭州寶榮科技有限公司，F(xiàn)ISH檢測所用產(chǎn)前診斷探針試劑盒購自北京金菩嘉。染色體核型分析按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行，至少計數(shù)20個細(xì)胞并分析5個分裂相。FISH檢測探針為GLP 13/21和CSP 18/X/Y兩組，每組探針至少計數(shù)50個細(xì)胞。CMA采用Affymetrix公司CytoScan 750k進行全基因組范圍掃描，按配套檢測試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)流程進行，檢測儀器為Affymetrix GeneChip System 3000Dx v.2芯片系統(tǒng)，分析軟件為Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software(version:4.0.1252)。所有檢查項目孕婦均簽署知情同意書。

1.2.4 外周血染色體核型分析 NIPT低風(fēng)險但新生兒疑為篩查目標(biāo)疾病的，進行外周血染色體核型分析。常規(guī)方法制備染色體并進行G顯帶。核型分析時每例計數(shù)20個分裂相，分析3～5個染色體核型；若發(fā)現(xiàn)染色體異常時，計數(shù)分裂相不少于50個，分析5～10個染色體核型。所用培養(yǎng)基為HyClone RPMI Mediun Modified，小牛血清為Gibco Newborn Calf Serum，PHA購自上海新國衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司。

1.2.5 拷貝數(shù)變異的高通量測序分析 引產(chǎn)胎兒組織及胎盤、臍帶組織采用Illumina 550基因測序儀進行拷貝數(shù)變異檢測。用組織提取試劑盒(德國QIAGEN)提取基因組DNA，隨機打斷，末端修復(fù)，加A連接進行文庫構(gòu)建，對測序數(shù)據(jù)進行生物信息分析。

1.2.6 隨訪 對所有的NIPT高風(fēng)險進行隨訪，所有低風(fēng)險孕婦在新生兒出生后進行隨訪。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 孕婦分組概況 11501例孕婦按臨床指征分組(表1)：(1)血清學(xué)篩查T21高風(fēng)險組，2368例(20.59%)；(2)血清學(xué)篩查T18高風(fēng)險組，247例(2.15%)；(3)血清學(xué)篩查T21臨界風(fēng)險組，2366例(20.57%)；(4)高齡組，3986例(34.66%)；(5)NT增厚組，185例(1.61%)；(6)其它超聲軟指標(biāo)異常組，300例(2.61%)；(7)無指征組，2049例(17.82%)。各組占比由高到低依次為④>①>③>⑦>⑥>②>⑤。

表1 不同組別NIPT篩查指標(biāo)統(tǒng)計分析

2.2 NIPT在11501例孕婦中總體篩查效率和發(fā)病率的統(tǒng)計分析 如表1所示，11501例孕婦中，NIPT高風(fēng)險共138例，假陽性14例，假陰性3例，篩查敏感度97.64%，特異度為99.88%，復(fù)合PPV為89.86%，總發(fā)病率為1.10%。如表2所示，盡管NIPT針對T18、T13的篩查敏感度(均為100%)優(yōu)于T21(96.84%)，但二者的PPV(83.87%、54.55%)明顯低于T21(95.83%)。T21、T18、T13的發(fā)病率分別為0.83%、0.23%、0.05%(表2)，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組孕婦中NIPT篩查效率比較 不同臨床指征組NIPT總體篩查指標(biāo)如下(表1)：(1)篩查敏感度：血清學(xué)篩查①～③組和⑥組均為100%，⑤組最低為88.89%；(2)篩查特異度：各組間差異不大，④組最低為99.80%；(3)PPV：②、⑤、⑥組均為100%，③組最低為71.43%。NIPT篩查效率組間綜合比較如下：②=⑥>①>③>④>⑤>⑦。

2.4 各組孕婦中目標(biāo)疾病發(fā)病率的比較 不同組別發(fā)病率差異較大。如表1所示：①組(1.69%)、④組(1.28%)、⑥組(1.33%)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于②組(3.64%)和⑤組(4.86%)(P<0.05)，顯著高于③組(0.21%)和⑦組(0.44%)(P<0.05)。各組發(fā)病率比較：⑤>②>①>⑥>④>⑦>③。按疾病統(tǒng)計(表2)，T21發(fā)病率以⑤組(3.24%)最高，②組中未發(fā)現(xiàn)T21病例；T18發(fā)病率以②組(2.43%)最高，③組(0.04%)最低；T13發(fā)病率以②組(1.21%)最高，③～⑥組無真陽性病例。

表2 NIPT針對不同目標(biāo)疾病篩查指標(biāo)統(tǒng)計

2.5 不同臨界風(fēng)險亞區(qū)間孕婦發(fā)病率的分析比較 隨著風(fēng)險值降低，連續(xù)的4個臨界風(fēng)險區(qū)間(1/270>風(fēng)險值≥1/350、1/350>風(fēng)險值≥1/500、1/500>風(fēng)險值≥1/750、1/750>風(fēng)險值≥1/1000)總體發(fā)病率依次為0.54%、0.16%、0.17%、0.13%，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 不同臨界風(fēng)險區(qū)間NIPT篩查指標(biāo)統(tǒng)計

2.6 NIPT低風(fēng)險孕婦隨訪情況 共發(fā)現(xiàn)3例假陰性，高齡組、無指征組、NT增厚組各1例(表4)。第2例為無指征組，自愿選擇進行NIPT檢測，后因胎兒超聲提示異常(頸部皮下軟組織增厚8mm，室間隔缺損，主動脈騎跨)引產(chǎn)，取胎兒組織行CMA檢測診斷為21三體；另2例21三體患兒均為出生后外周血染色體核型確診。

表4 NIPT假陰性病例

2.7 T18假陽性病例胎盤、臍帶行拷貝數(shù)變異檢測 高齡組中，1例T18假陽性胎兒足月娩出后留取臍帶及胎盤，多點取樣檢測發(fā)現(xiàn)胎盤臍帶遠端、子面右側(cè)、邊緣下/左為整倍體，而臍帶近端、胎盤子面左側(cè)、邊緣上為T18的高比例嵌合(70%)，胎盤母面左/右側(cè)、邊緣右側(cè)為T18的低比例嵌合(15%)。

3 討 論

盡管NIPT技術(shù)給產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷工作體系帶來了巨大變革[9]，但其應(yīng)用仍存在適應(yīng)證把握不嚴(yán)格、臨床指征混亂的現(xiàn)象以及“NIPT等同于產(chǎn)前診斷”的思想誤區(qū)，具有較大安全隱患，因此如何針對特定孕婦群體進行準(zhǔn)確遺傳咨詢是臨床工作亟待解決的問題。本研究納入的11501例孕婦，近60%為NIPT慎用人群，包含了血清學(xué)篩查高風(fēng)險、高齡及胎兒超聲軟指標(biāo)異常孕婦，能很好地反映臨床現(xiàn)狀；研究設(shè)計上，分組較以往文獻更加詳細(xì)，將血清學(xué)篩查高風(fēng)險和超聲軟指標(biāo)異常孕婦進一步分類比較；研究數(shù)據(jù)分析上，不僅對NIPT整體篩查效率進行了評估，也比較了不同臨床指征組的篩查效率，并結(jié)合目標(biāo)疾病發(fā)病率進行了分析。本研究結(jié)果可為不同指征孕婦的遺傳咨詢和臨床管理提供理論依據(jù)。

由于存在方法學(xué)的局限性及諸多影響因素，如胎兒游離DNA濃度過低、胎兒與胎盤核型不一致、限制性胎盤嵌合、母源性基因組拷貝數(shù)變異的干擾等[10]，NIPT針對目標(biāo)疾病的敏感度、特異度和PPV會有所降低。本研究結(jié)果顯示，NIPT針對目標(biāo)疾病總的篩查敏感度為97.64%，特異度為99.88%，復(fù)合PPV為89.86%，遠高于國衛(wèi)辦婦幼發(fā)[2016]45號文中的質(zhì)量控制指標(biāo)，取得了較好的篩查效果；按單項疾病統(tǒng)計，NIPT針對T18和T13的敏感度均為100%，T21略低(96.84%)，而T21的PPV(95.83%)明顯高于T18(83.87%)和T13(54.55%)，與文獻報道一致[11]。但在臨床工作中，因NIPT高風(fēng)險直接將胎兒引產(chǎn)的情況時有發(fā)生，當(dāng)結(jié)果提示目標(biāo)疾病尤其是T18和T13高風(fēng)險時，臨床醫(yī)師應(yīng)盡可能引導(dǎo)孕婦進行介入性產(chǎn)前診斷，以排除假陽性。

自2016年二孩政策放開以來，高齡孕婦占比明顯增高。本研究中高齡組占比最高(34.66%)，國外一項10萬例數(shù)據(jù)的NIPT報道中顯示高齡孕婦占比高達59.7%[5]，如何對該類孕婦有效監(jiān)管是臨床工作的重中之重。研究顯示，高齡妊娠時染色體異常發(fā)生風(fēng)險大大增加，30歲以下女性囊胚的整倍體率為70%，至37歲降至50%，而超過43歲降至15%[12]；高齡妊娠時卵子質(zhì)量變差，非整倍體胚胎發(fā)生率的上升會增加“三體自救”的頻率，從而提高限制性胎盤嵌合發(fā)生的概率，而NIPT檢測的胎兒DNA主要來自胎盤凋亡細(xì)胞，這就提高了假陽性出現(xiàn)的概率。本研究數(shù)據(jù)顯示，高齡組T18假陽性病例與限制性胎盤嵌合有關(guān)，因此針對高齡孕婦進行檢測前遺傳咨詢時應(yīng)強調(diào)NIPT方法學(xué)的局限性，同時鼓勵高風(fēng)險孕婦行產(chǎn)前診斷以排除假陽性。

研究顯示，除篩查技術(shù)本身的局限性外，NIPT的篩查效率還在一定程度上取決于是作為一線篩查還是基于血清學(xué)篩查的二線篩查手段[3-4,13-14]。本研究中無指征組篩查效率在所有組別中最差，與文獻中結(jié)論相同，對于這部分孕婦在NIPT檢測前臨床咨詢時應(yīng)格外謹(jǐn)慎，因目標(biāo)疾病發(fā)病率較低，還需更大樣本研究數(shù)據(jù)的支持。

關(guān)于不同臨床指征孕婦NIPT的篩查效率，各文獻報道不一。范向群等[11]對11133例孕婦研究發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險組中NIPT結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致性最好，其次為高齡組和臨界風(fēng)險組，與本研究結(jié)論一致。而張玢等[7]對10275例孕婦的檢測顯示，NIPT對高齡孕婦的篩查效率最高，而對血清學(xué)篩查高風(fēng)險孕婦的篩查效率略低，其次為臨界風(fēng)險孕婦，這可能與樣本量、檢測孕婦群體不同有關(guān)。

血清學(xué)篩查高風(fēng)險孕婦行NIPT是普遍現(xiàn)象，文獻中報道最多[15-17]，但均未對此類孕婦進一步分類統(tǒng)計[5,7,11]。本研究數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)篩查T18高風(fēng)險組中T18和T13篩查效率較好，未發(fā)現(xiàn)T21病例；血清學(xué)篩查T21高風(fēng)險組中T21和T13的篩查效率較好，T18的篩查效率較差。綜上所述，盡管血清學(xué)篩查高風(fēng)險組中NIPT作為二線篩查的效果比較滿意，但當(dāng)血清學(xué)篩查T21高風(fēng)險而NIPT提示T18高風(fēng)險時應(yīng)警惕假陽性。

國內(nèi)常用的中孕期三聯(lián)血清學(xué)篩查漏掉約30%的患兒[18]，多數(shù)假陰性位于臨界風(fēng)險區(qū)間，但該風(fēng)險范圍報道不一，以1/270～1/1000的劃分最多[19-21]。陳怡博等[22]發(fā)現(xiàn)，8397例臨界風(fēng)險(1/270～1/1000)孕婦中胎兒T21的發(fā)病率(0.73‰)顯著低于高風(fēng)險孕婦(6.22‰)，顯著高于風(fēng)險值小于1/1000的孕婦(0.04‰)。鄭文吉等[23]回顧分析了14例假陰性病例，其中有10例(71.43%)風(fēng)險值在1/270～1/1000區(qū)間，另4例(28.57%)風(fēng)險值小于1/1000。研究均提示，加強臨界風(fēng)險孕婦的管理，對于提高目標(biāo)疾病的檢出率具有重要意義。45號文將1/270～1/1000風(fēng)險區(qū)間的孕婦作為NIPT適用人群，再次說明其重要性，但若能在兼顧檢出率的同時相對縮小臨界風(fēng)險的范圍，將會實現(xiàn)篩查經(jīng)濟效益的最大化?；诖?，本研究參考以往報道[22]，在1/270～1/1000區(qū)間增加了1/350、1/500、1/750共3個候選截斷值，分析發(fā)現(xiàn)隨風(fēng)險值降低,4個連續(xù)區(qū)間的目標(biāo)疾病發(fā)病率逐漸下降，以1/270～1/350發(fā)病率最高(0.54%)，另三個區(qū)間發(fā)病率明顯降低，但仍高于陳怡博等[22]統(tǒng)計的1/270～1/500、1/500～1/750、1/750～1/1000三個區(qū)間發(fā)病率(0.8‰、0.77‰、0.65‰)，這可能與實驗方案有關(guān)，該研究中只統(tǒng)計了T21病例，未包含T13和T18病例，且所有病例均為出生后隨訪發(fā)現(xiàn)，極可能漏掉了在孕期因胎兒畸形流產(chǎn)未明確遺傳病因的病例。本研究與之相比，亞區(qū)間劃分更細(xì)，初步結(jié)果顯示以1/270～1/350區(qū)間發(fā)病率最高，因此該區(qū)間篩查的經(jīng)濟效益最高，但不同區(qū)間發(fā)病率無統(tǒng)計學(xué)差異，仍需加大樣本研究。值得注意的是，將NIPT作為臨界風(fēng)險孕婦的二級篩查手段，不易漏檢陽性病例，所統(tǒng)計的目標(biāo)疾病發(fā)病率更接近真實水平，可為遺傳咨詢提供參考。

NT是臨床常用的超聲軟指標(biāo)，國內(nèi)通常以2.5mm作為增厚的判斷標(biāo)準(zhǔn)，國外為3.0mm[24]。以往有關(guān)NIPT在超聲軟指標(biāo)異常的孕婦中的應(yīng)用報道較少，均為小樣本數(shù)據(jù)，陽性率一般為1%～11%[7-8,25-26]，且多數(shù)未對NT增厚孕婦單獨統(tǒng)計。本研究中的NT增厚組測值多為3.0mm以內(nèi)，所有組中發(fā)病率最高(4.86%)，但敏感度最差僅為88.89%。有研究數(shù)據(jù)顯示，胎兒染色體異常發(fā)病率隨NT厚度增加而顯著提高，NT為2.5～2.9mm時僅為1.4%，而NT≥6mm時可達44.1%[27]，因此針對NT增厚組孕婦進行遺傳咨詢時應(yīng)強調(diào)染色體疾病的高發(fā)病率及NIPT技術(shù)的局限性，盡量引導(dǎo)孕婦進行產(chǎn)前診斷，以提高陽性檢出率。

綜上所述，NIPT總體篩查效果較好，但該技術(shù)針對不同臨床指征組孕婦的篩查效率及同一組中不同目標(biāo)疾病的篩查效率均有所不同。篩查效率以血清學(xué)篩查T18高風(fēng)險組和其它超聲軟指標(biāo)異常組最高，無指征組最低；篩查敏感度以T18和T13的最高，PPV以T21最高；發(fā)病率以NT增厚組最高，血清學(xué)篩查T21臨界風(fēng)險組最低。臨床咨詢時，醫(yī)師應(yīng)結(jié)合NIPT的篩查效率與目標(biāo)疾病的發(fā)病率給出合理建議，后續(xù)應(yīng)重點關(guān)注發(fā)病率高而篩查效率低的孕婦群體，假陽性、假陰性病例發(fā)生機制的研究對于提高NIPT篩查效率具有重要意義。