亞臨界提取甜瓜籽油風(fēng)味與脂肪酸關(guān)系分析

吳忠紅，裴龍英，張 健，姜璐熙，孔建軍，杜 鵑，吳 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆理工學(xué)院，新疆阿克蘇 843000；3.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意義】甜瓜籽是葫蘆科甜瓜(CucumismelonL.)的成熟種子[1]。新疆甜瓜質(zhì)量好、產(chǎn)量高，年產(chǎn)量高達(dá)百萬噸[2]，運(yùn)用好副產(chǎn)物甜瓜籽，對(duì)資源的再開發(fā)利用有重要意義?！厩叭诉M(jìn)展研究】甜瓜籽富含油脂12.5%～48.38%[1-4]，且不飽和脂肪酸含量較高，以亞油酸為主[5]，提高免疫力[2，3，6-8]，屬于特種保健性油脂[9，10，4]。以甜瓜籽油為原料制備的生物柴油[11]，是生產(chǎn)生物柴油的潛在來源[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，對(duì)于甜瓜籽油的研究主要集中在提取工藝[6，14-16]和脂肪酸組分分析等方面[3-4，17-18]，而對(duì)其風(fēng)味的研究鮮見報(bào)道。甜瓜籽油具有獨(dú)特的風(fēng)味，其風(fēng)味物質(zhì)是影響感官特性、質(zhì)量和消費(fèi)者行為的重要因素。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)被廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)物的檢測(cè)[19]。分析5個(gè)品種甜瓜籽油的揮發(fā)性風(fēng)味成分與脂肪酸之間的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】以5個(gè)新疆主栽甜瓜品種的甜瓜籽為研究對(duì)象，采用主成分分析(PCA)、相關(guān)性熱圖和變量投影等方法，對(duì)亞臨界提取的甜瓜籽油的揮發(fā)性成分、脂肪酸含量及其相關(guān)性分析，為甜瓜籽油的品質(zhì)評(píng)價(jià)、溯源和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甜瓜品種

選用新疆主栽甜瓜品種香瓜、皇后、綠寶石、86-1、新蜜1號(hào)的種子(來源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所西甜瓜種業(yè))。采用亞臨界萃取法提取甜瓜籽油。

1.1.2 儀器

Agilent 7890A/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；SPME萃取頭，美國Supelco公司；CAR/DVB/PDMS 1 cm萃取頭，美國Supelco公司；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；Agilent 6890型氣相色譜儀，美國安捷倫公司；Agilent 7683B自動(dòng)進(jìn)樣器，美國安捷倫公司；氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，美國安捷倫公司。CBE-10L亞臨界萃取裝置，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司；FM100通用高速粉碎機(jī)，天津泰斯特；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.1.3 試劑

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：C7-C30(德國Sigma公司)；甲醇、石油醚、正己烷、丁烷、正庚醇等均為分析純，沃德生物有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

甜瓜籽干燥：將甜瓜籽放入烘箱干燥60 h，干燥溫度50℃，保證水分含含量控制在3%以下。

甜瓜籽→超微粉碎→過篩→裝料→萃取→減壓脫溶→甜瓜籽油→冷卻、抽濾→甜瓜籽粕。

甜瓜籽裝料：將甜瓜籽粉碎、過篩后裝入篩絹(30 cm×10 cm)，平鋪一薄層卷入萃取釜中。

萃取參數(shù)：丁烷做萃取劑，萃取時(shí)間40 min，萃取溫度45℃，萃取壓力為0.5 MPa。

低壓脫溶：減壓脫溶時(shí)應(yīng)先打開冷凝水、壓縮機(jī)，抽至0.1 MPa后，再打開真空泵抽至-0.01 MPa，最后依次關(guān)真空泵、壓縮機(jī)和加熱泵。

冷卻、抽濾：在低溫3℃條件靜置12 h，采用抽濾裝置進(jìn)行真空抽濾(真空度≤0.6 MPa)即得澄清甜瓜籽油。

1.2.2 揮發(fā)性成分測(cè)定1.2.2.1 GC-MS

參考文獻(xiàn)Yang W等方法[20]，略有改動(dòng)。

萃取頭的活化：氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口設(shè)置為270℃，將萃取頭插入進(jìn)樣口進(jìn)行活化，以除去原先吸附在萃取頭的物質(zhì)，活化時(shí)間為30～60 min。

頂空固相微萃取(HS-SPME)：取2 g油脂于20 mL頂空瓶中，置于40℃恒溫水浴中加熱平衡20 min，通過隔熱墊將已老化好的SPME萃取頭插入頂空瓶中(距離液面1 cm)，吸附萃取30 min，磁力攪拌速度100 r/min，在GC進(jìn)樣口推出纖維頭，在250℃條件下解析5 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，以高純氦氣(純度≥99.999%)載氣，恒定流速1.45 mL/min；柱溫箱采用程序升溫，起始溫度40℃，保持5 min，以5 ℃/min的升溫速率升到終溫200℃，保持5 min；不分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣口溫度250℃。

MS條件：電離方式EI，電子轟擊能量為70 eV；GC-MS接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，掃描質(zhì)量范圍40～450 amu。

1.2.2.2 揮發(fā)物

分離出的化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，選擇與NIST147 library譜庫匹配度大于800的鑒定結(jié)果，同時(shí)結(jié)合相對(duì)保留指數(shù)(RI)定性，檢測(cè)成分定量通過加入一定濃度的正庚醇做內(nèi)標(biāo)，采用面積歸一化法表示揮發(fā)性成分的相對(duì)定量。

取C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，以正己烷為溶劑配制濃度為0.1%標(biāo)準(zhǔn)溶液，應(yīng)用GC-MS分析條件分離，測(cè)定各正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。各成分保留指數(shù)RI值，根據(jù)Kovats公式計(jì)算:RI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)。其中，RI為被分析組分的保留指數(shù)，tx為被分析組分流出峰的保留時(shí)間(min)，tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間(min)，tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正烷烴流出峰的保留時(shí)間(min)，且tn

1.2.3 脂肪酸

塑料滴管取1滴待測(cè)油樣于10 mL離心管中，加入2.5 mL正己烷和100 μL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液，漩渦混合5 min，在 5 000 r/min下離心10 min，取上清液待測(cè)。

氣相色譜：色譜柱HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為氮?dú)?，流速?.5 mL/min，進(jìn)樣口溫度為260℃，分流比為80∶1，升溫程序：210℃保持9 min，以20 ℃/min的升溫速度升至250℃，保持10 min。

質(zhì)譜：接口溫度250℃，離子源溫度200℃，電離方式EI源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍：30～550 amu，采集方式：全掃描模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，利用軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)法(P<0.05)分析差異顯著性，PCA使用的是R包ade4進(jìn)行繪制，熱圖使用的是R語言中ComplexHeatmap包，變量投影重要性分析使用的是R語言中的Vegan包。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的甜瓜籽油揮發(fā)性組分

研究表明，5個(gè)品種的甜瓜籽油在揮發(fā)性物質(zhì)組成和相對(duì)含量存在差異。共鑒定出65種揮發(fā)性化合物，其中新蜜1號(hào)檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，為37種物質(zhì)，主要是14種萜烯類、8種酮類、6種醇類及5種其他類等。皇后品種的油脂中含有30種，香瓜和86-1樣品檢測(cè)到29種，綠寶石含有揮發(fā)性物質(zhì)種類最少，僅檢測(cè)到26種。香瓜、皇后、86-1和綠寶石4個(gè)品種油脂中(1S)-(+)-3-蒈烯的含量均最高，且皇后、86-1和綠寶石之間差異性不顯著，但與香瓜差異性顯著，新蜜1號(hào)未檢測(cè)出此物質(zhì)，在新蜜1號(hào)中3-蒈烯的含量最高，達(dá)到了33.85%。右旋萜二烯在香瓜樣品中含量?jī)H次于(1S)-(+)-3-蒈烯，為15.46%，且其他4個(gè)品種中未檢測(cè)出此物質(zhì)，差異較大。雙戊烯僅在皇后、86-1和綠寶石樣品中檢測(cè)到，且含量排名第二，分別為16.38%、15.92%和14.96%，無顯著性差異。其次月桂烯、右旋-α-蒎烯、β-蒎烯、左旋-β-蒎烯在5個(gè)品種中相對(duì)含量也較高，且差異性顯著。酚類物質(zhì)在香瓜、皇后、綠寶石樣品中未檢出，在86-1中僅有1種，含量為0.11%，新蜜1號(hào)檢測(cè)到的酚類物質(zhì)有3種，平均含量為0.46%。表1，表2

表2 不同品種甜瓜籽油揮發(fā)性化合物種類及含量變化Table 2 Changes of volatile compounds in seed oil of different melon varieties

萜烯類物質(zhì)、酮類和醇類是甜瓜籽油揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)種類，其中萜烯類物質(zhì)種類及含量在5個(gè)品種的油脂中均較高，約是其他物質(zhì)的幾十至幾百倍不等。萜烯類物質(zhì)有14種，占總揮發(fā)物的63.72%～82.35%，平均為75.97%，已超過總揮發(fā)性成分的一半以上，差異性顯著；其次是酮類，占總揮發(fā)物的2.41%～5.05%，平均為4.43%，香瓜、皇后、綠寶石之間差異性不顯著，但與86-1、新蜜1號(hào)有顯著差異；醇類化合物共有6種，占總揮發(fā)物的2.61%～3.47%，平均為3.16%。其他類揮發(fā)性物質(zhì)有5種，占總揮發(fā)物的3.1%～4.65%，平均為3.85%，香瓜、皇后、86-1之間差異性不顯著，但與綠寶石、新蜜1號(hào)有顯著差異。在5個(gè)品種中，醛類和酯類物質(zhì)含量較低，且差異性較大。酯類僅測(cè)出1～2種，含量平均在0.25%不同品種的甜瓜籽油揮發(fā)性成分有顯著性差異。表1

表1 不同品種甜瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定Table 1 GC-MS identification results of volatile substances in melon seed oil of different varieties

2.2 香氣物質(zhì)的PCA

研究表明，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為45%和23.5%，總和68.5%。5個(gè)品種的油脂大致可以分為4類，皇后與綠寶石歸為一類。主成分1的方差貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于主成分2，PC1軸上距離越大，樣品差異性越大。以豎線為分隔，將5個(gè)品種的甜瓜籽油脂分成左右兩大組，右側(cè)是香瓜、皇后、86-1和綠寶石4個(gè)樣品，左側(cè)是新蜜1號(hào)，新蜜1號(hào)與其他4個(gè)品種差異性最為顯著。再以散點(diǎn)的距離可以得出，86-1與皇后、綠寶石這一類的距離較近，且在同一象限，86-1與皇后、綠寶石這一類在整體香氣成分的含量和類型方面的差異小于香瓜和新蜜1號(hào)。香瓜與新蜜1號(hào)分別在縱軸兩側(cè)且距離較遠(yuǎn)，兩者之間有顯著性差異。圖1

續(xù)表1 不同品種甜瓜籽油揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定Table 1 GC-MS identification results of volatile substances in melon seed oil of different varieties

2.3 不同品種的甜瓜籽油脂肪酸含量變化

研究表明，5個(gè)品種甜瓜籽油的脂肪酸在種類和相對(duì)含量方面存在差異。共鑒定出13種脂肪酸，飽和脂肪酸6種，平均含量22.98%，不飽和脂肪酸7種，平均含量為75.34%。飽和脂肪酸含量較高的主要是棕櫚酸和硬脂酸，不飽和脂肪酸含量較高的是亞油酸和油酸，約是其他脂肪酸含量的100～250倍不等。香瓜樣品中檢測(cè)出7種脂肪酸，其中飽和脂肪酸3種，不飽和脂肪酸4種，亞油酸含量最高，為54.24%，其次是油酸和棕櫚酸，含量分別為24.82%和12.75%?；屎髽悠窓z測(cè)到7種脂肪酸，飽和脂肪酸4種，不飽和脂肪酸3種，亞油酸含量最高為61.7%，其次是油酸和棕櫚酸，含量分別為16.7%和14.38%。綠寶石樣品檢測(cè)到8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸3種，不飽和脂肪酸5種，含量較高的是亞油酸和棕櫚酸。86-1樣品檢測(cè)到6種脂肪酸，其中飽和脂肪酸3種，不飽和脂肪酸3種。新蜜1號(hào)樣品檢測(cè)到8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸各4種。香瓜、綠寶石、新蜜1號(hào)樣品之間，棕櫚酸差異性不顯著，但與皇后和86-1差異性顯著。5個(gè)樣品中能檢測(cè)出的十六烯酸之間差異性不顯著。皇后、綠寶石、新蜜1號(hào)樣品之間的亞油酸差異性不顯著，但與香瓜、86-1差異性顯著?；屎?、86-1、新蜜1號(hào)樣品之間的油酸含量差異性不顯著，與其他2個(gè)樣品差異性顯著。表3

香瓜、皇后、新蜜1號(hào)樣品的總飽和脂肪酸之間差異性不顯著，與綠寶石、86-1樣品差異性顯著，且香瓜、皇后、新蜜1號(hào)樣品的總飽和脂肪酸含量均低于綠寶石和86-1，其中86-1樣品的總飽和脂肪酸含量最高，為29.21%。不飽和脂肪酸的差異性與飽和脂肪酸的分析結(jié)果一致，但含量恰好相反，香瓜、皇后、新蜜1號(hào)的總不飽和脂肪酸含量均高于綠寶石和86-1，其中香瓜的總不飽和脂肪酸含量最高，為79.38%。

PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為49.2%和21.2%，總和70.4%。5個(gè)品種被分成了5大類，以豎線為分隔，左右兩側(cè)的樣品差異較大，右側(cè)是香瓜、皇后、新蜜1號(hào)3個(gè)樣品，左側(cè)是綠寶石和86-1樣品。左側(cè)的綠寶石和86-1距離較遠(yuǎn)，雖同在左側(cè)，但差異性顯著；右側(cè)皇后和新蜜1號(hào)樣品在同一象限，且距離相對(duì)較近，其脂肪酸最相近。圖2

2.4 不同品種的甜瓜籽油香氣物質(zhì)與脂肪酸的相關(guān)性

研究表明，紅色越深正相關(guān)性越大，藍(lán)色越深負(fù)相關(guān)性越強(qiáng)，編號(hào)comp1-comp65與香氣物質(zhì)編號(hào)對(duì)應(yīng)，fa1-fa13與表3中的脂肪酸編號(hào)一致。fa8(二十四酸)、fa13(十八碳烯酸)與香氣物質(zhì)的相關(guān)性相似，主要是與comp33，30，62，1，44，23，60，25，11，18，32，31，57，59，56，61，35呈顯著正相關(guān)，這些物質(zhì)主要是9種萜烯類、3種酚類、3種其他類、1種醇類和1種酮類；fa8、fa13與comp49，17，45，36呈顯著負(fù)相關(guān)。fa3(棕櫚酸)主要與comp55，37，58，52，4，47呈顯著正相關(guān)，這些物質(zhì)酯類有2種，醇類、酮類、醛類、酚類各1種。fa5(油酸)主要與comp63，9，26，19，12，10，14呈顯著正相關(guān)，這些物質(zhì)萜烯類較多有5種；油酸與鄰異丙基甲苯有顯著負(fù)相關(guān)。fa7(亞麻酸)、fa9(蓖麻油酸)與香氣物質(zhì)的相關(guān)性相似，主要是與comp27，42這2種物質(zhì)有顯著正相關(guān)。fa1(肉豆蔻酸)主要與54，6，29呈顯著正相關(guān)。fa11(花生酸)主要與右旋-α-蒎烯、2-乙基己烯醛呈顯著負(fù)相關(guān)。圖3

表3 不同品種甜瓜籽油脂肪酸鑒定Table 3 Identification results of fatty acids in melon seed oil of different varieties

2.5 不同品種的甜瓜籽油香氣物質(zhì)與脂肪酸的變量投影

研究表明，主成分上的重要度排序，當(dāng)脂肪酸在2種主成分上均大于1，對(duì)香氣的影響相對(duì)較大；當(dāng)?shù)谝恢鞒煞执笥?，第二主成分小于1時(shí)，則其重要性其次；當(dāng)?shù)诙鞒煞执笥?，第一主成分小于1時(shí)，則其影響相對(duì)較??；當(dāng)在2個(gè)主成分都小于1時(shí)，則表明對(duì)香氣物質(zhì)的影響最小。fa8(二十四酸)和fa13(十八碳烯酸)對(duì)香氣的影響最大，其次是fa11(花生酸)，fa12(18-甲基十九烷酸)，fa2(十六烯酸)，其他脂肪酸對(duì)香氣物質(zhì)的影響相對(duì)較小。圖4

3 討 論

5個(gè)品種的甜瓜籽油中(IS)-(+)-3-蒈烯和3-蒈烯含量較高，其具有松木樣香氣[16]。萜烯類物質(zhì)、酮類和醇類在5種甜瓜籽油揮發(fā)性成分含量相對(duì)較高，如檸檬烯，是一種天然的具有很多生理學(xué)功能的單萜類化合物[21]。酮類化合物一般被認(rèn)為是不飽和脂肪酸的氧化降解產(chǎn)物，能夠賦予植物油一定的果香氣味[22]，醇類化合物一般會(huì)使氣味較柔和[24,25]。酚類化合物雖然少，但通常具有果香型的感官特征[23]。酯類化合物在各植物油中所占比例較小，但對(duì)植物油的整體氣味有柔和作用，對(duì)很多植物油的氣味有重要的貢獻(xiàn)[26]。醛類化合物雖閾值較低，但氣味貢獻(xiàn)較大，主要來源于不飽和脂肪酸的氧化降解。例如，反式-2，4-癸二烯醛的氣味閾值低至0.07 μg/kg，卻是植物油中貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性成分[27]。對(duì)比白希等[28]對(duì)伽師瓜籽油揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)，與研究的甜瓜籽油在風(fēng)味物質(zhì)上有較大差異，油脂揮發(fā)性的差異與品種有一定關(guān)系，這種差異性在不同品種的西瓜籽油中也存在[29]。

飽和脂肪酸對(duì)人體具有多種生理有益的生化功能[26]。研究中不飽和脂肪酸中的亞油酸和油酸含量相對(duì)較高，采用超臨界CO2萃取甜瓜籽油中油酸、亞油酸含量最高分別為58.48%、18.36%[30]；采用超臨界CO2萃取甜瓜籽油中亞油酸含量72.35%，油酸含量16.29%[31]；采用超臨界CO2萃取甜瓜籽油中不餉飽和脂肪酸以亞油酸(64.29%)、油酸(16.64%)為主[32]，這與研究結(jié)論相似。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，超聲輔助和超臨界CO2提取的伽師瓜籽油中含有6～12種脂肪酸[3,14,31]，亞油酸含量較高，且不飽和脂肪酸含量高于飽和脂肪酸，這與研究的結(jié)果一致。在其它品種中測(cè)得的脂肪酸的含量差異較大，少則有7～12種[6,30]，例如黑龍江產(chǎn)地的甜瓜籽油檢測(cè)到7種脂肪酸[6]，多則有15～23種，例如巴西品種的 Honey Dew、 Hymark 和 Orange Flesh[18,32]，這也進(jìn)一步說明了不同品種的甜瓜籽油中脂肪酸表現(xiàn)出一定的差異性。

4 結(jié) 論

從甜瓜籽油中共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì)，其中新蜜1號(hào)品種被檢測(cè)到的種類最多，為37種，其次是皇后，共有30種，香瓜和86-1中的種類相當(dāng)，均為29種，而綠寶石中最少，僅有26種。樣品中萜烯類種類及含量均占比較高，有11～14種，平均為75.97%；其次是酮類，平均為4.43%；醇類含量較低，為3.16%；不同品種的油脂風(fēng)味存在較大差異。5個(gè)甜瓜籽油風(fēng)味有顯著差異。5種甜瓜籽油中富含不飽和脂肪酸，平均為75.34%，飽和脂肪酸平均含量為22.98%。二十四酸、十八碳烯酸、花生酸、棕櫚酸、亞麻酸、蓖麻油酸與香氣物質(zhì)有較強(qiáng)相關(guān)性。