冰溫酶解貯藏對(duì)低鹽脫水牡蠣滋味的影響

張毅，萬(wàn)金慶,2,3*，楊帆，童年

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306; 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306; 4.安徽宜康高新農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 六安 237200)

牡蠣是世界上捕撈量最大的貝類(lèi)，同時(shí)也是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一[1]。因其滋味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而受到關(guān)注。呈味氨基酸和核苷酸及其關(guān)聯(lián)物是牡蠣滋味的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，但這些指標(biāo)因養(yǎng)殖區(qū)域的不同而受到一定的影響[2]。林海生等[3]研究得出呈味核苷酸主要以腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)和次黃嘌呤核苷(HxR)為主，但呈味物質(zhì)會(huì)因地域和品種的不同而呈現(xiàn)差異。有研究表明，酶解可以增強(qiáng)近江牡蠣OstrearivularisGould的滋味[4]。而酶解作為一種簡(jiǎn)單高效的方法，廣泛應(yīng)用于牡蠣活性肽的生產(chǎn)制備。近年來(lái)，Qian等[5]利用酶解制備太平洋牡蠣Crassostreagigas多肽，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性，可能是天然抗炎成分的潛在來(lái)源。Wang等[6]得出類(lèi)似結(jié)論，并指出相比溫度、pH和水解時(shí)間，酶與底物含量的比(E/S)是酶解反應(yīng)最關(guān)鍵的條件。現(xiàn)已證實(shí)，牡蠣多肽具有抗氧化、抑菌、抗疲勞、抗癌、免疫調(diào)節(jié)及增強(qiáng)性功能等活性[7]。

酶解作為一項(xiàng)綠色加工手段常用于海珍品的精深加工，現(xiàn)有酶解工藝通常用于牡蠣肽制備，通過(guò)牡蠣勻漿后添加高比例的酶(超過(guò)2 000 U/g)，在最適條件下進(jìn)行酶解，離心取上清液，采用柱層析或者是膜過(guò)濾器截留方式得到牡蠣肽溶液，最后凍干完成牡蠣多肽的制備[5,8-9]。該工藝具有加酶量高、酶解時(shí)間短的特點(diǎn)，作為一種水產(chǎn)品精深加工方式完全改變了牡蠣原有的食用習(xí)慣，且成本較高、提取工藝相對(duì)復(fù)雜。鮮活牡蠣蛋白質(zhì)含量約為9%，酶解反應(yīng)水解度(DH)在30%左右[10]，因此，獲得單位質(zhì)量的牡蠣肽通常需要大量原料進(jìn)行生產(chǎn)，不可避免造成原料浪費(fèi)。本研究中，擬利用低鹽脫水牡蠣冰溫貯藏期長(zhǎng)的特點(diǎn)，采用低酶(25 U/g)注射結(jié)合冰溫酶解，以保持牡蠣原有食用習(xí)慣的前提下增加其多肽含量，并考察冰溫酶解過(guò)程中游離氨基酸及呈味核苷酸的變化，以期達(dá)到酶解增鮮的目的，為開(kāi)發(fā)高附加值海珍品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)試劑: 總巰基(-SH)測(cè)試盒(北京索萊寶科技有限公司)、超微量 Ca2+-ATPase試劑盒(南京建成生物工程研究所)、穩(wěn)定型Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、平板計(jì)數(shù)瓊脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、中性蛋白酶(上海麥克林生化科技有限公司)、風(fēng)味蛋白酶(上海蘭拓生物科技有限公司)；氫氧化鈉、氫氧化鉀、高氯酸、三氯乙酸、氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，為分析純。

主要儀器設(shè)備: LHS-150HC恒溫恒濕箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、SLFPTAD型多功能酶標(biāo)儀(上?；蛴邢薰?、pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、全自動(dòng)凱氏定氮儀(Kjeltec 8400，丹麥 FOSS)、電子舌(ASTREE，法國(guó) Alpha MOS)、基酸全自動(dòng)分析儀(L-8800，日本 Hitachi)、高效液相色譜儀(W2690/5，美國(guó) Waters)、冰溫干燥裝置[11](實(shí)驗(yàn)室自行研制)(圖1)。

1—冷阱制冷機(jī)組；2—真空壓力變送器；3—手閥；4—放氣閥；5—電動(dòng)蝶閥；6—止油閥；7—真空泵；8—漏氣閥； 9—物料；10—托盤(pán)；11—電加熱板；12—重量傳感器；13—真空箱；14—排水閥；15—冷阱。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

原料處理：新鮮太平洋牡蠣購(gòu)自上海市南匯新城鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，去殼質(zhì)量為(25.0±5.0)g，含水率為80%±2%。開(kāi)殼取肉后按含鹽量1%進(jìn)行飽和食鹽水注射[12]，以牡蠣肉中注射25 U/g風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶作為試驗(yàn)組，以注射等量蒸餾水作為對(duì)照組。具體操作以去殼質(zhì)量為25.0 g的牡蠣為例進(jìn)行說(shuō)明。

鹽水注射：室溫20 ℃下食鹽溶解度為36 g/100 g水，密度為1.33 g/cm3，36 g食鹽溶解于100 g水后體積約102.3 mL，25.0 g牡蠣按照1%含鹽量計(jì)算需要注射食鹽0.25 g，則需要注射飽和食鹽水體積V1，根據(jù)下式

計(jì)算得V1=0.71 mL。

酶液注射：試驗(yàn)所用中性蛋白酶的酶活性為50 000 U/g，風(fēng)味蛋白酶的酶活性為100 000 U/g。取2.0 g中性蛋白酶和1.0 g風(fēng)味蛋白酶分別用蒸餾水定容至100 mL，此時(shí)酶活性為1 000 U/mL，則25.0 g的牡蠣需注射酶液V2，根據(jù)下式

計(jì)算得V2=0.63 mL。

注射均使用2.5 mL無(wú)菌注射器對(duì)牡蠣進(jìn)行操作，以閉殼肌幾何中心和沿鰓絲方向約5 mm的牡蠣組織作為注射點(diǎn)，緩慢注射，閉殼肌周?chē)鶆驖B液，牡蠣組織緩慢充盈視為注射均勻。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)3組，分別為注射蒸餾水的對(duì)照組(D組)及注射風(fēng)味蛋白酶(F組)和中性蛋白酶(Z組)的酶解組。 原料經(jīng)注射處理后進(jìn)行冰溫脫水(-2.0 ℃±0.5 ℃)處理[12]，通過(guò)質(zhì)量傳感器在電腦界面實(shí)時(shí)顯示牡蠣含水率，待含水率下降至目標(biāo)含水率(60%±1%)時(shí)終止脫水。脫水后的樣品進(jìn)行單個(gè)封裝，冰溫(-2.0 ℃±0.5 ℃)貯藏，每3 d進(jìn)行一次指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 pH測(cè)定 參考Chen等[12]的方法略有改進(jìn)。測(cè)定前將樣品在室溫下放置30 min，然后切碎取肉糜5.0 g，加入蒸餾水45 mL均質(zhì)30 s，4 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行pH測(cè)定，每3 d測(cè)量一次。

1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)、總巰基含量測(cè)定及K值計(jì)算 依據(jù)《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》(GB 5009.228—2016)中的分析方法測(cè)定TVBN含量。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定總巰基含量。K值計(jì)算公式為

其中：ATP為三磷酸腺苷，ADP為二磷酸腺苷，AMP為腺苷酸，IMP為次黃嘌呤核苷酸，HxR為次黃嘌呤腺苷，Hx為次黃嘌呤，單位均為μmol/g。

TVBN和K值通常用來(lái)評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的新鮮程度，牡蠣貯藏過(guò)程中通常以TVBN值為20 mg N/100 g作為劣變界限[13]。K值低于20%認(rèn)為是一級(jí)鮮度，20%～60%屬于二級(jí)鮮度，否則視為腐敗[14]。

1.2.5 Ca2+-ATPase活力測(cè)定 粗酶液的制備參考陳海強(qiáng)等[15]的方法略有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取牡蠣肉糜2.0 g，加入4 ℃預(yù)冷蒸餾水18 mL，冰水浴勻漿10 s，取勻漿液2 mL，加入98 mL生理鹽水混合均勻，根據(jù)超微量Ca2+-ATPase測(cè)定試劑盒操作步驟進(jìn)行。酶活力定義：每小時(shí)每克樣品中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位(U)。

1.2.6 TCA-溶解肽和游離氨基酸含量測(cè)定 取3 g樣品沸水浴滅酶10 min，加入27 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的TCA溶液，勻漿1 min，置于4 ℃冰箱1 h，低溫離心(4 ℃，12 000 r/min)10 min。以牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Lowry等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以mg/g牡蠣樣品表示。

參考Wang等[17]的方法略有改進(jìn)。稱取2.0 g樣品沸水浴滅酶10 min，加入15 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸溶液，勻漿，超聲處理5 min，4 ℃靜置2 h，低溫離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，取上清液5.0 mL，用氫氧化鈉溶液(分別為6、1 mol/L)調(diào)節(jié)pH為2.0，10 mL容量瓶定容，搖勻后用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾打入氨基酸全自動(dòng)分析儀進(jìn)樣瓶進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物含量測(cè)定 參考徐美祿等[18]的方法略有改進(jìn)。取5.0 g牡蠣肉沸水浴滅酶10 min，加入10 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的高氯酸溶液勻漿，超聲處理5 min后進(jìn)行離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)，取上清液，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的高氯酸5 mL洗滌沉淀，相同條件下離心，合并兩次上清液。使用氫氧化鉀溶液(分別為6、1 mol/L)調(diào)節(jié)pH為6.5，50 mL容量瓶定容，搖勻后用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾打入進(jìn)樣瓶進(jìn)行測(cè)定。

試驗(yàn)采用GL Inertsil ODS-3色譜柱(4.6ID×250 mm)等梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。流動(dòng)相：A為甲醇，B 為0.02 mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀溶液(pH 5.8)。

1.2.8 味道強(qiáng)度值(taste activity value，TAV)和味精當(dāng)量(equivalent umami concentration，EUC)的計(jì)算 TAV體現(xiàn)某呈味物質(zhì)對(duì)呈味的貢獻(xiàn)[19]，其計(jì)算公式為

TAV=C/T。

其中：C為樣品中某呈味物質(zhì)含量(mg/g)；T為該呈味物質(zhì)閾值。

味精當(dāng)量(EUC)[20]表示呈味核苷酸混合物與鮮味氨基酸二者協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度，是以谷氨酸鈉(MSG)的含量來(lái)表示100.0 g樣品中總呈鮮物質(zhì)的量，其計(jì)算公式為

EUC=∑(aibi)+ 1218∑(aibi)·∑(ajbj)。

其中：EUC為味精當(dāng)量(g MSG/100 g)；ai為鮮味氨基酸Asp和Glu的含量(g/100 g)；bi為Asp和Glu相對(duì)于MSG 的鮮度系數(shù)(其中Glu=1.0，Asp=0.077)；aj為呈味核苷酸GMP、IMP、AMP的含量(g/100 g)；bj為呈味核苷酸相對(duì)于IMP的鮮度系數(shù)(其中IMP=1.0，GMP=2.3，AMP=0.18)；1218為協(xié)同作用系數(shù)。

1.2.9 電子舌分析 參考從嬌嬌等[21]的方法略有改進(jìn)，主成分分析(PCA)由AlphaSoft V12.0軟件完成。取5.0 g牡蠣肉沸水浴滅酶10 min，加入25.0 mL超純水，勻漿，超聲處理5 min，4 ℃靜置30 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，過(guò)濾，沉淀重復(fù)進(jìn)行以上操作一次，合并兩次上濾液定容至100 mL待用。電子舌進(jìn)樣杯進(jìn)樣量為5.0 mL，加75 mL超純水定容，每秒采集一次數(shù)據(jù)，采集時(shí)間120 s，取第120 s響應(yīng)值，每個(gè)樣品平行取3個(gè)樣。

酶解過(guò)程中，辨別指數(shù)(DI值)表征不同樣品滋味輪廓區(qū)分度，樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)無(wú)重疊時(shí)DI值為正，值越大區(qū)分度越高；有重疊時(shí)DI值為負(fù)，絕對(duì)值越高越不易區(qū)分[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣pH的變化

從圖2可見(jiàn)：貯藏過(guò)程中3組牡蠣的pH均呈下降趨勢(shì)，其值為6.40～6.00；D組(對(duì)照組)pH呈波動(dòng)下降，整個(gè)過(guò)程受到兩種因素疊加影響；F和Z組由于外加蛋白酶的作用，pH從第3天開(kāi)始迅速下降，第12天時(shí)降到最低點(diǎn)，分別為6.05和6.08，隨后升高趨于穩(wěn)定。

圖2 牡蠣酶解過(guò)程中pH的變化

2.2 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣K值及TVBN的變化

從圖3可見(jiàn)，冰溫酶解第0天時(shí)，F(xiàn)、Z和D組的TVBN含量分別為6.00、6.20、5.52 mg N/100 g，酶解18 d后F和Z組達(dá)到劣變界限，TVBN含量為20.95、21.32 mg N/100 g，D組24 d時(shí)達(dá)到劣變界限，TVBN含量為20.39 mg N/100 g。

F、Z和D組的K值在酶解過(guò)程中均滿足二級(jí)鮮度(20%～60%)要求，第24天時(shí)K值分別為51、57和41，酶解后期K值迅速上升(圖3)。Pearson相關(guān)性分析表明，K值與TVBN含量極顯著相關(guān)(P<0.01)，F(xiàn)、Z和D組中的K值與TVBN含量二者的相關(guān)性系數(shù)r分別為0.946、0.938和0.961，相關(guān)性均較高，但對(duì)新鮮度評(píng)價(jià)并不完全同步。綜合K值和TVBN含量分析，F(xiàn)和Z組貯藏期大致在18 d，比D組少6 d。

圖3 牡蠣酶解過(guò)程中K值和TVBN含量的變化

2.3 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣總巰基含量、Ca2+-ATPase活力及TCA-可溶性肽含量的變化

牡蠣冰溫酶解過(guò)程中總巰基含量、Ca2+-ATPase活力和TCA-可溶性肽變化分別見(jiàn)圖4、圖5和圖6。

在整個(gè)24 d的酶解過(guò)程中，F(xiàn)、Z和D組的總巰基含量由最初51.83、50.65、53.05 μmol/g prot降低至0.91、0.45、0.95 μmol/g prot，降幅分別達(dá)到98.24%、99.11%和98.20%，酶解過(guò)程中D組總巰基含量下降最為平緩，其次為Z組，F(xiàn)組最為迅速(圖4)。這表明，冰溫酶解能有效促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，使得蛋白質(zhì)內(nèi)部巰基暴露被氧化成二硫鍵。

圖4 牡蠣酶解過(guò)程中總巰基含量的變化

在整個(gè)24 d的酶解過(guò)程中，D組Ca2+-ATPase活力由5.39 U/mg prot降低至0.21 U/mg prot，與其總巰基變化的Pearson相關(guān)性系數(shù)r達(dá)到0.989，極顯著相關(guān)(P<0.01)；F和Z組的變化規(guī)律與D組相同，Ca2+-ATPase活力由5.90、7.25 U/mg prot分別降低至1.69、2.97 U/mg prot，與對(duì)應(yīng)組總巰基含量變化極顯著相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)性系數(shù)r分別為0.996和0.972；酶解期間，D組Ca2+-ATPase活力在同期3組中最低，F(xiàn)和Z組在總巰基含量較低的情況下顯示出更高的Ca2+-ATPase活力(圖5)。

圖5 牡蠣酶解過(guò)程中Ca2+-ATPase活力的變化

蛋白質(zhì)降解影響TCA-可溶性肽含量，F(xiàn)、Z和D組酶解前9 d，TCA-可溶性肽顯著增加(P<0.05)，分別達(dá)到181.00、192.11、141.21 mg/g；從第12天時(shí)開(kāi)始，TCA-可溶性肽含量開(kāi)始下降，第24天時(shí)分別降至51.00、98.78、44.36 mg/g；F和Z組肽含量變化規(guī)律類(lèi)似，皆明顯高于D組，F(xiàn)組從第18天開(kāi)始TCA-可溶性肽含量開(kāi)始迅速下降，可能與風(fēng)味蛋白酶中含有的氨肽酶和羧肽酶有關(guān)(圖6)。

圖6 牡蠣酶解過(guò)程中TCA-可溶性肽含量的變化

2.4 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣游離氨基酸的分析

酶解過(guò)程中,牡蠣鮮味氨基酸(UAA)(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)，甜味氨基酸(SAA)(蘇氨酸Thr、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、組氨酸His和脯氨酸Pro)，苦味氨基酸(BAA)(纈氨酸Val、蛋氨酸Met、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、酪氨酸、苯丙氨酸Phe和精氨酸Arg)的變化如表1所示。酶解期間F、Z和D組總游離氨基酸含量(TAA)差異顯著(P<0.05)(除第3天外)，總含量變化與酶解時(shí)間呈正相關(guān)，表明冰溫酶解能顯著提升牡蠣總游離氨基酸含量(P<0.05)；Z組在酶解中后期總游離氨基酸含量上升最為明顯，第21天時(shí)達(dá)32.01 mg/g，顯著高于F組(23.30 mg/g)和D組(19.51 mg/g)(P<0.05)。

表1 牡蠣酶解過(guò)程中游離氨基酸含量隨貯藏時(shí)間的變化

鮮味氨基酸(∑UAA)、甜味氨基酸(∑SAA)和苦味氨基酸(∑BAA)在含量變化上與TAA變化規(guī)律一致，但不同酶解方式使得氨基酸的組成差異明顯，酶解第21天時(shí)F、Z與D組相比，∑UAA增加0.29、2.47 mg/g，∑SAA增加1.71、4.50 mg/g，∑BAA增加1.79、5.53 mg/g。

游離氨基酸對(duì)滋味的影響可以通過(guò)TAV值體現(xiàn)，酶解過(guò)程中鮮甜氨基酸TAV值變化如表2所示。氨基酸TAV值表明,鮮味氨基酸在呈味過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)地位，其次是甜味氨基酸，TAV值的變化依賴氨基酸含量的改變。酶解0 d時(shí)，F(xiàn)、Z和D組TAV>1的氨基酸皆有4種且種類(lèi)一致，分別為谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸，其在整個(gè)酶解期間均具備呈味貢獻(xiàn)；隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行，TAV>1的氨基酸,F組增加脯氨酸，Z組增加脯氨酸和天冬氨酸，D組沒(méi)有變化。因酶解過(guò)程中產(chǎn)生的氨基酸含量不同，同一種氨基酸的TAV值由大至小依次為Z組>F組>D組(表2)。

表2 牡蠣酶解過(guò)程中呈味氨基酸味道強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間的變化

2.5 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物、EUC的變化

從表3可見(jiàn)：AMP含量在酶解期間內(nèi)呈下降趨勢(shì)，第0天時(shí)F、Z和D組的AMP含量分別為31.12、34.35、53.85 mg/100 g，第24天時(shí)降低至5.22、3.58、9.11 mg/100 g，分別降低83.22%、89.57%、83.07%；F、Z和D組的IMP含量在酶解的第3天時(shí)到達(dá)積累峰值，分別為155.22、217.13、85.06 mg/100 g，隨后開(kāi)始降低；與D組相比，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)F和Z組的HxR含量均顯著提高(P<0.05)，使牡蠣K值升高，新鮮度下降。

AMP、IMP和HxR作為牡蠣的主要呈味物質(zhì)，酶解前期含量波動(dòng)大，組間差異明顯，酶解第3天時(shí)，F(xiàn)、Z組與D組IMP含量分別相差71.16、132.07 mg/100 g，是酶解第24天時(shí)差值的7.19和5.16倍，同時(shí)HxR含量也表現(xiàn)為酶解組具有更高水平(表3)，表明冰溫酶解能影響呈味核苷酸極其關(guān)聯(lián)化合物變化，前期影響更為明顯。

表3 牡蠣酶解過(guò)程中AMP、IMP和HxR含量隨貯藏時(shí)間的變化

鮮味氨基酸與呈味核苷酸的協(xié)同作用有增鮮效果，酶解過(guò)程中牡蠣味精當(dāng)量(EUC)變化如表4所示。EUC含量D組峰值出現(xiàn)在第6天，為35.40 g MSG/100 g，F(xiàn)和Z組出現(xiàn)在第3天，分別為68.42、89.23 g MSG/100 g，之后隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐步降低，酶解組與D組相比EUC峰值提前了3 d，表明IMP含量變化在牡蠣的滋味形成過(guò)程中起到重要作用。

表4 牡蠣酶解過(guò)程中味精當(dāng)量隨貯藏時(shí)間的變化

2.6 冰溫酶解過(guò)程中牡蠣的電子舌分析

不同酶解階段電子舌滋味輪廓的主成分分析(PCA)相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表5，整個(gè)酶解期間牡蠣滋味輪廓主成分分析(PCA)見(jiàn)圖7。試驗(yàn)中PC1、PC2之和貢獻(xiàn)率高于96%，滿足應(yīng)當(dāng)高于85%要求[19]，因此,主成分分析能準(zhǔn)確區(qū)分冰溫酶解牡蠣的滋味變化。酶解期間，F(xiàn)、Z和D組DI值由第0天時(shí)的90降低至第21天時(shí)的68，表明酶解造成的滋味差異前期區(qū)分度更高，隨著酶解的進(jìn)行區(qū)分度降低。

表5 牡蠣酶解滋味輪廓主成分分析(PCA)相關(guān)參數(shù)

圖7(其中代號(hào)F0表示F組第0天時(shí)，其他代號(hào)同理)表明，雖然每個(gè)單一的時(shí)間段內(nèi)F、Z和D組滋味能被有效區(qū)分，但對(duì)21 d內(nèi)整個(gè)滋味變化過(guò)程的辨別指數(shù)卻為-3，數(shù)據(jù)點(diǎn)的重疊主要發(fā)生在前期和后期且數(shù)據(jù)點(diǎn)區(qū)域發(fā)生明顯改變，說(shuō)明牡蠣整體滋味在冰溫酶解的前后期有著較大差異。

圖7 牡蠣酶解過(guò)程中滋味輪廓主成分(PCA)分析圖

3 討論

3.1 冰溫酶解對(duì)牡蠣新鮮度的影響

研究表明，牡蠣糖原含量超過(guò)1%[3]，冰溫酶解過(guò)程中糖苷酶釋放降解糖原、加速糖酵解過(guò)程、產(chǎn)生乳酸累積，可能是酶解前期pH迅速下降的原因。本研究中，隨著冰溫酶解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的胺類(lèi)、三甲胺及揮發(fā)性堿性物質(zhì)開(kāi)始累積，pH升高。這與Min等[23]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，pH變化同時(shí)受到自溶的影響，可作為對(duì)蛋白質(zhì)降解程度分析的參考指標(biāo)，pH變化表明蛋白質(zhì)正在經(jīng)歷降解過(guò)程。

Kolakouski[24]認(rèn)為，水產(chǎn)品低溫貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化前期以自溶為主，主要受到內(nèi)源酶的影響。因此，本研究中添加外源酶進(jìn)行冰溫酶解能加速這一過(guò)程，TVBN含量變化是冰溫酶解過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的重要體現(xiàn)。這解釋了F組和Z組酶解前期TVBN值增長(zhǎng)快，與D組相比先達(dá)到劣變期限的原因。F和Z組TVBN含量差異主要是外源酶酶解特性不同，風(fēng)味蛋白酶是一種復(fù)合酶，含有內(nèi)切酶和外切酶，而中性蛋白酶作為內(nèi)切酶作用于肽鍵，因此，酶解前期牡蠣蛋白質(zhì)降解速度不同，從而使二者的TVBN含量可能產(chǎn)生差異。

IMP分解產(chǎn)生次黃嘌呤腺苷(HxR)和次黃嘌呤(Hx)，HxR和Hx二者累積是K值增加的主要原因。吳依蒙等[25]研究表明，IMP降解受到微生物產(chǎn)生外源酶和自身內(nèi)源酶的共同作用，其中5′-核苷酸酶是催化IMP降解反應(yīng)的主要酶之一，存在游離于細(xì)胞質(zhì)和結(jié)合于細(xì)胞膜兩種狀態(tài)，因此，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也能夠影響IMP的降解過(guò)程。本研究中，低鹽脫水牡蠣酶解前期微生物增長(zhǎng)緩慢[12]，主要受內(nèi)源酶作用，冰溫酶解促進(jìn)蛋白質(zhì)降解變性，細(xì)胞膜受到破壞，5′-核苷酸酶活力得到釋放，這可能使得酶解過(guò)程中F和Z組K值明顯高于D組。酶解前期K值增長(zhǎng)緩慢，隨后迅速升高，這與Shi等[26]得出的結(jié)論基本一致。酶解加速ATP降解，使得前期IMP大量累積，后期降解生成HxR和Hx，這也可能是從第15天開(kāi)始F和Z組K值快速上升的主要原因。

3.2 冰溫酶解對(duì)牡蠣蛋白質(zhì)降解的影響

谷胱甘肽巰基和蛋白質(zhì)巰基是生物體內(nèi)兩種主要的巰基，其中蛋白質(zhì)巰基具有維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的功能，是判斷蛋白質(zhì)是否變性的重要指標(biāo)，蛋白質(zhì)變性會(huì)影響Ca2+-ATP的酶活性，該酶存在于生物體組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，總巰基含量及Ca2+-ATPase活力變化可反映酶解過(guò)程中蛋白質(zhì)變性情況[27]?？値€基含量與Ca2+-ATPase活力關(guān)系密切，本試驗(yàn)中二者在變化趨勢(shì)上基本一致，該結(jié)果與Sun等[28]的研究結(jié)果相同?？値€基含量較低的F和Z組表現(xiàn)出較高的Ca2+-ATPase活力，這可能是因?yàn)槊附膺^(guò)程中部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，使得附著在細(xì)胞膜上的Ca2+得到釋放，激活Mg2+-ATPase，從而催化ATP分解生成ADP和無(wú)機(jī)磷[29]。

TCA-可溶性肽含量的變化可反映牡蠣蛋白質(zhì)的酶解情況，本研究中相同酶解時(shí)間下F和Z組TCA-可溶性肽含量顯著高于D組，這可能是由于外加酶與內(nèi)源酶協(xié)同作用的結(jié)果，Le等[30]研究認(rèn)為，在貯藏過(guò)程中細(xì)胞中的溶酶體發(fā)生破裂，各種內(nèi)源酶得到釋放是TCA-可溶性肽含量增加的原因之一。本研究中酶解第12天時(shí)牡蠣TCA-可溶性肽含量開(kāi)始降低，Ruiz-capillas等[31]認(rèn)為，TCA-可溶性肽含量降低與蛋白質(zhì)變性發(fā)生聚集有關(guān)，酶解后期pH上升，總巰基含量和Ca2+-ATPase活力變化也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，說(shuō)明冰溫酶解顯著促進(jìn)了牡蠣蛋白質(zhì)的降解。

3.3 冰溫酶解對(duì)牡蠣滋味的影響

呈味氨基酸和核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物含量不同會(huì)對(duì)滋味產(chǎn)生影響[32]，當(dāng)物質(zhì)味道強(qiáng)度值(TAV)>1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)呈味具備貢獻(xiàn)，數(shù)值越大表征貢獻(xiàn)越高[33]。本研究中，冰溫酶解促進(jìn)F、Z組牡蠣蛋白質(zhì)降解，總游離氨基酸含量顯著升高，與D組相比，鮮甜味氨基酸TAV值上升，對(duì)呈味產(chǎn)生積極貢獻(xiàn)。楊昭等[4]研究表明，酶解過(guò)程中為了達(dá)到統(tǒng)一的水解度，風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶相比需要更高酶解溫度，更大的酶與底物含量比和更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，導(dǎo)致同等酶解條件下中性蛋白酶效果更佳，該結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，本試驗(yàn)中經(jīng)中性蛋白酶冰溫酶解，Z組鮮甜氨基酸含量顯著高于F和D組，EUC含量顯著提高。符合朱蓓薇[34]做出的中性蛋白酶作為牡蠣水解酶較為合理的判斷。

AMP、IMP和HxR作為牡蠣的主要呈味成分，研究表明，存在AMP→IMP→HxR的降解過(guò)程，中間產(chǎn)物IMP呈鮮味特征[2]。本試驗(yàn)酶解過(guò)程中，F(xiàn)、Z和D組呈味核苷酸及關(guān)聯(lián)化合物含量差異顯著，表明酶處理及酶種類(lèi)在冰溫酶解期間對(duì)牡蠣滋味物質(zhì)有顯著影響。Z組IMP峰值顯著高于D和F組，同時(shí)降解也更為迅速，表明中性蛋白酶對(duì)牡蠣呈味核苷酸及關(guān)聯(lián)化合物影響更加明顯。HxR的增加意味著K值上升，新鮮度下降，與D組相比，加酶使得HxR含量顯著提高，這與前期IMP大量累積并迅速降解密切相關(guān)；3組的IMP峰值差異較大，可能是由于不同的酶處理對(duì)IMP積累過(guò)程影響不同。酶解前期呈味核苷酸及關(guān)聯(lián)化合物的降解主要受到酶活性的調(diào)控，F(xiàn)和Z組外源酶與內(nèi)源酶協(xié)同作用使牡蠣蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度降解，破壞了細(xì)胞膜及相關(guān)細(xì)胞器膜，作為催化IMP降解反應(yīng)的主要酶，5′-核苷酸酶的不同程度釋放也是造成呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)物降解規(guī)律不同的原因，這與吳依蒙等[25]得出的結(jié)論基本一致。核苷酸含量差異也是F、Z和D組EUC值出現(xiàn)顯著差異的重要原因，因此,冰溫酶解主要影響游離氨基酸及呈味核苷酸含量，使牡蠣產(chǎn)生滋味差異。

本研究中，相同酶解時(shí)間點(diǎn)電子舌能有效區(qū)分F、Z和D組滋味，這與酶解過(guò)程中3組EUC含量差異顯著密切相關(guān)。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)15 d后電子舌數(shù)據(jù)點(diǎn)發(fā)生明顯變化，樣品前后期數(shù)據(jù)點(diǎn)發(fā)生重疊，DI值為-3，表明整個(gè)酶解期間滋味不能有效區(qū)分，結(jié)合TVBN及K值判斷，此時(shí)牡蠣新鮮度開(kāi)始下降，前后期滋味差異使得電子舌數(shù)據(jù)點(diǎn)區(qū)域改變，該結(jié)果與Wang等[17]的研究結(jié)論基本相同。

4 結(jié)論

1)低鹽脫水牡蠣經(jīng)冰溫酶解后，其TVBN和K值均顯著提高，二者在鮮度指標(biāo)上高度相關(guān)但不完全一致，酶解組牡蠣在20 d內(nèi)滿足鮮度要求，而對(duì)照組為24 d。

2)中性蛋白酶冰溫酶解低鹽脫水牡蠣活性更高，除影響蛋白質(zhì)降解、改變肽及游離氨基酸含量外，酶解也會(huì)對(duì)呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物含量產(chǎn)生影響，二者協(xié)同作用使味精當(dāng)量(EUC)顯著提高，從而使滋味產(chǎn)生差異。

3)電子舌分析表明，冰溫酶解產(chǎn)生的滋味差異前期區(qū)分度更高且前后期差異較大，冰溫酶解具有顯著增鮮效果，滋味差異能被電子舌有效區(qū)分，長(zhǎng)時(shí)間保證牡蠣新鮮度的同時(shí)提升了牡蠣肽及游離氨基酸含量。

4)本研究為開(kāi)發(fā)高附加值非凍結(jié)生鮮食品提供了相關(guān)參考，今后將進(jìn)一步對(duì)其冰溫酶解得到的牡蠣肽活性進(jìn)行鑒定。