烏鱧爛身病病原的分離鑒定及病理組織觀(guān)察

`喻大鵬，唐懷慶，丘金珠，宋海霞，梁富，夏洪麗，宋長(zhǎng)江*，魯義善

(1.廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳 518108；2.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.深圳海水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種苗健康評(píng)價(jià)公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，廣東 深圳 518108；4.廣東省水生動(dòng)物健康評(píng)估工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518108；5.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437)

烏鱧Channaargus隸屬于鱧亞目鱧科鱧屬魚(yú)類(lèi)，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖重要品種之一，其具有出肉率高、抗應(yīng)激性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，同時(shí)具有較高的藥用價(jià)值[1]。2019年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，全國(guó)烏鱧產(chǎn)量高達(dá)459.277 t，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷擴(kuò)大，水體環(huán)境持續(xù)惡化，導(dǎo)致該魚(yú)發(fā)育遲緩，免疫力降低，各種病害頻發(fā)，其中烏鱧爛身病尤為嚴(yán)重，給烏鱧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了極大障礙[2]。目前，已報(bào)道引起爛身癥狀的病原菌有擬態(tài)弧菌Vibriomimicus[3]、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila[4]、維氏弧菌Vibrioharvey[5]、絲囊霉菌Aphanomycesinvadans[6]和維氏氣單胞菌Aeromonasveronii[7]等。

維氏氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科弧菌屬革蘭氏陰性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，是一種人-魚(yú)共患致病菌[8]，不僅能引起人類(lèi)敗血癥、傷口繼發(fā)性感染、腸胃炎及腦膜炎，還能感染斑點(diǎn)叉尾鮰Ietaluruspunetaus[9]、黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco[10]、加州鱸Micropterussalmoniodes[11]、卵形鯧鲹Trachinotusovatus[5]、泥鰍Misgurnusanguillicaudatus[12]、黃鱔Monopterusalbus[13]、鰻鱺Anguillajaponica[14]、團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala[15]和懷頭鲇Silurussoldatovi[16]等多種魚(yú)類(lèi)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2020年3月，在中山某烏鱧親魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大量患病烏鱧，體表多處出現(xiàn)爛身癥狀，沿岸浮頭，無(wú)規(guī)則游動(dòng)，食欲廢絕。烏鱧爛身病在中國(guó)珠江三角洲地區(qū)發(fā)現(xiàn)已久，且在春季低溫反潮季節(jié)持續(xù)發(fā)病，有些地區(qū)發(fā)病周期甚至延長(zhǎng)至10月底，這對(duì)烏鱧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病烏鱧養(yǎng)殖基地存在養(yǎng)殖密度過(guò)大、投喂分布集中、水質(zhì)惡化等現(xiàn)象，這些因素都有可能導(dǎo)致烏鱧爛身發(fā)生。本研究中，作者從患病烏鱧病灶處分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)16S rRNA測(cè)序、生理生化鑒定、藥敏分析等試驗(yàn)，對(duì)烏鱧爛身病病原菌特征進(jìn)行了分析，并對(duì)該菌株感染后的組織病理變化進(jìn)行了觀(guān)察，最后通過(guò)回歸感染試驗(yàn)確認(rèn)該菌株為爛身病的主要病原，獲得的結(jié)果能為烏鱧爛身病的防治提供理論依據(jù)，對(duì)烏鱧的健康養(yǎng)殖也具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

患病烏鱧來(lái)源于廣東中山某親魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)所用健康烏鱧魚(yú)苗(體長(zhǎng)7～10 cm)購(gòu)自惠州某烏鱧魚(yú)苗養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖桶，14 d后用于攻毒試驗(yàn)，暫養(yǎng)期間水溫控制在28 ℃，每日投喂一次。

常規(guī)使用培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒、藥敏片等均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病癥觀(guān)察 眼觀(guān)患病烏鱧體表癥狀,并記錄；隨后解剖患病烏鱧體表皮膚、鰓絲、腸道等器官并用相機(jī)拍照記錄。取病灶周?chē)ひ哼M(jìn)行水浸片觀(guān)察，排除寄生蟲(chóng)和真菌感染后，進(jìn)行下一步細(xì)菌分離純化。

1.2.2 病原菌分離純化 用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇對(duì)患病烏鱧體表消毒，將瀕死與剛死亡的患病烏鱧在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行解剖和初步臨床診斷，并對(duì)體表病灶部位進(jìn)行劃線(xiàn)分離，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)與形態(tài)規(guī)格相似的單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行后續(xù)鑒定分析。

1.2.3 病原菌鑒定

1)革蘭氏染色。參考革蘭氏染色試劑盒方法步驟，在無(wú)菌條件下進(jìn)行染色及形態(tài)觀(guān)察。

2)生理生化鑒定。按照細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)，將培養(yǎng)好的菌液添加到生化鑒定管中，于37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后觀(guān)察并記錄結(jié)果。

3)細(xì)菌的16S rRNA序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析。按照基因組DNA提取試劑盒方法，提取純化菌株DNA，利用生工生物工程(廣州)股份有限公司合成的16S rRNA通用引物27F:AGAGTTTGATCMGGCTCAG和1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)無(wú)誤后，送至生工生物工程(廣州)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 人工回歸感染試驗(yàn) 將此前分離到的疑似病原菌活化，28 ℃下培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)人工回歸感染試驗(yàn)。參考黃浦江等[17]的方法，使用無(wú)菌PBS將菌液濃度分別調(diào)節(jié)至2.0×107、2.0×106、2.0×105、2.0×104CFU/mL，腹腔注射魚(yú)體，每尾注射100 μL，每組30尾，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS，接種后連續(xù)觀(guān)察一周，每天記錄烏鱧發(fā)病情況，參考黃浦江等[1]方法計(jì)算半致死濃度(LD50)，連續(xù)觀(guān)察期間出現(xiàn)死亡病例，及時(shí)分離并鑒定病原菌。

1.2.5 病原菌藥敏試驗(yàn) 參考黃浦江等[17]的方法, 選取30種抗生素藥敏片對(duì)致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(判斷依據(jù)為WS/T125—1999)。

1.2.6 組織病理檢驗(yàn) 患病烏鱧體表使用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇進(jìn)行消毒，取體表病灶處代表性樣品，切塊置于體積分?jǐn)?shù)4%的組織細(xì)胞固定液中，送至武漢塞維爾生物(廣州)科技有限公司進(jìn)行組織病理制片。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病烏鱧病癥觀(guān)察

眼觀(guān)患病烏鱧體表主要病變?yōu)闋€身(圖1)，體表鱗片脫落(圖1A)，體表多處出現(xiàn)潰瘍?cè)?圖1B)，鰓蓋處可見(jiàn)糜爛血塊(圖1C)，尾部存在少量出血點(diǎn)(圖1D)。解剖觀(guān)察體內(nèi)感染情況，發(fā)現(xiàn)其腹腔有黃色積液，內(nèi)部組織未見(jiàn)異常。

A—體表鱗片脫落(↑)；B—體表潰瘍?cè)?▲)；C—鰓蓋糜爛(↑)；D—尾部出血點(diǎn)(↑)。

2.2 病原菌的分離與革蘭氏染色

從患爛身病烏鱧病灶處分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為ZS20200317。隨后對(duì)該菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌。顯微鏡下觀(guān)察該菌呈短桿狀，邊緣光滑整齊。

2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

用細(xì)菌16S rRNA通用引物擴(kuò)增菌株ZS20200317的16S rRNA基因, 并將其測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，隨后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的其他菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株ZS20200317與已知維氏氣單胞菌一致性最高，為98.5%。選取NCBI中部分維氏氣單胞菌16S rRNA 序列，并利用Mega 5.2軟件，采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株ZS20200317與維氏氣單胞菌KC166864聚為一支，親緣關(guān)系最近(圖2)。

◆,分離菌株ZS20200317?！簦琁solated bacterial strain SZ20200317.

2.4 分離株的生理生化鑒定

分離株ZS20200317經(jīng)生理生化鑒定顯示(表1)，該菌的賴(lài)氨酸脫羧酶、氧化酶、VP試驗(yàn)、MR等生理生化反應(yīng)為陽(yáng)性，可利用覃糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖，不能分解乳糖，能直接生長(zhǎng)在半固體瓊脂上，三糖鐵試驗(yàn)無(wú)法分解乳糖，產(chǎn)H2S氣，該分離菌與本實(shí)驗(yàn)室分離的維氏氣單胞菌的生理生化特性基本一致。

表1 分離菌的生理生化鑒定結(jié)果

綜合形態(tài)學(xué)觀(guān)察、革蘭氏染色、16S rRNA及生理生化特性結(jié)果，可鑒定菌株ZS20200317為維氏氣單胞菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

菌株ZS20200317對(duì)30種抗生素藥物敏感性結(jié)果顯示(表2)，該菌株對(duì)氨芐西林、苯唑西林、羧芐西林、青霉素G、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素和克林霉素7種藥物耐受；對(duì)新霉素、呋喃唑酮和復(fù)方新諾明中度敏感；對(duì)頭孢他啶、多粘菌素B、四環(huán)素等20種藥物敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 人工回歸感染試驗(yàn)

健康烏鱧在回歸感染7 d內(nèi)各組死亡情況見(jiàn)表3，感染期間，發(fā)現(xiàn)部分染病烏鱧活力減弱，食欲廢絕，感染4 d后，高濃度組(2.0×107CFU/mL)回歸感染烏鱧全部死亡，無(wú)菌PBS對(duì)照組健康無(wú)死亡，這表明菌株ZS20200317對(duì)烏鱧有較強(qiáng)的致病性。同時(shí)，從回歸感染瀕死烏鱧體內(nèi)再次分離細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)重新分離到的病原菌與自然分離病原菌相同，這表明，本次自然分離菌株ZS20200317為此次烏鱧爛身病的疑似致病菌。

表3 烏鱧腹腔注射感染試驗(yàn)結(jié)果

使用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，計(jì)算得到菌株ZS20200317的LD50為7.25×104CFU/mL。

2.7 組織病理學(xué)觀(guān)察

觀(guān)察自然患病烏鱧爛身病的病理組織切片，眼觀(guān)體表病灶處從外到內(nèi)可見(jiàn)皮膚鱗片脫落，表皮壞死消失，真皮層泛紅，圖3為自然患病烏鱧健康肌肉與病灶處肌肉組織H.E染色病理切片。病灶處肌肉組織中出現(xiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞核溶解消失(圖3B)，并出現(xiàn)壞死脫落(圖3C)，部分肌纖維溶解，邊界不清(圖3D)。

A—健康肌肉組織； B—肌肉組織大量嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(↑), 肌纖維壞死，核溶解(▲)； C—肌肉糜爛, 組織滲出壞死,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，肌細(xì)胞壞死脫落(*) ； D—肌纖維變性溶解，邊界不清(↑)。

3 討論

3.1 烏鱧爛身病病原診斷

目前,有關(guān)魚(yú)類(lèi)體表疾病研究報(bào)道較多，本研究中患病烏鱧體表出現(xiàn)潰爛壞死癥狀，與云斑尖塘鱧Oxyeleotrismarmoratus[4]、大口黑鱸Micropterussalmoides[18]、鱧Channamaculata[6]和卵形鯧鲹Trachinotusovatus[5]爛身病的臨床癥狀相同，主要表現(xiàn)為鰭條損傷、肌肉糜爛、體表出現(xiàn)大量出血點(diǎn)等癥狀。根據(jù)以往研究表明[4,6,10,12,19-20]，引起魚(yú)類(lèi)爛身病病原很多，其中大口黑鱸爛身病的病原是嗜水氣單胞菌，卵形鯧鲹爛身病的病原是哈維氏弧菌QT520，絲囊霉菌則是引發(fā)冬春季鱧爛身病的主要病原，均與本研究中分離獲得的病原不同。將本研究中分離純化致病菌，進(jìn)行16S rRNA 序列同源性比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其與維氣氏單胞菌具有98.5%的一致性，初步將該菌確定為維氏氣單胞菌?；貧w感染試驗(yàn)驗(yàn)證了維氣氏單胞菌為引發(fā)本次爛身病的病原。

3.2 烏鱧爛身病病原菌的致病性與致病機(jī)理

王旭等[20]研究表明，維氏氣單胞菌主要感染體表肌肉及肝、腎等內(nèi)臟器官，細(xì)菌通過(guò)體表病灶侵入其他組織，且細(xì)菌在其他組織中大量繁殖，引發(fā)進(jìn)一步繼發(fā)感染并導(dǎo)致死亡；楊移斌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，從西伯利亞鱘和施氏鱘分離的維氏氣單胞菌具有很強(qiáng)的致病性，人工感染96 h內(nèi)的累計(jì)死亡率分別高達(dá)70%和80%；而劉亞等[22]對(duì)維氏氣單胞菌感染達(dá)氏鱘Acipenserdabryanus造成的組織病理觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，其病理?yè)p傷多集中在肝臟和腸道等組織，肝臟是魚(yú)體重要解毒器官，腸道主要功能是吸收營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)機(jī)體發(fā)育，功能性器官組織的損傷，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降更易發(fā)生繼發(fā)性感染而死亡。本研究中患病烏鱧病理?yè)p傷主要集中在體表，且體表肌肉病理切片結(jié)果顯示，其上皮細(xì)胞及皮膚結(jié)締組織壞死脫落，大量炎性細(xì)胞聚集，這與常藕琴等[6]對(duì)冬春季鱧體表潰瘍的組織病理觀(guān)察相似。

值得一提的是，本試驗(yàn)中初期使用維氏氣單胞菌人工感染健康烏鱧，尚未出現(xiàn)明顯爛身癥狀，但2 d內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，隨后降低感染濃度，延長(zhǎng)養(yǎng)殖周期，結(jié)果均不理想，依然無(wú)法復(fù)制爛身癥狀。在絲囊霉菌回歸感染健康冬春季鱧時(shí)，也同樣無(wú)法復(fù)制自然患病癥狀[6]。以往研究表明[4,20-21,23]，爛身病可能不是由某一種病原引起，而是由于魚(yú)類(lèi)體表?yè)p傷使得水體中的病原菌能突破體表黏膜免疫后在局部繁殖，繼而擴(kuò)大損傷部位加劇感染，出現(xiàn)爛身及潰瘍癥狀，最后細(xì)菌通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)并大量繁殖，產(chǎn)生大量毒素造成機(jī)體死亡。但本研究中用維氏氣單胞菌進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)后，可以從患病個(gè)體中重新分離到該菌株，用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯示菌株ZS20200317的LD50為7.25×104CFU/mL，具有較強(qiáng)致病性，為爛身病病原。

3.3 烏鱧爛身病的預(yù)防及控制方法

本試驗(yàn)中藥敏試驗(yàn)顯示，維氏氣單胞菌對(duì)氯霉素、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、哌拉西林、多西環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、多粘菌素B等20種抗生素具有敏感性，這些試驗(yàn)結(jié)果能為該病治療提供參考。然而其中氯霉素、氧氟沙星、諾氟沙星是中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禁用獸藥，嚴(yán)禁使用，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中可以參考藥敏結(jié)果中其他非禁用抗生素，嚴(yán)格按照劑量添加，嚴(yán)禁私自使用其他藥物，同時(shí)做好日常消毒管理工作。

防控該病的主要方法是：1)通過(guò)調(diào)節(jié)水質(zhì)保持養(yǎng)殖水體清潔；2)烏鱧生性?xún)疵停B(yǎng)殖過(guò)程中，可按照魚(yú)體大小分揀后進(jìn)行養(yǎng)殖，同時(shí)降低放養(yǎng)密度，避免因搶食造成魚(yú)體受傷；3)定期清塘清淤，使用生石灰和漂白粉等對(duì)水體進(jìn)行消毒；4)確保餌料干燥新鮮，按量投喂，減少殘餌對(duì)水體的污染；5)適量使用“三黃散”(黃芩、黃檗、大黃、大青葉等)拌料投喂烏鱧，調(diào)節(jié)水質(zhì)的同時(shí)也可預(yù)防爛身病暴發(fā)。

4 結(jié)論

1)從廣東中山某養(yǎng)殖場(chǎng)患病烏鱧中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株ZS20200317，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA 基因序列比對(duì)，將該菌株確定為維氣氏單胞菌。

2)維氣氏單胞菌ZS20200317對(duì)烏鱧的LD50為7.25×104CFU/mL，具有較強(qiáng)致病性，屬于強(qiáng)毒株型。

3)分離菌株ZS20200317對(duì)頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢唑林和頭孢拉定等20種抗生素藥物敏感，對(duì)氨芐西林、苯唑西林、羧芐西林、青霉素G、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素和克林霉素等7種藥物具有耐藥性。