針灸對(duì)體外受精促排卵周期中卵泡發(fā)育及優(yōu)質(zhì)胚胎的影響

蘭 穎，陳 瑤 ，吳 節(jié)

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072;2.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院，四川 內(nèi)江 641099)

卵巢功能障礙是降低女性生育力、引起不孕癥的重要因素之一。促進(jìn)卵泡發(fā)育，獲取成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)的胚胎是體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)成功的前提[1]。臨床證據(jù)已證實(shí)針灸能夠通過(guò)改善卵巢功能、提高取卵數(shù)量及質(zhì)量、促進(jìn)胚胎著床等多條途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)IVF-ET 臨床妊娠率的積極影響[2-5]。中醫(yī)認(rèn)為女性腎氣盛，天癸至，沖任氣血調(diào)暢是胎孕的基礎(chǔ)。若先天稟賦不足或房事不節(jié)，損傷腎氣、沖任不調(diào)，則不能攝精成孕。故補(bǔ)腎益氣，調(diào)攝沖任是首要原則。因此深入研究針灸在IVF-ET 各環(huán)節(jié)中改善妊娠結(jié)局的作用，對(duì)中醫(yī)助孕的前景有著重要的臨床意義。

本研究在促排卵期間，采用B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，了解針灸如何影響卵泡動(dòng)態(tài)發(fā)育和優(yōu)質(zhì)胚胎率。研究結(jié)果將對(duì)合理安排針灸干預(yù)啟動(dòng)時(shí)機(jī)和療程，優(yōu)化卵母細(xì)胞質(zhì)量、提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，最終改善妊娠結(jié)局有著十分重要的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 受試者來(lái)源于2018年3月至2019年12月期間成都附屬醫(yī)院治未病中心門診病例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡21～45歲；②符合2012年美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)頒布的女性不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③符合IVF-ET適應(yīng)癥，配偶身體健康；④明確研究?jī)?nèi)容及風(fēng)險(xiǎn)，自愿參加并簽署書面知情同意書。同時(shí)滿足上述4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，方可納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由輸卵管、子宮、免疫或遺傳問(wèn)題引起的不孕癥患者；②有針灸禁忌、出血傾向、過(guò)敏體質(zhì)、酒精或藥物濫用者。符合以上任意一項(xiàng)均予以排除。

通過(guò)https://www.medsci.cn/網(wǎng)站隨機(jī)化工具產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字，使用順序編號(hào)、不透明的信封逐一裝好隨機(jī)數(shù)字卡片并封口，受試者按就診順序領(lǐng)取對(duì)應(yīng)編號(hào)的信封獲得隨機(jī)分組信息。三組分別為安神補(bǔ)腎針灸治療組，常規(guī)針灸組以及對(duì)照組。本研究方案設(shè)計(jì)符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，由四川省中醫(yī)藥區(qū)域倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)(審查批件號(hào)：2018KL-015)。

共納入受試者99例，每組各33例。入組后對(duì)照組1例受試者入組后自然妊娠，故未進(jìn)行后續(xù)干預(yù)和數(shù)據(jù)采集。安神補(bǔ)腎針灸組中平均年齡31.30歲;平均病程50.55個(gè)月。常規(guī)針灸組平均年齡31.70歲；平均病程51.70個(gè)月。對(duì)照組平均年齡32.69歲；平均病程50.25個(gè)月。各組一般資料如受教育程度、不孕癥類型、不良妊娠次數(shù)、生產(chǎn)次數(shù)、失敗周期數(shù)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各項(xiàng)激素指標(biāo)雌二醇(Estradiol,E2)、孕激素(Progesterone,P)、促卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、抗繆勒管激素(Anti mullerian hormone,AMH)及竇卵泡計(jì)數(shù)(Sinus follicle count,AFC)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組受試者血清激素水平及竇卵泡計(jì)數(shù)比較

1.2 治療方法

1.2.1 對(duì)照組：僅接受促排卵藥物刺激方案。促排卵：①于前1個(gè)月經(jīng)周期的黃體中期(月經(jīng)來(lái)潮第21天前后)一次性注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a Gonist,GnRH-a)0.4 mg降調(diào)節(jié)；②在下個(gè)月經(jīng)周期第3天開(kāi)始注射促性腺激素 225 IU促排卵，每天1次直至人體絨膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)注射日前1 d；③在月經(jīng)周期第6天給予GnRH-a曲普瑞林，每天1次，每次0.1 mg，持續(xù)至HCG注射日。當(dāng)2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm、E2水平高于500 pg/ml時(shí)，于當(dāng)晚21：00時(shí)注射HCG 250 μg，36 h后超聲引導(dǎo)下行陰道穿刺取卵術(shù)。將獲取的卵母細(xì)胞置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)皿中。

體外受精：HCG注射后38～40 h加配偶精子，加精時(shí)雙人核對(duì)并記錄時(shí)間、加精量。30～50 μl的液滴內(nèi)加精5000～10000條，或在1 ml的培養(yǎng)液內(nèi)加精15萬(wàn)～30萬(wàn)條。將精卵共培養(yǎng)18～20 h，后觀察受精結(jié)果。

1.2.2 常規(guī)針灸組：在促排卵周期中給予常規(guī)針灸方案。選穴方案：關(guān)元(灸)、氣海、歸來(lái)、子宮、腎俞、命門(灸)、三陰交、太溪。穴位定位參考中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)2006年頒布的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《腧穴名稱與定位》(GB/T12346-2006) 。治療周期自進(jìn)入促排卵周期當(dāng)天開(kāi)始，直至取卵日前1 d。采用0.35 mm直徑，1～1.5寸毫針針刺，得氣后留針30 min，10 min行針1次，每日治療1次，每個(gè)療程連續(xù)5次，療程間間隔2 d。第奇數(shù)次選用正面穴位，受試者取仰臥位，第偶數(shù)次選用背面穴位，取俯臥位。針灸干預(yù)由具有5年以上經(jīng)驗(yàn)的針灸臨床醫(yī)師實(shí)施。

1.2.3 安神補(bǔ)腎針灸組：在促排卵實(shí)施的過(guò)程中給予安神補(bǔ)腎針灸干預(yù)方案。選穴方案：神庭、合谷、太沖、三陰交、關(guān)元、足三里、神闕(灸)、百會(huì)、肝俞、脾俞、腎俞、命門(灸)。施術(shù)方式、療程同常規(guī)針灸組。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 主要結(jié)局指標(biāo)：優(yōu)質(zhì)胚胎率，經(jīng)顯微鏡下觀察胚胎形態(tài)評(píng)定。

1.3.2 次要結(jié)局指標(biāo)：經(jīng)陰道彩超動(dòng)態(tài)檢測(cè)進(jìn)周后卵泡發(fā)育情況，記錄進(jìn)周當(dāng)天、進(jìn)周第7天、HCG注射日發(fā)育卵泡個(gè)數(shù)、卵泡平均直徑(卵泡最大切面的兩條垂直徑線的平均值)，促排天數(shù)、取卵數(shù)、受精率、兩個(gè)原核(2 Pronucleus,2PN)的胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/率及囊胚形成率。

1.3.3 基本病情相關(guān)指標(biāo)：不孕癥類型、不良妊娠次數(shù)、生產(chǎn)次數(shù)、未避孕未孕月數(shù)、FSH、LH、E2、AMH、AFC水平[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以“中位數(shù)(25%百分位數(shù)，75%百分位數(shù))”表示，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組卵泡發(fā)育情況對(duì)比 見(jiàn)表2、3。 各組受試者進(jìn)周當(dāng)天卵泡個(gè)數(shù)、卵泡平均直徑、促排天數(shù)均具有可比性的前提下，HCG注射前7 d，兩個(gè)針灸組平均卵泡直徑顯著超過(guò)對(duì)照組(P=0.003)，前兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但以安神補(bǔ)腎針灸組的卵泡直徑增長(zhǎng)最快。HCG注射當(dāng)日兩個(gè)針灸組平均卵泡直徑分別為18.25(17.81,18.89)mm和18.25(17.45,18.87)mm，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都顯著高于對(duì)照組的17.48(15.93,18.60)mm。在卵泡個(gè)數(shù)方面，三組在基線、HCG注射前7 d及HCG注射日三個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但安神補(bǔ)腎針灸組受試者在HCG注射當(dāng)日，直徑大于14 mm的卵泡個(gè)數(shù)占優(yōu)，與另外兩組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.020)。說(shuō)明針灸可以促進(jìn)促排卵期卵泡的發(fā)育，且使卵泡生長(zhǎng)的同步性更好。

表2 促排卵期各組卵泡平均直徑與促排天數(shù)比較

表3 促排卵期各組卵泡個(gè)數(shù)比較(個(gè))

2.2 各組取卵、受精及優(yōu)質(zhì)胚胎情況比較 見(jiàn)表4。經(jīng)歷相同的促排期后，三組受試者取卵個(gè)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.696)，但受精率以安神補(bǔ)腎針灸組最高，常規(guī)針灸組次之，且與對(duì)照組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。2PN胚胎率三組之間基本一致(均P=0.820)。優(yōu)質(zhì)胚胎個(gè)數(shù)仍以安神補(bǔ)腎針灸組最高，常規(guī)針灸組次之，與對(duì)照組之間兩兩對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但優(yōu)質(zhì)胚胎率的比較中，安神補(bǔ)腎針灸組、常規(guī)針灸組、對(duì)照組分別為0.50(0.44,0.60)、0.38(0.25,0.50)、0.33(0.00,0.57)，兩個(gè)針灸組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)照組同兩個(gè)針灸組之間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.011)。囊胚形成率組間比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4 各組取卵及受精卵發(fā)育情況比較

2.3 不良反應(yīng) 3例輕度不良反應(yīng)事件，均為取針后局部血瘀，其中1例為安神補(bǔ)腎針灸組，2例為對(duì)照組，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.555)。囑受試者當(dāng)日保持血瘀處局部干燥清潔，未行其他處理。

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為女性不孕歸屬“全不產(chǎn)”“無(wú)子”“斷緒”等范疇。腎氣盛，天癸至，沖任氣血調(diào)暢是胎孕的基礎(chǔ)。若先天稟賦不足或房事不節(jié)，損傷腎氣、沖任不調(diào)，胞脈失于溫煦，則不能攝精成孕[8]。中醫(yī)治療該病，補(bǔ)腎益氣，調(diào)攝沖任是首要原則[9-10]。本研究通過(guò)觀察針灸干預(yù)促排卵期間卵泡的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)針刺能促進(jìn)促排卵期間卵泡的發(fā)育，并提高體外受精率和優(yōu)勢(shì)胚胎率，可為胚胎移植奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

首先，結(jié)果發(fā)現(xiàn)促排卵期間針灸干預(yù)對(duì)受試者卵泡個(gè)數(shù)影響不大，但能促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育的同步。目前，臨床最常用的方法既是采用B超測(cè)量卵泡大小，卵泡的數(shù)量和生長(zhǎng)的同步性是把握促排藥物劑量和注射促性腺激素啟動(dòng)時(shí)機(jī)的重要參數(shù)。已有研究證實(shí)[11]針刺可有效提高取卵前卵泡膜血流指數(shù)，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、優(yōu)勢(shì)胚胎率，結(jié)論與本研究一致。對(duì)卵巢功能障礙的不孕人群，針刺不僅能促排卵可改善生殖激素水平，還能促進(jìn)卵泡發(fā)育[12-13]。自然狀態(tài)下的卵泡發(fā)育到18～22 mm是其破裂排卵的時(shí)機(jī)，但在輔助生殖技術(shù)誘發(fā)的卵泡生長(zhǎng)周期中對(duì)卵泡大小的監(jiān)測(cè)需更加謹(jǐn)慎：當(dāng)單個(gè)或一批主導(dǎo)卵泡直徑超過(guò)14 mm時(shí)，是判斷取消周期或使用拮抗劑的一個(gè)重要信號(hào)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在HCG注射日當(dāng)天，安神補(bǔ)腎針灸組受試者平均卵泡直徑最大，且直徑大于14 mm的卵泡個(gè)數(shù)最多，說(shuō)明針灸療法不僅能促進(jìn)卵泡長(zhǎng)大，還能優(yōu)化卵泡發(fā)育的同步性。若卵泡直徑相差過(guò)大，外源性Gn的啟動(dòng)可能加大卵泡發(fā)育的不同步，最終降低取卵個(gè)數(shù)，因此針灸是提高取卵數(shù)的又一保障。

在取卵和受精情況的比較中，三組的取卵個(gè)數(shù)基本持平，但兩個(gè)針灸組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于對(duì)照組。這種差異與針灸療法及穴位的特異性效應(yīng)相關(guān)。安神補(bǔ)腎組的選穴方案以神庭、四關(guān)、三陰交為主穴，是以中醫(yī)“心腦-腎氣-天癸-沖任-胞宮” 生殖軸的新模式，并認(rèn)為它與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“大腦皮層-下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖” 軸的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)相似[15]。神庭重在調(diào)節(jié)心神與腦神，三陰交平衡肝、脾、腎，四關(guān)重在通達(dá)氣血。三組穴位配合，貫穿心腦、腎氣與陰陽(yáng)，整體調(diào)節(jié)生殖軸，使精血充足，沖任有養(yǎng)，促進(jìn)卵泡發(fā)育。本次療程是根據(jù)促排卵周期安排的，從促排卵當(dāng)天開(kāi)始，直至取卵前1 d，針灸治療10～11次，總療程不超過(guò)2周。安神補(bǔ)腎針灸組和常規(guī)針灸組之間各結(jié)局指標(biāo)僅存在變化趨勢(shì)，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮為療程不夠。中醫(yī)藥參與IVF-ET的時(shí)機(jī)應(yīng)該從進(jìn)促排卵周期前開(kāi)始，改善患者卵巢功能和子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎移植打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[16-17]。通過(guò)對(duì)針刺改善IVF-ET臨床妊娠率的研究分析，發(fā)現(xiàn)大多干預(yù)周期均在進(jìn)周前1～4個(gè)月經(jīng)周期開(kāi)始，足療程的針灸干預(yù)會(huì)提高獲卵數(shù)、受精率、可利用胚胎率，并最終提高臨床妊娠率[18-19]。

本研究在實(shí)施過(guò)程中，也存在一些局限：①未進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，若是肝郁伴腎陽(yáng)虛的患者，配合安神補(bǔ)腎針灸方案可能在臨床妊娠率上獲效更優(yōu)；② 受設(shè)備的限制，沒(méi)能完整監(jiān)測(cè)卵泡的長(zhǎng)、寬、高，只有三維數(shù)據(jù)才能更好地反映卵泡的形態(tài)變化，甚至可能挖掘出針刺對(duì)卵泡形態(tài)學(xué)發(fā)育的修正效果；③未對(duì)妊娠率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由于納入受試者取卵后行新鮮胚胎移植和冷凍復(fù)蘇胚胎移植比例組間不均衡，且行凍胚移植的時(shí)間距取卵的時(shí)間個(gè)體間差異較大，并未隨訪到所有受試者的胚胎移植及妊娠情況；④未采集到受試者取卵前激素水平，這些指標(biāo)能在一定程度上幫助評(píng)估胚胎著床的成功率[20]。一是并非所有受試者在取卵前都經(jīng)激素水平的監(jiān)測(cè)，二是在監(jiān)測(cè)了激素水平的受試者采血的時(shí)間點(diǎn)根據(jù)其促排卵周期長(zhǎng)短的差異不盡相同，因此這部分?jǐn)?shù)據(jù)不完整且不具有時(shí)間上的統(tǒng)一性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證針刺效應(yīng)，需根據(jù)不孕癥患者的基本情況和所處的周期，設(shè)計(jì)符合針刺即時(shí)效應(yīng)、遠(yuǎn)期效應(yīng)特點(diǎn)的干預(yù)方案，并選擇合適的評(píng)價(jià)指標(biāo)針對(duì)IVF-ET各關(guān)鍵階段進(jìn)行動(dòng)態(tài)結(jié)果追蹤，保證針刺實(shí)施的質(zhì)量和刺激量，才能真正體現(xiàn)出針刺助孕效應(yīng)，拓寬針刺助孕的應(yīng)用前景。