8種微生物源藥劑對葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的防治

李嘉泓，杜 娟，顧沛雯，張 樂，趙 楠，何金柱

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.楊凌翔林農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司，陜西楊凌 712100；3.寧夏農(nóng)墾玉泉營農(nóng)場有限公司，銀川 750104)

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是世界上危害最嚴(yán)重的植物病原線蟲，寄主范圍廣泛，為害嚴(yán)重[1]，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%以上，嚴(yán)重制約蔬菜、糧食、果樹及觀賞作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)[2]。寧夏是中國生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的最佳生態(tài)區(qū)之一，近年來，隨著葡萄種植面積的擴(kuò)大和種植年限的延長，葡萄根結(jié)線蟲病害在寧夏各產(chǎn)區(qū)呈蔓延趨勢，尤其在葡萄育苗圃中發(fā)生嚴(yán)重，對葡萄苗木生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[3]，已成為制約寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一大障礙。

根結(jié)線蟲病為典型的土傳病害，生產(chǎn)上多以化學(xué)藥劑防治為主，但化學(xué)藥劑會(huì)造成土壤污染和誘導(dǎo)線蟲產(chǎn)生抗藥性等問題，因此生物防治成為防治根結(jié)線蟲病的最佳策略之一。芽胞桿菌(Bacillus)是細(xì)菌型生防藥劑中最重要的一類，在防治根結(jié)線蟲方面具有良好效果[4]。2011年，梁建根等[5]發(fā)現(xiàn)巨大芽胞桿菌(B.megaterium)發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲(M.incognita)2齡幼蟲有一定毒殺作用，校正死亡率為70.8%，在室內(nèi)盆栽的防治效果為47.8%。2015年，席先梅等[6]發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽胞桿菌(B.cereus)水劑對設(shè)施黃瓜、番茄根結(jié)線蟲具有良好的防治效果，防效達(dá) 56.3%。2019年，D’Errico等[7]研究發(fā)現(xiàn)早春或早秋在番茄作物上施用堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌(B.firmus)，可抑制根結(jié)線蟲的種群密度，促進(jìn)番茄作物生長。淡紫擬青霉(Purpureocilliumlilacinum)作為一種線蟲內(nèi)寄生性真菌，是目前生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的殺線蟲藥劑。2014年，陸然等[8]研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉(P.lilacinum)對根結(jié)線蟲卵孵化的相對抑制率達(dá)96.67%，并對根結(jié)線蟲2齡幼蟲具有較好的毒殺效果。2019年，Ahmed等[9]發(fā)現(xiàn)施用淡紫擬青霉(P.lilacinum)后，85%的根結(jié)線蟲卵會(huì)被寄生，減少了根結(jié)線蟲的侵染為害，促進(jìn)番茄植株的生長。

本研究以寧夏玉泉營鎮(zhèn)葡萄苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲病為對象，在系統(tǒng)調(diào)查苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲病危害的情況下，通過室內(nèi)毒力測定和苗圃防效試驗(yàn)測定7種芽胞桿菌(Bacillus)和1種淡紫擬青霉(P.lilacinum)對葡萄根結(jié)線蟲的毒殺效果，以期為葡萄苗圃根結(jié)線蟲病害的生物防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試植物：2019年5-10月在寧夏玉泉營鎮(zhèn)農(nóng)墾集團(tuán)感染根結(jié)線蟲病的葡萄育苗基地生產(chǎn)區(qū)采集葡萄苗木，葡萄苗齡為1 a生，葡萄品種包括‘赤霞珠’‘霞多麗’‘西拉’‘品麗珠’‘黑比諾’‘梅鹿輒’‘馬瑟蘭’‘陽光玫瑰’‘夏黑’‘愛神玫瑰’‘大青’‘無核翠寶’‘紅芭拉蒂’‘貝達(dá)’和‘抗砧3號’。

供試蟲源：從葡萄品種陽光玫瑰幼苗根系中獲得。先解剖根系的根結(jié)組織獲得卵囊，將卵囊置于無菌水中，24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化2～5 d，獲取2齡幼蟲，經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲(M.incognita)，用于室內(nèi)防效試驗(yàn)。

供試藥劑：100億cfu/g側(cè)孢芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g解淀粉芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g地衣芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g巨大芽胞桿菌可濕性粉劑、50億cfu/g膠凍芽胞桿菌可濕性粉劑和50億cfu/g蠟樣芽胞桿菌可濕性粉劑，江蘇綠科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，推薦用量均為1～2 kg/667m2；100億cfu/g淡紫擬青霉可濕性粉劑，山東諾杰生物科技有限公司，推薦用量為200～400 g/667m2；5%噻唑膦微乳劑，山東綠德地生物科技有限公司，推薦用量為1 250～1 500 mL/667m2；1.8%阿維菌素乳油，上海悅聯(lián)化工有限公司，推薦用量為500 mL/667m2；25%復(fù)合氨基酸，江蘇漢菱肥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄苗圃根結(jié)線蟲病癥狀及嚴(yán)重度調(diào)查 2019年5月，調(diào)查苗圃內(nèi)15個(gè)葡萄品種根結(jié)線蟲病害的發(fā)生情況，每個(gè)葡萄品種劃分為3個(gè)樣區(qū)，樣區(qū)面積為10 m2(1 m×10 m)，樣區(qū)內(nèi)苗木數(shù)為70～80株，在每個(gè)樣區(qū)中均按照隨機(jī)取樣的原則采集5株苗木，共采集225株葡萄苗木。依據(jù)拔根百分法[10]統(tǒng)計(jì)嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)。嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，根系無根結(jié)；1 級，根系1%～10%有根結(jié)；2 級，根系 11%～25%有根結(jié)；3級，根系 26%～50%有根結(jié)；4 級，根系 51%～75%有根結(jié)；5 級，根系 76%以上有根結(jié)。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100

1.2.2 葡萄根結(jié)線蟲病室內(nèi)毒力測定 按藥劑說明書，配置活化芽胞桿菌和淡紫擬青霉孢子粉的營養(yǎng)液(含0.001%紅糖和0.01%復(fù)合氨基酸)。分別稱取100 g側(cè)孢芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、淡紫擬青霉孢子粉及200 g膠凍芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌孢子粉，溶解在1 L營養(yǎng)液中，30 ℃孵育12 h，用于激活菌劑。吸取搖勻菌液，按照稀釋平板法[11]檢測有效活菌數(shù)。依據(jù)活菌數(shù)將8種菌劑分別配置成有效孢子濃度為1.0×109cfu/mL的母液。用營養(yǎng)液稀釋成孢子濃度為 1.0×108、5.0×107、2.5×107、1.25×107和 6.25×106cfu/mL梯度溶液，阿維菌素和噻唑膦依推薦用量分別配置為16.7 mg/L和50 mg/L的溶液。

采用程永等[12]直接觸殺法進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。具體操作如下：在96孔板酶標(biāo)板(無錫國盛生物工程有限公司)上，每孔加入150 μL藥液和10只活躍的2齡幼蟲。每種藥劑按孢子濃度設(shè)5組處理，每處理重復(fù)9次，另設(shè)阿維菌素和噻唑膦為陽性對照，清水為陰性對照。孵育在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔12 h在光學(xué)顯微下觀察2齡幼蟲的存活情況，持續(xù)觀察4 d，計(jì)算校正死亡率。并拍照各藥劑處理后2齡幼蟲致死癥狀。

校正死亡率=(處理死亡率-清水對照死亡率)/(1-清水對照死亡率)×100%

1.2.3 葡萄苗圃根結(jié)線蟲病防效試驗(yàn) 2019年10月于寧夏玉泉營鎮(zhèn)葡萄育苗基地生產(chǎn)區(qū)設(shè)施溫棚內(nèi)開展田間防效試驗(yàn)。葡萄品種為陽光玫瑰，選用室內(nèi)毒力測定防效好的3種藥劑。按照“1.2.2”的方法分別將枯草芽胞桿菌、膠凍芽胞桿菌和淡紫擬青霉用營養(yǎng)液孵育活化，配置成孢子濃度為1.0×108cfu/mL的藥液，以500 mL/667m2的阿維菌素(有效濃度為16.7 mg/L)和1 500 mL/667m2的噻唑膦(有效濃度為50 mg/L)作為陽性對照，施加等量清水為陰性對照，共設(shè)6個(gè)處理，每處理防治面積為10 m2(1 m×10 m)，處理間設(shè)置隔離保護(hù)行(兩行)，每處理重復(fù)3次。各藥劑共施用3次，施藥間隔期為7 d。采用灌根方式每次每小區(qū)施藥量為1 L。依據(jù)“1.2.1”中拔根百分法統(tǒng)計(jì)各處理間的病情指數(shù)。

參照劉玉霞等[13]的方法，每處理小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取20 cm深的根際土壤，土樣混合均勻后稱取100 g，采用貝爾曼式漏斗法分離土壤中的根結(jié)線蟲2齡幼蟲，在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)線蟲個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)在施藥前和施藥后各處理100 g土壤中線蟲的數(shù)量，計(jì)算土壤線蟲減退率，按土壤中線蟲減退率計(jì)算防治效果。

線蟲減退率=(處理前空白對照2齡幼蟲數(shù)量-處理后小區(qū)2齡幼蟲數(shù)量)/處理前空白對照2齡幼蟲數(shù)量×100%

防治效果=(處理區(qū)2齡幼蟲的減退率-對照區(qū)2齡幼蟲減退率)/(1-對照區(qū)2齡幼蟲減退率)×100%

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用DPS軟件，以專業(yè)統(tǒng)計(jì)-生物測定-數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)值分析計(jì)算各藥劑毒力回歸方程斜率、相關(guān)系數(shù)和致死中濃度，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄苗圃根結(jié)線蟲病癥狀

葡萄苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲為害癥狀表現(xiàn)為地上部生長勢弱、植株矮小，葉片黃化、易脫落，葉緣卷曲(圖1-A)。根系(地下部)的主根和側(cè)根均形成大小不一的根結(jié)，有的根結(jié)連接成塊，形成褐色的根結(jié)瘤，最終根結(jié)連同病根腐爛壞亡，有的根結(jié)在根段上密集散布，形成念珠狀結(jié)構(gòu)。根系受害嚴(yán)重時(shí)通常表現(xiàn)出結(jié)瘤、短粗、叢生、壞死等癥狀，致使根系吸收肥水能力減弱，影響葡萄苗的生長(圖1-B)。在體視顯微鏡下將根結(jié)表皮輕輕撥開，剖面上出現(xiàn)的白色梨形球狀物為根結(jié)線蟲雌蟲，蟲體主要寄生在根系的韌皮部(圖1-C)。

2.2 葡萄苗圃根結(jié)線蟲發(fā)病情況調(diào)查

寧夏玉泉營鎮(zhèn)葡萄苗圃15個(gè)品種中，除‘抗砧3號’外，其余14個(gè)葡萄品種均感染根結(jié)線蟲病，且不同葡萄品種受根結(jié)線蟲為害的嚴(yán)重度有明顯差異，其中‘西拉’感染根結(jié)線蟲病最嚴(yán)重，病情指數(shù)高達(dá)78.33；其次是‘紅芭拉蒂’，病情指數(shù)為70.00；‘大青’感染根結(jié)線蟲病較輕，病情指數(shù)為21.67(表1)。

表1 寧夏玉泉營鎮(zhèn)葡萄苗圃根結(jié)線蟲病調(diào)查

2.3 葡萄根結(jié)線蟲室內(nèi)毒力測定

2.3.1 8種微生物源藥劑對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒殺效果 8種微生物源藥劑在有效濃度為1.0×108cfu/mL觸殺處理96 h(4 d)，淡紫擬青霉對2齡幼蟲的累積校正死亡率最高，達(dá) 99.17%，與阿維菌素和噻唑膦致死效果相當(dāng)；其次是膠凍芽胞桿菌，累積校正死亡率為85.00%；1.0×108cfu/mL枯草芽胞桿菌累積校正死亡率為52.50%，致死效果較好；其余藥劑的累積校正死亡率均在50%以下，致死效果較差(表2)。

表2 8種微生物源藥劑對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的致死率

毒力測定結(jié)果表明，在處理96 h(4 d)后，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50值分別為3.56×106、3.69×106和8.58×107cfu/mL，毒力效果為淡紫擬青霉>膠凍芽胞桿菌>枯草芽胞桿菌?？傮w來看，淡紫擬青霉對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒殺效果最強(qiáng)，膠凍芽胞桿菌次之，枯草芽胞桿菌則相對較弱(表3)。

表3 淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲毒力測定相關(guān)參數(shù)

2.3.2 藥劑在不同孢子濃度和處理時(shí)間下對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死效果 淡紫擬青霉(圖2-A)、膠凍芽胞桿菌(圖2-B)和枯草芽胞桿菌(圖2-C)對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的校正死亡率均隨著孢子濃度和處理時(shí)間的增加而增高，且這3種藥劑對2齡幼蟲的致死效果不同。當(dāng)藥劑處理60 h時(shí)，使校正死亡率達(dá)到50%，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌所需要的孢子濃度依次為6.25×106cfu/mL、1.25×107cfu/mL和 1.0×108cfu/mL。此外，當(dāng)3種藥劑孢子濃度為 1.0×108cfu/mL時(shí)，使校正死亡率均達(dá)到50%，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌所需要的處理時(shí)間依次為24 h、36 h和60 h。表明淡紫擬青霉在較短的處理時(shí)間和較低的孢子濃度下，仍然會(huì)對2齡幼蟲具有較好的致死效果。由此可知，淡紫擬青霉對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的致死效果最好，膠凍芽胞桿菌次之，枯草芽胞桿菌相對較差。

2.3.3 不同藥劑處理后南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死癥狀 南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲經(jīng)枯草芽胞桿菌、膠凍芽胞桿菌、淡紫擬青霉和阿維菌素4種藥劑處理后，蟲體呈現(xiàn)“J”型死狀，體前端出現(xiàn)小泡狀的組織崩解(圖3-A～3-D)，其中枯草芽胞桿菌處理后，整個(gè)蟲體透明，蟲體內(nèi)容物變淺未發(fā)生聚集(圖3-A)；膠凍芽胞桿菌處理后，蟲體前端出現(xiàn)密集的點(diǎn)狀小泡，組織崩解程度高(圖3-B)；淡紫擬青霉處理后，體前端崩解程度低，蟲體中部出現(xiàn)部分內(nèi)容物聚集(圖3-C)；阿維菌素處理后，體前端崩解程度高，且蟲體中后端內(nèi)容物大量聚集(圖3-D)。噻唑膦處理后，整個(gè)蟲體破裂，皺縮(圖3-E)。

2.4 葡萄苗圃根結(jié)線蟲的防效試驗(yàn)

淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對葡萄苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲病均有一定的防治效果，其中淡紫擬青霉的防效最好，根際土壤線蟲減退率最高，為85.43%，防治效果可達(dá)83.11%；其次是膠凍芽胞桿菌，根際土壤的線蟲減退率和防效分別為79.53%和76.26%，淡紫擬青霉和膠凍芽胞桿菌的防效均高于化學(xué)藥劑噻唑膦；枯草芽胞桿菌的防效較差，應(yīng)用價(jià)值低(表4)。

表4 3種微生物源藥劑對葡萄苗圃根結(jié)線蟲的防治效果

3 討 論

根結(jié)線蟲作為一類分布廣、危害性大且難以防治的植物寄生線蟲，已成為制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在葡萄苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲病害發(fā)生較重，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的釀酒葡萄品種‘西拉’的病情指數(shù)高達(dá)78.33。葡萄苗木受根結(jié)線蟲的為害后，地上部表現(xiàn)出生長衰弱、植株矮小、葉片黃化，根系形成念珠狀根結(jié)，這與劉勇等[14]發(fā)現(xiàn)的葡萄根結(jié)線蟲病害癥狀一致。葡萄苗圃中高復(fù)種指數(shù)造成根結(jié)線蟲的蟲卵累積，導(dǎo)致根結(jié)線蟲病害迅速傳播蔓延，在生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)引起高度重視。

微生物源藥劑具有環(huán)境污染小、對人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸替代化學(xué)藥劑，成為線蟲病害綠色防控的主要手段[15]。本研究通過室內(nèi)毒力測定和苗圃防效試驗(yàn)測定了8種生物藥劑對葡萄根結(jié)線蟲病的防效，發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉(P.lilacinum)對根結(jié)線蟲2齡幼蟲具有良好的毒殺和防治效果(校正死亡率為99.17%和防治效果為83.11%)，能破壞根結(jié)線蟲2齡幼蟲內(nèi)部組織，使其死亡。這與王曦茁等[16]和Sarven等[17]的研究結(jié)果一致。

膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)是一種硅酸鹽細(xì)菌，具有分解鋁硅鹽類原生質(zhì)態(tài)礦物的能力，常被用作果蔬和農(nóng)作物種植的微生物菌肥[18]。研究發(fā)現(xiàn)膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)具有病害防治的潛質(zhì)，在棉花炭疽病、茄子和香蕉枯萎病等病害防治已有良好的應(yīng)用前景[19-20]。但目前國內(nèi)尚未有關(guān)于膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)防治線蟲病害的研究報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)具有殺線活性(校正死亡率為85.00%和防治效果為76.26%)，這對今后微生物源殺線制劑的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

微生物源藥劑作為一種安全有效手段在植物根結(jié)線蟲防治中得到了廣泛的研究和應(yīng)用[21]。本研究成功篩選出淡紫擬青霉(P.lilacinum)和膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)兩種微生物源藥劑能有效防治葡萄根結(jié)線蟲病，可作為葡萄苗圃內(nèi)根結(jié)線蟲病害防治的首選藥劑進(jìn)行推廣應(yīng)用。