蠶豆赤斑病病原菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究

馬生彪，王 立，蔣晶晶，冶曉燕，呂昭龍，李繼平,，鄭 果，惠娜娜

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；3.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

蠶豆(Broad bean)，又稱(chēng)胡豆、佛豆、川豆、羅漢豆等，為豆科蠶豆屬1 a生草本植物[1]，分布在歐洲、非洲和亞洲的不同氣候區(qū)。中國(guó)是世界上蠶豆種植面積最大的國(guó)家，同時(shí)也是蠶豆消費(fèi)大國(guó)之一，僅2019年中國(guó)蠶豆市場(chǎng)需求量達(dá) 190.26萬(wàn)t[2]，蠶豆主要在甘肅、青海、湖北、云南、四川等地種植[3]。蠶豆除具有食用、藥用和培肥地力等用途外[4]，更重要的是還可以作為青貯飼料，蠶豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值較高,含有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、礦物質(zhì)、維生素、鈣和鐵等[5-6]，是一種優(yōu)質(zhì)青飼料，蠶豆種植業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展既擴(kuò)大青飼料的來(lái)源范圍,又能有效地解決青飼料的利用時(shí)間差。

隨著全球氣候變化和人類(lèi)活動(dòng)等各種因素的影響，蠶豆種植產(chǎn)區(qū)各種病蟲(chóng)害問(wèn)題日益凸顯,造成產(chǎn)量損失非常嚴(yán)重[7]。特別是蠶豆赤斑病、霜霉病和枯萎病等[8]，嚴(yán)重影響蠶豆的正常生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花結(jié)莢,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度下降。國(guó)內(nèi)蠶豆赤斑病在長(zhǎng)江流域和東南沿海的蠶豆產(chǎn)區(qū)，常年發(fā)病且嚴(yán)重[9]，自2008年，蠶豆赤斑病已經(jīng)逐漸上升為甘肅省蠶豆種植產(chǎn)區(qū)主要病害[10]。據(jù)報(bào)道，蠶豆赤斑病可由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、蠶豆葡萄孢(B.fabae)、擬蠶豆葡萄孢(B.fabiopsis)引起[11-12]，主要危害蠶豆葉片、莖以及種子等部位，病原菌主要以菌核的形態(tài)在作物殘茬上越冬，遇到高濕和適宜溫度，對(duì)幼苗進(jìn)行侵染，通過(guò)氣流傳播引起危害，導(dǎo)致蠶豆產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降，產(chǎn)量損失達(dá)28%～40%[13-14]。蠶豆的生長(zhǎng)發(fā)育期除了病害防治外，水分、光照、種植方式和氮磷鉀肥的科學(xué)配施等對(duì)蠶豆產(chǎn)量影響也至關(guān)重要[15-17]。

近年來(lái)，甘肅省蠶豆赤斑病發(fā)生有逐年加重趨勢(shì)，嚴(yán)重影響蠶豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，據(jù)2020年在渭源、臨夏等地調(diào)查，病田率達(dá)100%，平均損失率在30%以上，在防治方面技術(shù)落后，甘肅乃至西北有關(guān)蠶豆赤斑病的研究較少，尤其是在其病原及其生物學(xué)特性研究方面，甘肅僅在康樂(lè)縣報(bào)道了蠶豆赤斑病病原菌，分離出灰葡萄孢(B.cinerea)、蠶豆葡萄孢(B.fabae)、擬蠶豆葡萄孢(B.fabiopsis)3 種病原，其中灰葡萄孢分離率最高[18]。本研究針對(duì)甘肅渭源縣蠶豆赤斑病的致病菌種類(lèi)與生物學(xué)特性開(kāi)展研究，以期為該病害的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品 病葉樣本采自甘肅省渭源縣蠶豆種植區(qū)發(fā)病植株。供試蠶豆品種為‘青蠶9號(hào)’。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂13 g，加水定容至1 000 mL)、水瓊脂培養(yǎng)基(water agar medium，WA)、燕麥片瓊膠培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基[19]。以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的蔗糖分別替換成等質(zhì)量的麥芽糖、乳糖和葡萄糖，制成不同碳源的培養(yǎng)基。采取同樣的方法將培養(yǎng)基中的硝酸鈉替換成等質(zhì)量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、氯化銨和甘氨酸，制成不同氮源的培養(yǎng)基[20]。

1.1.3 試劑及儀器 瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司)，葡萄糖(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，蔗糖(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，硝酸鈉(廣東光華科技股份有限公司)，真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，Cat#D 2300 Size:100T)，生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司，DHP-9162型)等。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與純化 將病葉用自來(lái)水沖洗，在病健交界處切取大小為4 mm×4 mm的葉塊，浸入體積分?jǐn)?shù)75%左右的酒精溶液中消毒 45 s，然后移入體積分?jǐn)?shù)3%左右的次氯酸鈉溶液中處理35 s(時(shí)間根據(jù)材料不同而定)，再用滅菌水清洗2次，轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙上，待水吸干后，用滅菌鑷子移入PDA培養(yǎng)基平板上，每皿均勻移置5塊，放入25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板進(jìn)行純化，編號(hào)為WYCDCB，純化菌在PDA斜面上置于4 ℃保存[19]。部分PDA平板上的純化菌置于25 ℃恒溫條件下觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 致病性測(cè)定 采用活體葉片孢子懸浮液接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。刮取PDA平板上待測(cè)菌株WYCDCB的菌絲至蒸餾水中，振蕩渦旋，濾去菌絲殘?bào)w，獲得清液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整為1×105mL-1孢子懸浮液[21]，用移液槍吸取10 μL，滴2～4滴于蠶豆葉片表面，設(shè)重復(fù)3次[22]。采用同樣的方法用移液槍滴2～4滴滅菌水為對(duì)照。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：該菌在PDA平板活化后，用滅過(guò)菌的打孔器(直徑為5 mm)打取菌餅，移置于PDA培養(yǎng)基平板中央，重復(fù)3次。置25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，每隔1 d觀察并記錄菌落形態(tài)、氣生菌絲狀況、顏色變化等。對(duì)孢子形態(tài)、大小及顏色進(jìn)行顯微觀察、拍照，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定[23]。

分子生物學(xué)鑒定：利用真菌DNA提取試劑盒提取該菌株DNA，將菌株WYCDCB移植于PDA平板上進(jìn)行活化，3 d后將菌落邊緣的新鮮菌絲轉(zhuǎn)到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上培養(yǎng)，7 d后刮取菌絲，提取DNA。PCR所用的引物為rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4[24]和蠶豆葡萄孢特異性引物G3PDH[23]。引物序列分別為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；G3PDHfor(5′-ATTGACATCGTCGCTGTCAACGA-3′)、G3PDHrev(5′-ACCCCACTCGTTGTCGTACCA-3′)。引物均由生工生物工程(上海)有限股份公司合成。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限股份公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得相關(guān)葡萄孢的ITS和G3PDH基因序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 7.0(www.megasoftware.net)軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定待測(cè)菌株WYCDCB的種類(lèi)。

1.2.4 生物學(xué)特性測(cè)定 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將待測(cè)菌株WYCDCB轉(zhuǎn)接在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，打取直徑為5 mm的菌餅，移至PDA平板上，分別于5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[25]。

pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液，將PDA培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，制成PDA平板，將待測(cè)菌株WYCDCB培養(yǎng)菌打成直徑為5 mm的菌餅，移至以上PDA平板，置于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每處理重復(fù)3次[26]。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將待測(cè)菌株WYCDCB的培養(yǎng)菌制成直徑為5 mm的菌餅移至PDA平板上,在人工氣候箱內(nèi)設(shè)置4種光照條件，分別為24 h連續(xù)光照、16 h光照+8 h黑暗、12 h光照+12 h黑暗和24 h連續(xù)黑暗。置于 25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每處理重復(fù)3次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將待測(cè)菌株WYCDCB培養(yǎng)菌制成直徑為5 mm的菌餅分別移至碳源為麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和缺碳源的Czapek培養(yǎng)基(對(duì)照)平板上，采取同樣的方法將菌餅分別移至氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、甘氨酸和缺氮源的Czapek培養(yǎng)基(對(duì)照)平板上，置于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，每處理重復(fù)3次[27]。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將待測(cè)菌株WYCDCB 培養(yǎng)菌制成直徑為5 mm的菌餅分別移至Czapek、PDA、WA和燕麥培養(yǎng)基平板上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，每處理重復(fù)3次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 DNA序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gon)序列比對(duì)工具BLAST程序(nucleotide blast)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Excel 2010、SPSS 23(IBM公司，美國(guó))軟件利用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆赤斑病癥狀與分離結(jié)果

蠶豆赤斑病癥狀：蠶豆赤斑病主要危害葉片，發(fā)病初期葉片布滿黑褐色小斑點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展成卵圓形、橢圓形、長(zhǎng)圓形等病斑，病斑中央略凹陷，周緣稍隆起，病健交界明顯，病斑分布于葉片兩面，嚴(yán)重時(shí)病斑處葉片表皮破裂形成裂痕(圖1)。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

對(duì)蠶豆葉片接種待測(cè)菌株WYCDCB，5 d后葉片產(chǎn)生大小不同的黑褐色病斑，15 d后病斑擴(kuò)展成橢圓形和卵圓形，病斑顏色由黑褐色逐漸向淺褐色過(guò)度。25 d后葉片布滿不規(guī)則病斑，病斑中央略凹陷，周緣稍隆起，葉片邊緣開(kāi)始枯萎。發(fā)病癥狀與田間采集的病葉癥狀類(lèi)似。對(duì)接種發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌再分離、純化培養(yǎng)，得到與原接種菌形態(tài)學(xué)相同的病原菌。因此，判定該病原菌為當(dāng)?shù)匦Q豆赤斑病的致病菌(圖2)。

2.3 病原菌菌落特征及顯微形態(tài)

該菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期為灰白色，菌絲呈繩索狀，長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后開(kāi)始形成菌核，初期菌核顏色為淺褐色，后期產(chǎn)生大量排列不規(guī)則的黑褐色小菌核，菌核從菌絲塊向邊緣成熟，形狀大多呈球形、橢圓形和卵圓形等。根據(jù)形態(tài)特征及顯微形態(tài)可初步鑒定該病原菌為葡萄孢屬(Botrytis)(圖3)。

2.4 基因序列分析

經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中葡萄孢屬的一些種的rDNA-ITS和G3PDH序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)待測(cè)菌株WYCDCB的序列分別與蠶豆葡萄孢(MK217907.1)序列同源性達(dá)99%、蠶豆葡萄孢(AJ705013.1)序列同源性達(dá)100%，待測(cè)菌株WYCDCB與蠶豆葡萄孢的親緣關(guān)系最近，且和對(duì)應(yīng)的菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一類(lèi)。采用Mega 7.0鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于rDNA-ITS和G3PDH序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在Mega 7.0軟件中Bootstrap method設(shè)置1 000次對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，待測(cè)菌株WYCDCB與蠶豆葡萄孢(MK217907.1；AJ705013.1)聚在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一個(gè)分枝(圖4，圖5)。能將待測(cè)菌株WYCDB與參照葡萄孢屬的種分離開(kāi)。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)將待測(cè)菌株鑒定為蠶豆葡萄孢(Botrytisfabae)。

2.5 生物學(xué)特性

2.5.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)菌株WYCDCB菌絲生長(zhǎng)有明顯的影響。測(cè)試表明在5～35 ℃溫度菌絲均能生長(zhǎng)(圖6)，在PDA培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為0.8～7.1 cm。但在不同溫度條件下，該菌株菌落擴(kuò)展速率不同，菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為15～25 ℃，平均菌落直徑為 5.8～7.1 cm。最適溫度為20 ℃，平均菌落直徑為7.1 cm，該溫度處理結(jié)果顯著高于其他處理(P<0.05)，溫度低于5 ℃或高于35 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)，由此可知該菌不耐高溫和低溫。

2.5.2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株WYCDCB菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照不敏感(圖7)。在不同光照24 h光照、16 h光照+8 h黑暗、12 h光照+12 h黑暗和24 h黑暗條件下，菌株在PDA上培養(yǎng)7 d，平均菌落直徑分別為8.16、8.08、8.12和7.92 cm，4種光照條件下菌落直徑無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.5.3 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株WYCDCB在供試的4種不同培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)(圖8)。在PDA上生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為7.13 cm，顯著高于其他3種培養(yǎng)基(P< 0.05)。

2.5.4 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同pH對(duì)菌株WYCDCB菌絲生長(zhǎng)有明顯的影響(圖9)。在供試的8種不同pH培養(yǎng)基上菌絲均能生長(zhǎng)，pH為8時(shí)﹐菌絲生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為6.83 cm。由圖9可見(jiàn)，pH為8的處理顯著高于其他處理(P<0.05)。在pH為4和11的PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)緩慢，可見(jiàn)強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境不利于病原菌生長(zhǎng)。

2.5.5 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株WYCDCB在5種不同碳源培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)具有一定的差異。菌絲生長(zhǎng)最適碳源為乳糖，在乳糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為5.43 cm。蔗糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基菌落直徑顯著低于對(duì)照(P<0.05)，說(shuō)明蔗糖和麥芽糖為碳源影響病原菌的生長(zhǎng)(圖10)。

2.5.6 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株WYCDCB對(duì)8種不同氮源的利用具有一定差異。在供試的8種氮源培養(yǎng)基上菌絲均能生長(zhǎng)(圖11)。在以酵母膏、牛肉膏、氯化銨和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑顯著高于對(duì)照(P<0.05)。說(shuō)明酵母膏、牛肉膏、氯化銨和硫酸銨氮源培養(yǎng)基促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)。在甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基抑制菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為2.17 cm，顯著低于對(duì)照(P<0.05)，說(shuō)明甘氨酸是病原菌的不良氮源。

3 討論與結(jié)論

蠶豆赤斑病是蠶豆生產(chǎn)中一種毀滅性病害，不同蠶豆種植產(chǎn)區(qū)不同蠶豆品種，引起赤斑病的致病菌也不同。湖北地區(qū)蠶豆赤斑病致病菌為灰葡萄孢(B.cinerea)、蠶豆葡萄孢(B.fabae)和擬蠶豆葡萄孢(B.fabiopsis)，其中擬蠶豆葡萄孢引起蠶豆赤斑病在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道[23]。2012年報(bào)道除了湖北省外的部分省份也發(fā)現(xiàn)了擬蠶豆葡萄孢引起蠶豆赤斑病，安徽省和湖北省蠶豆赤斑病的致病菌為灰葡萄孢[18]。本研究?jī)H在甘肅渭源縣對(duì)‘臨蠶9號(hào)’蠶豆品種進(jìn)行蠶豆赤斑病病原菌研究，發(fā)現(xiàn)蠶豆赤斑病是由蠶豆葡萄孢引起的，暫未檢測(cè)到灰葡萄孢、擬蠶豆葡萄孢，其原因可能與蠶豆種植產(chǎn)區(qū)及主栽的蠶豆品種有關(guān)，也可能是病原菌分離范圍與數(shù)量有限所致。

對(duì)植物病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究有助于了解病害發(fā)生規(guī)律及其與環(huán)境因素之間的聯(lián)系。本研究結(jié)果表明，病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為20 ℃，低于5 ℃或高于35 ℃菌絲停止生長(zhǎng)，最適pH為8。這與張靜[23]對(duì)湖北地區(qū)蠶豆葡萄孢生物學(xué)特性研究結(jié)果有差異，其病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃，30 ℃以上菌絲停止生長(zhǎng)，最適pH為6，這可能與采樣品種或地域不同有關(guān)；硫酸銨對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，這與本研究一致，本試驗(yàn)還研究甘氨酸對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)甘氨酸對(duì)菌絲的抑制作用更強(qiáng)；最適碳源為葡萄糖，蔗糖不適宜菌絲生長(zhǎng)這一點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)病原菌生物學(xué)特性研究結(jié)果，在蠶豆種植過(guò)程中可適量施加甘氨酸和硫酸銨以達(dá)到防控病害的目的。

甘肅省主栽蠶豆品種主要有‘臨蠶6號(hào)’‘臨蠶9號(hào)’‘臨蠶13號(hào)’‘臨蠶14號(hào)’‘陵西一寸’(日本)等，本研究?jī)H對(duì)渭源縣‘臨蠶9號(hào)’蠶豆赤斑病病原菌進(jìn)行研究，其他地區(qū)蠶豆赤斑病病原菌有待進(jìn)一步研究。國(guó)外報(bào)道蠶豆赤斑病造成蠶豆感病品種產(chǎn)量損失高達(dá)61%，抗病品種產(chǎn)量損失達(dá)34%，選用抗病品種是防控病害主要途徑[28]。中國(guó)重慶地區(qū)對(duì)赤斑病抗性較好的蠶豆品種有‘通蠶鮮8號(hào)’‘啟豆2號(hào)’、高感品種有‘成胡10號(hào)’‘成胡14號(hào)’[29]。甘肅現(xiàn)有蠶豆品種對(duì)赤斑病抗病性究竟如何，能否加以利用，尚需進(jìn)一步研究。