尖孢鐮刀菌HG-11響應(yīng)解淀粉芽胞桿菌B501脅迫的機(jī)制分析

馬 佳,胡 棟, 田 碩,2, 彭杰麗, 張翠綿, 賈 楠, 王占武

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所(河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心)，石家莊 050051;2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024)

在生物防治領(lǐng)域，研究重點(diǎn)多集中在生防菌對(duì)病原菌的抑菌機(jī)制，生防機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、拮抗、抗生和誘導(dǎo)抗性等方面[1]。但病原菌如何抵御有益生防菌的脅迫，如何影響生防效率的機(jī)理卻常被忽略。如同有益菌有多種機(jī)制拮抗病原菌，病原菌同樣具有多種反拮抗機(jī)制，應(yīng)答生防菌的脅迫壓力。Chen等[2]建立了以“生防細(xì)菌-赤霉病菌”為模式的“細(xì)菌-真菌”跨界互作研究系統(tǒng)，首次發(fā)現(xiàn)生防細(xì)菌綠針假單胞菌(Pseudomonapiscium)ZJU60通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)吩嗪-1-甲酰胺抑制禾谷鐮刀菌的組蛋白乙?；M(jìn)而抑制赤霉病的發(fā)生。病原菌對(duì)化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性已眾所周知，同樣病原菌是否也對(duì)拮抗菌的脅迫產(chǎn)生抗性，其抗性機(jī)制如何，需要深入探索。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)屬芽胞桿菌屬，是生防菌研發(fā)的熱點(diǎn)[3]，具有抗菌譜廣、抗逆性強(qiáng)及生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)。解淀粉芽胞桿菌主要通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育，其次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)較多，具有抗菌特性的物質(zhì)主要包括：脂肽類(lèi)抗生素和抗菌蛋白[4]。脂肽類(lèi)抗生素(Lipopeptide antibiotic)根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為伊枯草菌素(Iturin)家族、表面活性素(Surfactin)和泛革素(Fengycin A、B)[5]。其中表面活性素與細(xì)菌生物膜的形成有關(guān)，芽胞桿菌能夠在植物根系以生物膜形式定殖，并分泌具有殺菌作用的表面活性素[6]?？咕鞍装ǎ嚎咕?、細(xì)胞壁降解酶等。芽胞桿菌菌體產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶是一類(lèi)重要的抗菌蛋白，主要包括幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等以及其他豐富的代謝產(chǎn)物[7]，可抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。

由致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的植物枯萎病在全世界十大植物真菌病害中排在第5位[8]。植物枯萎病是一種土傳真菌病害，嚴(yán)重感病植株整株枯黃萎蔫，最終枯死，在作物的全生育期內(nèi)均可發(fā)生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[9]。由河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所農(nóng)業(yè)微生物研究室分離得到的一株解淀粉芽胞桿菌B501，經(jīng)測(cè)定對(duì)尖孢鐮刀菌HG-11具有較高的抑制效果。在其發(fā)酵液處理下，HG-11菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌絲腫大變粗，這種形態(tài)改變可能是B501產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì) HG-11作用的結(jié)果，而HG-11如何響應(yīng)或應(yīng)答B(yǎng)501抑菌物質(zhì)的毒害并不清楚。

本研究首先檢測(cè)B501的生物膜、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等生防相關(guān)因子，初步了解B501對(duì)HG-11的生防機(jī)理；然后以B501和HG-11作為生防微生物和植物病原微生物互作系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較分析HG-11野生型菌株和經(jīng)B501發(fā)酵液處理后菌株的基因表達(dá)特征，并結(jié)合B501所具有的生防因子以及可能的抑菌方式進(jìn)行分析，從而在轉(zhuǎn)錄組水平上揭示HG-11對(duì)B501脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌B501菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室保存，尖孢鐮刀菌 HG-11由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 MSgg(Minimal salts glycerol glautamate)培養(yǎng)基用于B501生物膜的培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落型生物膜，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)薄皮型生物膜[10]；淀粉培養(yǎng)基用于檢測(cè)B501能否產(chǎn)生淀粉酶；1%脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基用于檢測(cè)B501能否產(chǎn)生蛋白酶；纖維素酶篩選培養(yǎng)基用于檢測(cè)B501能否產(chǎn)生纖維素酶[11]。

HG-11固體培養(yǎng)采用PDA(Potato dextrose agar)培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)采用PDB(Potato dextrose broth)培養(yǎng)液[12]；B501液體培養(yǎng)采用LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基[13]，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng) 24 h，8 000 r/min離心5 min，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾所得即為發(fā)酵液。

1.2 B501對(duì)尖孢鐮刀菌HG-11菌絲生長(zhǎng)的抑制

在 PDA平板中間接種直徑 5 mm 的HG-11菌餅，距離菌餅中心2.5 cm 處對(duì)稱(chēng)放置4 張直徑6 mm 的小濾紙片，每張紙片上滴加10 μL B501菌液，對(duì)照滴加10 μL無(wú)菌水，30 ℃培養(yǎng)，5 d后觀察分析菌落形態(tài)，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.3 B501生防相關(guān)因子的測(cè)定

1.3.1 生物膜的檢測(cè) 將活化24 h的B501單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基里，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將過(guò)夜搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液按 1∶1 000比例加入到含有MSgg培養(yǎng)基的12孔組織培養(yǎng)板中，在23 ℃下培養(yǎng)，3 d后觀察B501生物膜的形成情況。薄皮型生物膜和菌落型生物膜檢測(cè)各3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的檢測(cè) 參考李洪濤[11]的方法。

1.4 B501發(fā)酵液對(duì)HG-11菌絲形態(tài)及基因表達(dá)的影響

將1 mL 濃度為 1×107個(gè)/mL HG-11分生孢子接入100 mL PDB中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，3 d后加入5 mL B501發(fā)酵液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，菌絲置于400倍放大的光學(xué)顯微鏡下(ZEISS Primo Star, 德國(guó))觀察，當(dāng)菌絲腫大變粗變形后收集菌絲，用液氮速凍后放置-80 ℃超低溫冰箱中保存。B501發(fā)酵液處理的樣品標(biāo)記為B501，對(duì)照處理只加入LB培養(yǎng)液，樣品標(biāo)記為CK，兩組處理分別收集3份菌絲樣品。

1.5 HG-11菌絲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用Trizol試劑(Invitrogen, 美國(guó))從處理樣品中提取total RNA，利用Nanodrop 2000對(duì)所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。從總RNA中分離出mRNA，通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，mRNA經(jīng)離子打斷的方式被打斷為長(zhǎng)度300 bp左右的片段。以RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈，再以cDNA為模板進(jìn)行第2鏈cDNA的合成。建庫(kù)試劑盒采用VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(諾唯贊NR611，中國(guó))。通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)大小450 bp，再對(duì)文庫(kù)總濃度及文庫(kù)有效濃度進(jìn)行檢測(cè)。樣品經(jīng)過(guò)RNA抽提、純化、建庫(kù)之后，采用第2代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)(Illumina nova seq 6000)，對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端(Paired-end，PE)測(cè)序[14]。

1.6 差異基因表達(dá)分析

以FPKM(Fragments per kilobase million)表示基因的表達(dá)量。使用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)定量軟件RSEM，以轉(zhuǎn)錄本序列為參考，通過(guò)測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM值。B501處理組樣品和CK樣品間的差異表達(dá)基因(DEGs)通過(guò)DESeq進(jìn)行分析，DEGs的篩選條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|lbFoldChange|> 1，顯著性P值<0.05。

1.7 GO分類(lèi)注釋和KEGG注釋富集分析

使用topGO進(jìn)行Gene Ontology(GO)富集分析，應(yīng)用超幾何分布方法計(jì)算P值，顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P值<0.05，確定差異表達(dá)基因顯著性富集的GO功能分類(lèi)。根據(jù)差異表達(dá)基因的Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)富集分析結(jié)果，篩選P值最小，即富集最顯著的途徑進(jìn)行分析[15]，找出差異顯著性富集的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 B501對(duì)HG-11菌絲生長(zhǎng)的抑制

通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)的方法，發(fā)現(xiàn)B501對(duì)HG-11產(chǎn)生的抑菌圈清晰，明顯抑制HG-11菌落擴(kuò)展(圖1)。通過(guò)400倍的顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng) B501發(fā)酵液處理12 h后的HG-11菌絲膨大，變粗，扭曲，不能進(jìn)一步延伸生長(zhǎng)，對(duì)菌絲的形態(tài)有很大的破壞作用。而在對(duì)照PDB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4 d的HG-11菌絲形態(tài)正常(圖2)，這表明B501產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)造成HG-11菌絲形態(tài)的改變。

2.2 B501生防因子的檢測(cè)

空氣-液體交界面薄皮型生物膜培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室常用的體外模擬生物膜形成的方法之一，該法主要用以芽胞桿菌(Bacillusspp.)生物膜的研究；生物膜菌落培養(yǎng)法在固體平板表面形成的菌落形態(tài)和立體結(jié)構(gòu)，也被認(rèn)為與細(xì)菌的生物膜形成能力密切相關(guān)，這兩種方法常用于實(shí)驗(yàn)室模擬天然生物膜簡(jiǎn)單模型的建立[16]。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B501在MSgg固體培養(yǎng)基上形成粗糙細(xì)致的菌落形態(tài)，也能在MSgg培養(yǎng)液的空氣-液體交界面形成致密、厚實(shí)的脈絡(luò)式薄皮狀生物膜。培養(yǎng)基表面形成復(fù)雜的菌落結(jié)構(gòu)作為評(píng)價(jià)菌株生物膜形成能力的標(biāo)準(zhǔn)之一，前期有研究表明芽孢桿菌生物膜形成能力與防病效果呈正相關(guān)，因此B501具備一定的生防能力。在纖維素酶和淀粉酶檢測(cè)中，菌落周?chē)汲霈F(xiàn)清晰的透明圈且透明圈直徑較大，說(shuō)明B501能產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶，對(duì)纖維素和淀粉的分解能力較強(qiáng)；而蛋白酶的透明圈不明顯，則說(shuō)明B501對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力較弱或可能不產(chǎn)生蛋白酶(圖3)。

2.3 HG-11受B501脅迫的基因表達(dá)特征

為了揭示HG-11受到 B501脅迫后基因表達(dá)特征的變化，收集B501發(fā)酵液處理48 h 的HG-11菌絲樣品(B501)和相同培養(yǎng)條件的未處理的HG-11菌絲對(duì)照樣品(CK)，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建文庫(kù)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。經(jīng)RSEM軟件計(jì)算基因的表達(dá)水平后，各樣品中基因表達(dá)量如圖4。通過(guò)比較兩組處理HG-11菌絲樣品的轉(zhuǎn)錄組FPKM密度分布圖發(fā)現(xiàn)，B501處理組樣品和CK樣品的基因總體表達(dá)量在離散度和總體分布度上存在一定差異(圖4)，表明HG-11在拮抗菌的脅迫處理下，部分基因的表達(dá)發(fā)生改變。

CK樣品共檢測(cè)到13 423個(gè)基因表達(dá)，而 B501處理組樣品共計(jì)13 118個(gè)基因表達(dá)，其中兩個(gè)樣品間共同表達(dá)的基因?yàn)?1 461個(gè)。CK樣品特異表達(dá)的基因?yàn)? 961個(gè)，B501處理組樣品特異表達(dá)的基因?yàn)? 656個(gè)。使用DESeq2對(duì)樣品間差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測(cè)，按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)基因顯著性差異表達(dá)上、下調(diào)情況。相比CK樣品，B501處理組樣品中3 171個(gè)基因差異表達(dá)顯著，其中2 106個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 065個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖5)，顯著上調(diào)差異表達(dá)基因多于顯著下調(diào)差異表達(dá)基因。

將差異基因按照其功能進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)?xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學(xué)過(guò)程(biological process)3 個(gè)基本分類(lèi)。在此基礎(chǔ)上將每一類(lèi)進(jìn)行細(xì)分，又可以分為30個(gè)小類(lèi)，其中在細(xì)胞組分類(lèi)別中涉及基因最多的為細(xì)胞膜組分，分子功能類(lèi)別中涉及基因最多的為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性和核糖體的結(jié)構(gòu)組成，生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別中涉及基因最多的為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體翻譯。在上調(diào)表達(dá)基因中，參與膜構(gòu)成、P-P-鍵-水解驅(qū)動(dòng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、甾醇3-β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶、核糖體蛋白復(fù)合物、異檸檬酸脫氫酶、蛋白質(zhì)代謝等的基因表達(dá)較顯著。解淀粉芽孢桿菌能產(chǎn)生重要的酶系，包括降解多糖的酶類(lèi)，如α-淀粉酶、纖維素酶、β-1，3-1，4-葡聚糖酶、木質(zhì)纖維素降解酶、褐藻膠裂解酶和殼聚糖酶；也包括分解蛋白的酶類(lèi)，如蛋白酶、溶栓酶和凝乳酶[7]。這意味著HG-11可能通過(guò)增加細(xì)胞膜合成途徑相關(guān)酶類(lèi)基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)B501脅迫。下調(diào)表達(dá)基因主要參與酰基轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶、硫胺素代謝、催化酶、萜類(lèi)生物合成等過(guò)程(圖6)。

2.4 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因比較分析

2.4.1 HG-11細(xì)胞壁合成相關(guān)基因 芽胞桿菌產(chǎn)生纖維素酶，能夠作用于真菌細(xì)胞壁，抑制細(xì)胞壁合成，降解細(xì)胞壁纖維素成分，造成細(xì)胞壁強(qiáng)度減弱，細(xì)胞在內(nèi)含物滲透壓作用下扭曲變形[17]。本研究中B501處理組樣品的菌絲腫大變粗，表明HG-11菌絲細(xì)胞壁受到破壞，可能與B501產(chǎn)生的纖維素酶有關(guān)。B501處理組樣品中的上調(diào)表達(dá)基因TRINITY_DN67_c0_g1(P=3.15×10-4)，注釋為脂糖基化，甾醇3-β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，UDP糖基轉(zhuǎn)移酶，與葡聚糖合成相關(guān)(表1)。該基因參與有機(jī)羥基化合物代謝過(guò)程，真菌細(xì)胞壁半纖維素木聚糖的生物合成[18]，因此推測(cè)該基因可能參與菌絲細(xì)胞壁的合成。上述結(jié)果表明，HG-11可能通過(guò)上調(diào)葡聚糖合成途徑的基因，提高葡聚糖或細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，應(yīng)對(duì)B501纖維素酶的脅迫。

2.4.2 HG-11細(xì)胞膜合成和穩(wěn)定性相關(guān)基因 已知解淀粉芽胞桿菌的抗菌物質(zhì)一般作用于真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，通過(guò)破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)抑制真菌生長(zhǎng)[19]，因此，HG-11細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)基因也是差異基因分析的重點(diǎn)。在B501處理組樣品中，TRINITY_DN17937_c0_g1基因上調(diào)表達(dá)(P=3.88×10-4)，該基因參與細(xì)胞內(nèi)固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上調(diào)表達(dá)(P=2.03×10-9)，麥角固醇是真菌細(xì)胞膜重要組成成分，說(shuō)明可能是HG-11通過(guò)促進(jìn)麥角固醇生物合成以及調(diào)整細(xì)胞膜的流動(dòng)性，來(lái)抵抗芽胞桿菌環(huán)脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的傷害作用。TRINITY_DN19134_c1_g2基因表達(dá)上調(diào)(P=1.28×10-3)，該基因注釋為膜靶向共翻譯蛋白，參與HG-11細(xì)胞膜的合成(表1)，說(shuō)明HG-11通過(guò)促進(jìn)與細(xì)胞膜相關(guān)的蛋白表達(dá)，來(lái)抵抗芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的傷害作用。

脂肪酸是細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分，影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。B501處理組樣品中直接參與脂肪酸合成的2個(gè)相關(guān)基因TRINITY_DN13494_c0_g1(P=0.036)和TRINITY_DN18207_c0_g4(P=0.036)，前者注釋為脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase)，后者注釋為脂酰輔酶A，參與脂肪酸的活化。脂肪酸生物合成過(guò)程的4個(gè)相關(guān)基因TRINITY_DN10179_c0_g1(P=0.011)、TRINITY_DN13494_c0_g1(P= 0.036)、TRINITY_DN18061_c0_g3(P=0.048)和TRINITY_DN9445_c0_g1(P=0.002)表達(dá)量顯著升高。TRINITY_DN18061_c0_g3編碼脂肪酸合成酶β亞基，TRINITY_DN13494_c0_g1基因編碼?；o酶A氧化酶，是脂肪酸β-氧化中的關(guān)鍵酶。TRINITY_DN10179_c0_g1和TRINITY_DN 9445_c0_g1參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成和代謝過(guò)程(表1)。這6個(gè)基因在發(fā)酵液處理的HG-11上調(diào)表達(dá)可能也是協(xié)同緩解芽胞桿菌環(huán)脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的傷害。此外，KEGG 注釋的差異表達(dá)基因中參與的脂質(zhì)代謝途徑較為顯著(rich_factor 為0.33；Q 值為0.006)(圖7)。這反映出脂肪酸可能在HG-11抵抗芽胞桿菌環(huán)脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)傷害中起著重要作用。

2.4.3 HG-11細(xì)胞器合成和穩(wěn)定性相關(guān)基因 核糖體和線粒體是細(xì)胞中兩個(gè)重要的細(xì)胞器，核糖體的主要功能是將遺傳密碼轉(zhuǎn)換成氨基酸序列并從氨基酸單體構(gòu)建蛋白質(zhì)聚合物[20]。線粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生ATP，供給細(xì)胞能量。KEGG 注釋的差異表達(dá)基因中參與的核糖體功能途徑最為顯著(rich_factor 為0.28；Q 值為0.0007)(圖7)。B501處理組樣品上調(diào)表達(dá)基因TRINITY_DN19037_c0_g2(P=1.20×10-12)編碼酰胺生物合成，對(duì)細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物的合成有重要作用。該基因上調(diào)說(shuō)明HG-11通過(guò)促進(jìn)與核糖體相關(guān)的蛋白表達(dá)，來(lái)抵抗芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的傷害作用。B501處理組樣品上調(diào)表達(dá)基因TRINITY_DN11875_c0_g1(P=0.017)注釋為線粒體基因，參與線粒體的合成，TRINITY_DN18930_c1_g1(P=1.48×10-7)基因編碼異檸檬酸脫氫酶，在三羧酸循環(huán)中將異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，對(duì)細(xì)胞的能量代謝、生物合成以及抗氧化脅迫起重要作用。TRINITY_DN16521_c0_g1(P=0.015)基因編碼細(xì)胞色素C氧化酶，細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈的終端酶，在機(jī)體內(nèi)氧化代謝和ATP合成中起重要作用。TRINITY_DN18728_c0_g5(P=1.30×10-2)基因編碼鈣離子結(jié)合蛋白，參與線粒體儲(chǔ)存鈣離子途徑，從而控制細(xì)胞中的鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡。另外，B501處理組樣品中顯著上調(diào)表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器相關(guān)基因包括TRINITY_DN18474_c0_g2(P=2.13×10-5)和TRINITY_DN18721_c1_g12(P=0.024)，TRINITY_DN18474_c0_g2編碼P-P-鍵-水解驅(qū)動(dòng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，TRINITY_DN18721_c1_g12基因編碼離子結(jié)合蛋白。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白具有外排泵功能，能與線粒體協(xié)作，將ATP水解產(chǎn)生的能量與結(jié)合的底物轉(zhuǎn)出質(zhì)膜[21]，這5個(gè)與線粒體和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因上調(diào)說(shuō)明HG-11通過(guò)提高能量代謝，促進(jìn)生物合成，來(lái)抵抗B501抗菌物質(zhì)的傷害(表1)。

2.4.4 HG-11抗氧化脅迫類(lèi)基因 解淀粉芽胞桿菌能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)對(duì)真菌細(xì)胞產(chǎn)生氧化性傷害，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[22]，而抗氧化作用的酶類(lèi)則是關(guān)注的重點(diǎn)。KEGG 注釋的差異表達(dá)基因中參與的抗壞血酸和醛酸代謝途徑較為顯著(rich_factor 為0.41；Q 值為0.006)(圖7)?？寡趸割?lèi)相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因有3個(gè)，其中TRINITY_DN11958_c0_g1(P=8.39×10-3)基因編碼過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)基因編碼谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，TRINITY_DN19192_c2_g2(P=1.07×10-6)基因編碼抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。這3個(gè)基因可能參與HG-11抗氧化作用，它們的上調(diào)表達(dá)是HG-11消除自由氧脅迫作用的方式。此外，谷胱甘肽(glutathione, GSH)結(jié)合反應(yīng)在維持細(xì)胞氧化-平衡狀態(tài)、外源物質(zhì)解毒及抗氧化損傷中起著舉足輕重的作用[23]。B501處理組樣品中TRINITY_DN11990_c0_g2(P=2.26×10-6)編碼S-(羥甲基)谷胱甘肽合酶，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)，兩基因顯著上調(diào)表達(dá)(表1)。這些與GSH相關(guān)的酶類(lèi)具有抗氧化和解毒作用，HG-11通過(guò)上調(diào)表達(dá)這些基因，消除活性氧和解毒，減輕B501的抗菌物質(zhì)對(duì)HG-11菌絲細(xì)胞產(chǎn)生氧脅迫傷害。另外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白主要參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，其外排泵功能能夠?qū)⒂卸疚镔|(zhì)排出細(xì)胞外，進(jìn)一步減輕B501的抗菌物質(zhì)對(duì)HG-11菌絲細(xì)胞產(chǎn)生氧脅迫傷害。

2.4.5 HG-11細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 已報(bào)道的解淀粉芽胞桿菌的表面活性素具有殺菌的作用，表面活性素與細(xì)菌生物膜的形成有關(guān)[24]，B501能夠產(chǎn)生生物膜，一般認(rèn)為芽孢桿菌在MSgg中可以分泌更多能誘導(dǎo)生物膜形成的表面活性素，表面活性素具有強(qiáng)烈的抑制細(xì)菌和真菌的效果，不過(guò)產(chǎn)生更多表面活性素的具體機(jī)理還不清楚[25]。生物膜細(xì)菌對(duì)抗生素有很強(qiáng)抗性，具有較強(qiáng)的殺菌能力。HG-11轉(zhuǎn)錄組中12個(gè)基因與細(xì)胞凋亡有關(guān)，主要編碼細(xì)胞凋亡氧化修飾蛋白、細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激蛋白、活性氧因子誘導(dǎo)凋亡等。除TRINITY_DN22470_c0_g1外，其他基因都與細(xì)胞凋亡相關(guān)，在B501處理組樣品中均上調(diào)表達(dá)。KEGG通路中與細(xì)胞復(fù)制有關(guān)的代謝途徑中的4個(gè)差異表達(dá)基因全部為下調(diào)基因(圖7)，其中下調(diào)基因TRINITY_DN22470_c0_g1(P=0.008)編碼DNA連接酶，具有連接和修復(fù)DNA的作用，基因下調(diào)表達(dá)說(shuō)明細(xì)胞修復(fù)功能下降。B501處理組樣品中TRINITY_DN17049_c0_g2(P=3.19×10-7)基因上調(diào)，編碼鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。但該基因的上調(diào)表達(dá)并未改變HG-11細(xì)胞凋亡被抑制的狀況(表1)。

表1 尖孢鐮刀菌HG-11差異表達(dá)基因的GO注釋及FPKM值

2.4.6 HG-11對(duì)B501脅迫的響應(yīng)模式 B501對(duì)HG-11脅迫影響包括抑制細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞膜滲透性增加，入侵細(xì)胞破壞核糖體和線粒體這兩個(gè)重要的細(xì)胞器，并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧造成細(xì)胞氧化傷害，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了應(yīng)對(duì)B501抑菌物質(zhì)的逆境脅迫，HG-11也運(yùn)用多種響應(yīng)手段。本研究綜合HG-11各類(lèi)型基因表達(dá)狀況，可以看出，HG-11上調(diào)葡聚糖合成途徑的基因，提高葡聚糖或細(xì)胞壁的穩(wěn)定性；上調(diào)麥角固醇合成途徑酶，膜靶向共翻譯蛋白，應(yīng)對(duì)B501纖維素酶及其他抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞壁的脅迫。HG-11上調(diào)表達(dá)脂肪酸合成酶以應(yīng)對(duì)芽胞桿菌抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的破壞，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少有害物質(zhì)的入侵。B501抑菌物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)核糖體和線粒體進(jìn)行破壞，HG-11上調(diào)酰胺合成基因、異檸檬酸脫氫酶以及細(xì)胞色素C氧化酶對(duì)核糖體和線粒體進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)抑菌物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，對(duì)細(xì)胞造成傷害，因此HG-11大量表達(dá)抗氧化酶類(lèi)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶來(lái)消除活性氧，減輕傷害。HG-11細(xì)胞凋亡基因的上調(diào)表達(dá)，DNA連接酶等修復(fù)基因下調(diào)表達(dá)則表明芽胞桿菌抑菌物質(zhì)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，HG-11通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)以響應(yīng)B501抑菌物質(zhì)的脅迫作用。

3 討 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析尖孢鐮刀菌HG-11受到解淀粉芽胞桿菌B501脅迫后基因表達(dá)特征的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HG-11通過(guò)改變B501的抑菌物質(zhì)作用位點(diǎn)基因的表達(dá)來(lái)緩解或減輕脅迫傷害。

細(xì)胞壁是生物體防御逆境脅迫的第一道屏障。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，引起植物枯萎病的尖孢鐮刀菌的細(xì)胞壁中總糖蛋白的含量占整個(gè)細(xì)胞壁重量的50%～60%，并位于細(xì)胞壁的最外層，內(nèi)層由幾丁質(zhì)和葡聚糖組成[26]。因此，病原真菌細(xì)胞壁的降解需要多種酶的共同作用。芽胞桿菌抗菌物質(zhì)包括水解酶類(lèi)如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，脂肽類(lèi)如環(huán)脂肽和其他脂肽類(lèi)，其抗真菌作用機(jī)理包括抑制細(xì)胞壁合成、抑制細(xì)胞膜合成[27]、對(duì)細(xì)胞膜氧化傷害[28]、破壞核糖體和線粒體等細(xì)胞器、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。B501能產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶。芽胞桿菌的纖維素酶抑制纖維素的形成，阻斷細(xì)胞壁合成，造成細(xì)胞壁破裂[29]。芽孢桿菌的淀粉酶能減少病原菌胞外多糖的分泌，降低病原菌的抗氧化活性[30]。而尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁的糖蛋白和核糖體蛋白的抑制可能是由于B501產(chǎn)生蛋白酶的影響。TRINITY_DN67_c0_g1基因上調(diào)，該基因參與真菌細(xì)胞壁半纖維素木聚糖的生物合成，在緩解細(xì)胞壁傷害中能夠起一定作用。然而，該基因的上調(diào)表達(dá)并未改變細(xì)胞壁合成被抑制的狀況，導(dǎo)致菌絲高度畸形膨大，該現(xiàn)象類(lèi)似于解淀粉芽胞桿菌MH71抗菌物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的抑制，造成局部膨大或溢縮等[31]。細(xì)胞內(nèi)固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的TRINITY_DN17937_c0_g1基因和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上調(diào)表達(dá)，可能是HG-11通過(guò)促進(jìn)麥角固醇生物合成以及調(diào)整細(xì)胞膜的流動(dòng)性。脂肪酸是形成質(zhì)膜的重要組成部分，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性。TRINITY_DN18061_c0_g3等5個(gè)基因通過(guò)參與脂肪酸合成以及脂質(zhì)的合成和代謝過(guò)程來(lái)維持細(xì)胞膜的滲透性和流動(dòng)性。但本研究并未發(fā)現(xiàn)HG-11菌絲內(nèi)含物泄漏，可能由于B501發(fā)酵液濃度低，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)少，并未對(duì)HG-11細(xì)胞膜造成孔洞。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)參與核糖體合成途徑的基因差異表達(dá)最顯著，B501處理組樣品中共有58個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。Iglesias等[32]研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌的抗性基因多位于編碼核糖體蛋白的基因上，核糖體能供給細(xì)胞蛋白質(zhì)復(fù)合物，可能是HG-11努力維持核糖體的合成，改善蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，以緩解芽胞桿菌抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，HG-11通過(guò)上調(diào)線粒體基因促進(jìn)線粒體合成，并上調(diào)與三羧酸循環(huán)相關(guān)的基因促進(jìn)線粒體產(chǎn)生ATP供給細(xì)胞能量。線粒體與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)作，將ATP水解產(chǎn)生的能量與結(jié)合的底物轉(zhuǎn)出質(zhì)膜，以緩解芽胞桿菌脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的毒害作用，這與Fravel等[33]的研究結(jié)果相似，尖孢鐮刀菌體內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與致病性有關(guān)，可能在克服生防菌防御反應(yīng)方面發(fā)揮作用。

B501對(duì)HG-11的脅迫效應(yīng)可能造成活性氧自由基積累，從而對(duì)HG-11細(xì)胞造成傷害。通常，細(xì)胞通過(guò)抗氧化系統(tǒng)的活化包括過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶活性的提高，以及非酶抗氧化系統(tǒng)中抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)、還原型谷胱甘肽等物質(zhì)含量的增加來(lái)清除氧自由基。B501處理組樣品中抗氧化相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，如POD基因、GSTs基因、APX基因和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器基因等。POD是生物抗氧化防御系統(tǒng)中重要的酶，可以將細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基還原為H2O2和氧，減緩和抵御細(xì)胞的傷害[34]。GSTs是一大類(lèi)解毒酶，具有過(guò)氧化物酶的活性，在真核生物抗藥性和解毒方面起著重要作用[35]。APX是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，是清除H2O2的主要酶類(lèi)[36]。真菌的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白具有膜外排泵功能，能夠?qū)⒂卸疚镔|(zhì)排到細(xì)胞外，在機(jī)體組織防御中起重要作用[37]。因此HG-11中抗氧化脅迫的酶類(lèi)基因上調(diào)表達(dá)也會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，維持細(xì)胞正常的生理活性，從而減少細(xì)胞凋亡。

雖然HG-11調(diào)節(jié)多個(gè)途徑的多個(gè)基因表達(dá)來(lái)響應(yīng)B501發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的脅迫，但并未改變HG-11細(xì)胞凋亡被抑制的狀況。細(xì)胞凋亡氧化修飾蛋白、細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激蛋白、活性氧因子等與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，再加上DNA連接酶等修復(fù)基因下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致菌絲高度畸形膨大，最終凋亡。近年來(lái)，生防微生物隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展日益受到重視，但其防效的不穩(wěn)定性除去生存環(huán)境因素，可能與病原菌的抵抗性也有一定的關(guān)系[38]。后期應(yīng)密切關(guān)注植物病原真菌對(duì)生防微生物的抗性發(fā)展，提高對(duì)生防菌與病原菌互作機(jī)制的認(rèn)識(shí)，找到生防菌防治病原菌的靶標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效防治。