豬源大腸埃希菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥(PMQR)基因的多樣性研究

郭晶晶，侯思夢，劉連杰，邱 芳，劉曉強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

大腸埃希菌是人和動(dòng)物的腸道共生菌，也是一種條件致病菌，能引起溫血?jiǎng)游锏母篂a，主要表現(xiàn)腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。豬大腸埃希病是養(yǎng)豬場最常見的細(xì)菌病之一，發(fā)病率和死亡率都較高，豬場一旦有發(fā)生就很難根除，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。使用抗菌藥物一直是養(yǎng)殖場控制細(xì)菌性疾病的重要手段，但是致病菌和內(nèi)源性微生物的耐藥性選擇壓力在過度使用或?yàn)E用抗菌藥物的背景下不斷增大，造成耐藥菌株在世界范圍內(nèi)廣泛流行，且多重耐藥菌甚至超級耐藥菌時(shí)有報(bào)道，部分多重耐藥株可耐 12 種抗生素[2]。耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散不僅在很大程度上造成動(dòng)物疫病防控難度加大，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，也給食品安全和公共衛(wèi)生安全帶來潛在威脅[3]。

氟喹諾酮類藥物是一類廣譜、高效的化學(xué)合成類抗菌藥物，在人醫(yī)臨床和動(dòng)物臨床實(shí)踐中均發(fā)揮著重要作用[4-5]。然而，隨著此類藥物的廣泛使用，不規(guī)范用藥甚至濫用頻現(xiàn)，導(dǎo)致人類、動(dòng)物及環(huán)境細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)。近些年的研究[6-8]顯示，大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥情況越來越嚴(yán)重。其耐藥機(jī)制主要包括喹諾酮類耐藥決定區(qū)(Quinolone resistance determining region, QRDR)靶基因突變、質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥(Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)基因、膜通透性下降以及藥物主動(dòng)外排[9]。其中，PMQR基因可以介導(dǎo)耐藥性的水平傳播，并造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題而受到越來越多的社會關(guān)注。耐藥基因位于質(zhì)粒上使得耐藥基因在不同細(xì)菌間可以水平傳播，提高了耐藥基因的轉(zhuǎn)移率，使耐藥性菌株更易產(chǎn)生，而且這些基因可通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)多重耐藥，這對臨床感染的控制提出了更高的要求，極大地增加了治療難度[10]。研究顯示，PMQR基因在醫(yī)院、動(dòng)物甚至食品源均有檢出，且在動(dòng)物源有極高的檢出率[11]。目前，對于陜西地區(qū)關(guān)于豬源大腸埃希菌PMQR基因的報(bào)道較少，本研究從陜西關(guān)中部分豬場采集肛拭子，分離鑒定大腸埃希菌。在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用PCR擴(kuò)增檢測耐氟喹諾酮類藥物的菌株中PMQR基因的種類及流行情況，同時(shí)利用PCR擴(kuò)增和測序分析PMQR陽性菌株的QRDR突變情況，為耐藥性監(jiān)測和豬場合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 2017年4月-2018年11月，選取陜西關(guān)中地區(qū)不同的豬場，調(diào)查各豬場發(fā)病情況以及用藥情況。使用無菌棉拭子在生理鹽水中浸濕，插入待采樣仔豬的肛門2～3 cm，用棉拭子在肛門內(nèi)輕輕擦涂，然后將拭子放入盛有生理鹽水的無菌離心管，再將無菌離心管放入0～4 ℃采樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)進(jìn)行大腸埃希菌的分離。每個(gè)肛門拭子樣品不能重復(fù)。

1.1.2 藥品與試劑 抗菌藥物阿莫西林、頭孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、土霉素、替米考星購自大連美倫生物科技有限公司；普多沙星購自美國拜耳動(dòng)物保健品有限公司；美羅培南購自陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司。麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；PCR 相關(guān)試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(上海蘇凈凈化有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品)；PCR儀(美國BIO-RAD)；水平電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司)；壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大腸埃希菌的分離、鑒定 參照參考文獻(xiàn)[12]的方法。將樣品稀釋并涂布至麥康凱培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取粉紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)一步分離和純化，最后使用16S rRNA基因序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。鑒定好的大腸埃希菌-80 ℃保存，備用。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照CLSL推薦的微量稀釋法[13]，測定470株受試大腸埃希菌對6類10種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌。依據(jù)CLSL的抗菌藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)判定各菌株的敏感度，以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)進(jìn)行判定，對3類或3類以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株判定為多重耐藥菌。同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析受試菌對受試藥物的耐藥率、MIC50和MIC90。

1.2.3PMQR基因及QRDR突變檢測 選取受試菌中對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株，提取DNA，PCR擴(kuò)增檢測耐氟喹諾酮類的菌株中6種PMQR基因片段(qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、aac(6′)-Ib-cr、qepA)的流行情況。PMG 252、PMG 298、PMG 306和J7261205為陽性對照菌株。對于PMQR基因陽性菌株，PCR擴(kuò)增并測序分析其編碼DNA促旋酶的gyrA基因和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC基因。相關(guān)引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，包括ddH2O 4.5 μL、2×PCR Master 6 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌的分離鑒定結(jié)果

肛拭子采集的樣品經(jīng)分離培養(yǎng)基鑒別、革蘭氏染色鏡檢和16S rRNA測序分析，共獲得470株大腸埃希菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，470株受試菌株對阿莫西林和土霉素的耐藥性最為嚴(yán)重，耐藥率達(dá)100%和 98.51%，其次為恩諾沙星、阿米卡星、環(huán)丙沙星、普多沙星、氟苯尼考、替米考星和頭孢噻呋的耐藥率分別達(dá)89.58%、60.64%、56.80%、57.66%、52.98%、50.85%和44.47%。沒有發(fā)現(xiàn)對美羅培南耐藥的菌株，但值得注意的是，9株大腸埃希菌對美羅培南的敏感性為中介。在470株受試大腸埃希菌中，89.58%為多重耐藥菌株。

表2 470株豬源大腸埃希菌的耐藥性

進(jìn)一步的分析表明，阿莫西林的MIC50達(dá)512 μg/mL，阿米卡星、氟苯尼考、土霉素、替米考星的MIC50達(dá)256 μg/mL。3種氟喹諾酮類藥物和頭孢噻呋的MIC50相對較低，為8～32 μg/mL，美羅培南的MIC50最低，為0.063 μg/mL。

2.3 PMQR的流行性及QRDR突變分析

采用特異性引物，通過PCR擴(kuò)增，對所有耐氟喹諾酮類藥物的菌株的6個(gè)PMQR基因的流行情況和QRDR突變進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表3。對恩諾沙星、環(huán)丙沙星和普多沙星耐藥的421株大腸埃希菌中共有282株攜帶PMQR基因，其中qnrS基因的檢出率最高，為50%，aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和qepA基因的檢出率分別為36.52%、30.14%、17.38%、11.45%和 2.49%。55.30%(156/282)的菌株攜帶有1種PMQR基因，37.90%(107/282)攜帶有2種PMQR基因，6.40%(18/282)攜帶有3種PMQR基因，1(0.35%)株攜帶有4種PMQR基因，且所有攜帶PMQR基因的菌株均為多重耐藥菌株。在282株攜帶PMQR基因的菌株中，279(98.90%)株檢測到QRDR突變，其中以gyrA基因83位氨基酸突變(Ser83Leu)為主，同時(shí)部分菌株出現(xiàn)87位氨基酸突變(Asp87Asn)，132(46.80%)株攜帶PMQR基因的菌株的parC基因發(fā)生1個(gè)位點(diǎn)(Ser80Ile)或2個(gè)位點(diǎn)(Ser80Ile+ Glu84Val)突變，且發(fā)生parC基因突變的菌株均伴有g(shù)yrA基因的單位點(diǎn)或雙位點(diǎn)突變。此外，隨著菌株所攜帶PMQR基因的增多，gyrA和parC基因的突變位點(diǎn)也相應(yīng)增加，如部分?jǐn)y帶3個(gè)PMQR基因的菌株出現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)(Ser83Leu，Asp87Asn，Ser80Ile)或4個(gè)突變位點(diǎn)(Ser83Leu，Asp87Asn，Ser80Ile和Glu84Val)。

表3 豬源大腸埃希菌PMQR基因及QRDR突變檢測結(jié)果

3 討 論

本研究結(jié)果表明，陜西關(guān)中地區(qū)某些豬場分離的大腸埃希菌對臨床常用藥物已經(jīng)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的耐藥性，對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星和普多沙星的耐藥率也超過55%，其中對恩諾沙星的耐藥率最高，接近90%。另外，多重耐藥菌高達(dá)89.58%。多重耐藥菌比例的不斷增大以及多重耐藥菌的廣泛傳播，會極大地威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示，大腸埃希菌對阿莫西林和土霉素均存在嚴(yán)重的耐藥性。而在受試的3種氟喹諾酮類藥物中，恩諾沙星的耐藥性高達(dá)89.50%，可能是恩諾沙星作為一種動(dòng)物專用氟喹諾酮類藥物在臨床使用較為頻繁所導(dǎo)致，而普多沙星是一種近些年才上市的新型動(dòng)物專用氟喹諾酮類藥物，尚未獲批用于食品動(dòng)物，但其耐藥性已接近環(huán)丙沙星，阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星和替米考星的耐藥性則趨于嚴(yán)重，在臨床使用中應(yīng)引起重視。本研究受試菌株對美羅培南仍然保持較高的敏感率，美羅培南作為一種碳青霉烯酶抗生素，并未獲批廣泛用于食品動(dòng)物，然而，有9株受試菌對其敏感性明顯下降，已處于中介，臨床上要引起足夠重視。

大量研究表明，PMQR基因通常位于大小不等的可接合質(zhì)粒上，其耐藥機(jī)制主要包括，qnr基因調(diào)控DNA解旋酶活性機(jī)制，aac(6′)-Ib-cr基因編碼乙酰基轉(zhuǎn)移酶修飾喹諾酮類機(jī)制以及qepA介導(dǎo)蛋白質(zhì)主動(dòng)外排機(jī)制[11]。本研究結(jié)果顯示，對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中，qnrS、aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和qepA基因的檢出率分別為50%、36.52%、30.14%、17.38%、11.35%和2.49%。可以看出，PMQR基因在此次采集的豬場的試驗(yàn)樣本中種類較多，且流行廣泛。PMQR基因存在地域差異，在同一區(qū)域內(nèi)不同養(yǎng)殖場或不同種屬動(dòng)物的流行也有差異。王麗娟等[6]發(fā)現(xiàn)在陜西牛源大腸埃希菌中也以qnrS和aac(6′)-Ib-cr最為流行，但是未檢測到qnrA、qnrD和qepA基因。楊艷麗等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛源大腸埃希菌中主要攜帶qnrA、qnrS和aac(6′)-Ib-cr3種耐藥基因，以qnrA基因(12.07%)檢出率最高。田亞凱[15]發(fā)現(xiàn)犬源大腸埃希菌主要攜帶oqxA、oqxB和qnrS3種耐藥基因，其中qnrS基因(14.70%)最為流行。坤清芳等[16]報(bào)道四川省兔源大腸埃希菌中aac(6′)-Ib-cr檢出率最高，達(dá)80.4%，其他PMQR基因qnrD、qnrS、oqxA和oqxB檢出率也較高，分別達(dá)59.8%、59.8%、63.9%和51.5%。Oliveira等[17]在排放的廢水和重復(fù)使用的廢水中都檢測到高濃度的qnr基因。此外，國內(nèi)外醫(yī)院的人源樣品中，PMQR基因也都有較高的檢出率[18-22]。由此可見，PMQR基因廣泛存在于各種動(dòng)物、人體以及環(huán)境中。然而，PMQR基因的種類及數(shù)量隨著地區(qū)、樣品來源的不同而具有較大差異，這可能與不同地區(qū)抗菌藥物的用藥背景、飼養(yǎng)環(huán)境、以及種屬體質(zhì)的不同有關(guān)。實(shí)際上，大腸埃希菌對喹諾酮類藥物耐藥的最主要機(jī)制是QRDR突變，且突變位點(diǎn)數(shù)量與耐藥水平呈正相關(guān)。本研究中421株對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中，有282株攜帶有PMQR基因，說明還存在其他機(jī)制。同時(shí)98.90%的PMQR陽性菌株發(fā)生QRDR突變，且靶基因gyrA和parC的突變位點(diǎn)數(shù)目與PMQR的數(shù)目以及耐藥水平之間存在關(guān)聯(lián)。雖然PMQR基因的出現(xiàn)并不是細(xì)菌對喹諾酮類藥物耐藥的決定因素，但其可以提高耐藥水平，并通過質(zhì)粒介導(dǎo)而在不同種屬菌株水平傳播，從而加速耐藥性的傳播和蔓延。然而，菌株中QRDR靶基因突變和獲得PMQR基因的先后順序會影響耐藥性的發(fā)展，如果菌株發(fā)生靶基因突變再捕獲PMQR基因，可迅速促進(jìn)耐藥的發(fā)展[23]。

PMQR基因的多樣性、快速的水平傳播能力及其和QRDR之間可能存在協(xié)同作用，增加了臨床使用氟喹諾酮類藥物治療的不確定性。同時(shí)，應(yīng)不斷增強(qiáng)對多重耐藥菌的防控意識，加強(qiáng)PMQR耐藥基因和QRDR突變的檢測，合理選擇抗菌藥物并合理聯(lián)合用藥，對于預(yù)防并控制耐藥基因的傳播具有重要意義。此外，及時(shí)處理舍內(nèi)糞便，提高飼養(yǎng)管理水平，也有助于減緩、防止多重耐藥情況的發(fā)生。