西藏那曲牦牛BRDC細(xì)菌病原核酸檢測與分析

王方國，耿尚景超，顏新敏，陳勝利，郝華芳，曾江勇，姚學(xué)萍，儲岳峰，曹隨忠

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009)

牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory diseases complex，BRDC)是危害世界養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病，也是制約中國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一個重要疾病問題。BRDC是由傳染性病原因子、牛免疫功能失調(diào)以及環(huán)境壓力等導(dǎo)致的，主要表現(xiàn)為支氣管肺炎的一種多因子疾病，其中傳染性病原因子種類較多，包括多種細(xì)菌和病毒，如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida, Pm)、睡眠嗜組織菌(Histophillussomni, Hs)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica, Mh)、化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes, Tp)、牛支原體(Mycoplasmabovis, Mb)等細(xì)菌病原[1]，牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3)等病毒病原[2-3]。這些病原可單獨(dú)或者混合感染，臨床表現(xiàn)多樣，有些還可以隱性感染。在美國，Johnson等[4]通過動物健康監(jiān)測系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，21.3%的牛受到BRDC的影響，在牛死亡的病例中，BRDC為45%～55%。

西藏那曲牦牛(Bosgrunniens)主要生活在海拔4 400 m以上的高寒地區(qū)，牦牛養(yǎng)殖的健康發(fā)展關(guān)乎牧民的直接利益，也關(guān)乎當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)和社會發(fā)展。近年來，呼吸道疾病逐漸成為威脅高原牦牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病[5-6]。李坤等[7]檢測發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)牦牛的牛支原體血清抗體陽性率為 44.32%(12/273)，四川紅原地區(qū)牦牛牛支原體血清陽性率為50.81%(126/248)；而王冬經(jīng)等[8]檢測發(fā)現(xiàn)西藏(林芝、昌都、拉薩、山南、日喀則)2 126份牦牛血清的牛支原體抗體顯示血清總陽性率為46.75%(994/2 126)。陳建春等[9]采用ELISA的方法對西藏、甘肅、青海、四川地區(qū)等896份牦牛血清進(jìn)行多殺性巴氏桿菌抗體檢測，結(jié)果顯示牦牛血清抗體平均陽性率為15.74%(141/896)。格代[10]對甘南牦牛進(jìn)行血液鏡檢，檢測出多殺性巴氏桿菌平均陽性率4.3%(70/1 600)。BRDC病原種類繁多，牦牛群中已報(bào)道細(xì)菌病原包括牛支原體、多殺性巴氏桿菌，關(guān)于整體的BRDC細(xì)菌病原報(bào)道較少，為準(zhǔn)確了解牦牛群中BRDC相關(guān)細(xì)菌病原的流行情況，對牦牛群呼吸道疾病防控具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。因此，本研究運(yùn)用同步檢測多種BRDC病原的qPCR方法，對西藏那曲地區(qū)牦牛牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌和化膿隱秘桿菌進(jìn)行核酸檢測，了解西藏那曲地區(qū)BRDC細(xì)菌病原流行情況，并分析不同季節(jié)、不同性別、不同年齡、不同養(yǎng)殖模式等風(fēng)險(xiǎn)因素對上述5種呼吸道病原感染的流行病學(xué)特點(diǎn)，為科學(xué)防控牦牛BRDC提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018年11月—2019年6月采集西藏那曲地572頭牦牛鼻拭子樣品，鼻拭子樣品采集采用一次性無菌棉簽深入鼻腔 10 cm 深度采集，置于滅菌試管，-20 ℃保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 主要試劑與儀器

2×GoldstarTaqMan Mixture購自康為試劑有限公司；DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit, DP301-02)購自北京天根科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ D6950-01)購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；CFX96熒光定量PCR儀購自BIO-RAD(美國)公司。

1.3 引物、探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已公布的牛支原體引物和探針序列參照Sachse 等[11]研究，多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、化膿隱秘桿菌參照Mai等[12]研究，引物和探針信息見表2，引物和探針均由西安擎科生物有限公司合成。

表2 檢測相關(guān)的引物和探針

1.4 陽性對照

根據(jù)GenBank中已公布的牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、化膿隱秘桿菌全基因序列，根據(jù)引物所處的位置和擴(kuò)增目的條帶長度，使用 Clone Manager 8.0 軟件進(jìn)行分析查找，選取目的基因序列，合成并克隆到質(zhì)粒載體pUC57，克隆位點(diǎn)EcoRV，載體長度 2.7 kb，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成、克隆。具體序列見表3。

表3 擴(kuò)增目的基因序列

1.5 DNA的提取

將采集的牦牛鼻拭子放入2 mL EP管并做好標(biāo)記，加入1 mL pH 7.2 0.1 mol/L PBS緩沖液，在振蕩器上振蕩30 s，室溫放置浸泡1 h，擠壓干凈后丟棄棉拭子，浸泡液12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用DNA提取試劑盒按照說明書提取病原基因組DNA，并用分光光度計(jì)測定其濃度，-20 ℃保存，備用。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒提取

含有牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌和睡眠嗜組織菌靶基因片段質(zhì)粒的工程菌，常規(guī)方法接種培養(yǎng)基搖菌(LB培養(yǎng)基)，離心取沉淀，用質(zhì)粒提取試劑盒，按照說明書提取質(zhì)粒，分光光度計(jì)測定濃度并計(jì)算靶基因拷貝數(shù)，并稀釋為1×101拷貝/μL到1×108拷貝/μL，-20 ℃保存，備用。

1.7 牦牛鼻拭子樣品qPCR檢測

參考Mai等[12]和翟肖輝等[13]建立的方法進(jìn)行，結(jié)果判定試驗(yàn)有效性判定：陽性對照標(biāo)準(zhǔn)曲線生成，陰性對照無熒光擴(kuò)增曲線，陽性判定：樣本拷貝數(shù)≥標(biāo)準(zhǔn)品102拷貝數(shù)，陰性判定：樣本拷貝數(shù)<標(biāo)準(zhǔn)品102拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種病原在不同季節(jié)、性別、年齡以及養(yǎng)殖模式下的牦牛中流行情況

根據(jù)表4顯示，5種病原陽性率最高的為 Mb 18.18%(104/572)，其次是Pm 11.89%(68/572)、Hs 7.17%(41/572)、Mh 6.99%(40/572)，Tp 5.77%(33/572)。不同季節(jié)流行情況為Mb 2019年夏季樣品陽性率顯著高于2018年冬季樣品(P<0.05)，Pm和Tp 2019年夏季樣品陽性率極顯著高于2018年冬季樣品(P<0.01)。Mb和Pm雌性牦牛陽性率高于雄性牦牛，差異不顯著(P>0.05)，Mh、Hs和Tp雄性牦牛陽性率高于雌性牦牛，差異不顯著(P> 0.05)。對不同年齡段牦牛檢測結(jié)果為Mb、Tp陽性率在3～6歲牦牛中最高，差異性不顯著(P>0.05)；Pm、Hs陽性率在7～12歲牦牛中最高，差異性不顯著(P>0.05)；Mh陽性率在3～6歲牦牛中極顯著高于其他兩個年齡段(P< 0.01)。不同養(yǎng)殖模式下流行情況為Mb、Pm、Mh、Tp陽性率在集約化養(yǎng)殖模式下明顯高于放牧和放牧+圈養(yǎng)養(yǎng)殖模式，Mb組間差異顯著(P<0.05)。Pm、Mh和Tp組間差異極顯著(P<0.01)；Hs組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同季節(jié)、性別、年齡以及養(yǎng)殖模式下牦牛呼吸道病原檢測結(jié)果

2.2 多種病原混合陽性流行情況

混合陽性率調(diào)查結(jié)果如表5和圖1所示，在572份樣品中二重感染陽性率最高為6.64%(38/572)，其次三重感染陽性率為2.27%(13/572)，四重感染陽性率為0.70%(4/572)，五重感染陽性為0.18%(1/572)。不同病原混合感染陽性率最高的Mb/Pm為1.57%(9/572)，其次Mb/Pm/Mh陽性率為1.22%(7/572)，Mb/Mh陽性率為0.87%(5/572)，Mb/Hs陽性率為0.87%(5/572)。

表5 種病原混合感染調(diào)查結(jié)果

3 討 論

呼吸道疾病綜合征(BRDC)是由細(xì)菌或者病毒單獨(dú)或者混合感染引起的，而且相關(guān)病原在我國不同地區(qū)均有相關(guān)報(bào)道，國內(nèi)關(guān)于奶牛和肉牛BRDC的相關(guān)報(bào)道比較全面，牦牛群中也有發(fā)生BRDC的報(bào)道，涉及到的細(xì)菌病原包括牛支原體、多殺性巴氏桿菌等。準(zhǔn)確了解西藏那曲牦牛群中BRDC相關(guān)病原的流行情況，對牦牛群呼吸道疾病防控具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。張建華[14]采用間接ELISA、直接培養(yǎng)法和PCR檢測全國30個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場牛支原體感染情況，結(jié)果顯示，血清抗體陽性率為52.31%(441/843)，病料檢測陽性率為55.00%(33/60)，乳樣檢測陽性率為34.22%(373/1090)，表明牛支原體在規(guī)?；膛隽餍袊?yán)重。王冬經(jīng)等[8]用ELISA對來自西藏全區(qū)(林芝、昌都、拉薩、山南、日喀則)的2 126份牦牛血清進(jìn)行牛支原體抗體檢測，結(jié)果檢出陽性血清994份，總陽性率為 46.75%。這些結(jié)果說明牦牛群中已有牛支原體流行，且感染率較高。陳建春等[9]采用ELISA的方法對西藏、甘肅、青海、四川地區(qū)牦牛進(jìn)行多殺性巴氏桿菌抗體檢測，檢測出平均陽性率為 15.74%(141/896)，四地陽性率分別為12.50%、17.13%、12.91%和23.95%。目前，國內(nèi)已有牛源溶血性曼氏桿菌分離鑒定的相關(guān)報(bào)道，其發(fā)病率為9%～40%，致死率為25%～50%[15]。吳翠蘭等[16]用PCR的方法檢測患有呼吸系統(tǒng)疾病的牛肺臟組織(102 份)和鼻拭子(15 份)樣品，結(jié)果顯示溶血性曼氏桿菌的檢出率分別為5.13%(6/117)。牛睡眠嗜組織菌感染率很高，但多不表現(xiàn)臨床癥狀，該菌在犢牛中的檢出率為 15%～50%[17]。國內(nèi)關(guān)于睡眠嗜組織菌的報(bào)道較少。吳翠蘭等[16]通過對肺臟組織和鼻拭子進(jìn)行化膿隱秘桿菌檢測，PCR檢測出有呼吸道癥狀樣品陽性率為20.5%(24/117)，分離培養(yǎng)陽性率為 2.6%、7.7%(9/117)。本次試驗(yàn)檢測出西藏那曲地區(qū)牦牛存在不同程度的呼吸道病原感染，其中牛支原體、多殺性巴氏桿菌陽性率較高，陽性率分別為18.18%(104/572)，11.89%(68/572)。溶血曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、化膿隱秘桿菌陽性率較低，陽性率分別為6.99%(40/572)、7.17%(41/572)、5.77%(33/572)。

研究表明主要引起發(fā)病的呼吸道病原為牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌，2019年與2018年對比，牛支原體、多殺性巴氏桿菌陽性率有所增加，所以針對這3個病原的防控至關(guān)重要。5種病原在不同性別牦牛中差異不顯著。不同年齡中溶血曼氏桿菌3～6歲牦牛顯著高于其他2個年齡段牦牛。

飼養(yǎng)管理水平對牦牛的健康養(yǎng)殖有著重要作用[18]。本次試驗(yàn)集約化養(yǎng)殖場地只有一處，采集樣品來源于其中患有呼吸道癥狀(如流鼻液、眼分泌物過多、臥底不起、精神沉郁)的牦牛，根據(jù)采樣的實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于該采樣點(diǎn)飼養(yǎng)管理不到位，飼養(yǎng)密度過高，雖然患病牦牛集中隔離，但是每天還是有新增發(fā)病牦牛出現(xiàn)，而集約化養(yǎng)殖模式下，牦牛飼養(yǎng)密度大，如果有一頭牦牛染病不進(jìn)行及時處理，會導(dǎo)致疾病傳播更加迅速，牦牛大面積感染。所以導(dǎo)致西藏那曲牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌陽性率在集約化養(yǎng)殖模式下顯著高于放牧以及放牧+圈養(yǎng)的養(yǎng)殖模式。

混合陽性的主要原因是由于飼養(yǎng)密度過大和未及時隔離病牛而造成的繼發(fā)感染，Radaelli等[19]研究表明奶牛呼吸道病原混合感染的常見病原菌主要包括：多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌。張曉宇[20]用病原分離鑒定的方法對來自國內(nèi)6大地區(qū)犢牛鼻拭子進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)牛支原體與多殺性巴氏桿菌混合感染率為0.42%(73/17 280)、牛支原體與溶血曼氏桿菌混合感染率為0.3%(52/17 280)。本次試驗(yàn)表明，牦牛呼吸道病原混合感染主要是牛支原體與其他病原混合引起，其中發(fā)現(xiàn)一例5種病原都存在的感染，說明西藏那曲地區(qū)混合感染主要病原為牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、化膿隱秘桿菌，且牦牛呼吸道病原之間的混合感染可以同時存在5種呼吸道細(xì)菌病原。

針對西藏那曲牦牛呼吸道5種細(xì)菌檢測結(jié)果，建議采取以下措施：(1)本次調(diào)查陽性率最高的是牛支原體，由于目前尚無商品化的牛支原體疫苗，可通過泰樂菌素/替米考星飲水拌料和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理進(jìn)行預(yù)防。而對于多殺性巴氏桿菌建議免疫牛出敗疫苗預(yù)防巴氏桿菌感染。(2)對于發(fā)病牦牛。針對本次集約化養(yǎng)殖的一個場地應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)巡視，及時發(fā)現(xiàn)，及時隔離并制定合理的治療方案進(jìn)行治療，免交叉感染，不同癥狀發(fā)病牛在隔離時應(yīng)注意分開隔離，避免不同疾病的混合感染。(3)加強(qiáng)檢疫。很多牦牛疾病的發(fā)生，都可以通過定期檢疫及時發(fā)現(xiàn)，所以要及時對牦牛疾病進(jìn)行檢疫管理，便于獸醫(yī)人員及時采取相應(yīng)措施對疾病進(jìn)行治療。(4)引種管理。對于引種的外來種公牦牛，進(jìn)行相關(guān)疾病的檢查，檢查結(jié)果為陰性后也需要一定的隔離期。(5)牦牛養(yǎng)殖場所做好環(huán)境衛(wèi)生，對于進(jìn)出飼養(yǎng)場所的人員、車輛做好清潔消毒工作。圈舍、物品進(jìn)行定期消毒，搞好圈舍環(huán)境衛(wèi)生有利于牦牛對于疾病的抵抗。(6)飼養(yǎng)管理。合理養(yǎng)殖密度和牛群結(jié)構(gòu)有利于牦牛的健康發(fā)展。牦牛進(jìn)行放牧飼養(yǎng)，所以冬天合理的補(bǔ)飼可以避免牦牛消瘦。綜上所述，在西藏那曲地區(qū)存在牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌和化膿隱秘桿菌的感染，主要流行牛支原體和多殺性巴氏桿菌，且存在兩種以上病原混合陽性，表明西藏牦牛養(yǎng)殖也面臨BRDC的挑戰(zhàn)，對牦牛疫病防控和健康養(yǎng)殖具有重要的指導(dǎo)意義。受調(diào)查地區(qū)牦牛中流行的細(xì)菌病原陽性率從高到低依次為Mb、Pm、Hs、Mh和Tp，表明Mb已成為西藏地區(qū)牦牛呼吸道的主要細(xì)菌性病原之一，Pm仍是西藏地區(qū)牦牛需要防控的重要病原。