鹽酸可樂定人工抗原及其鼠源多抗的制備

王 耀，曹金博，曹夕丹，李鐵梅，邢云瑞，孟繼秋,，龐杏豪,，孫亞寧,陳秀金，李兆周，胡驍飛

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

鹽酸可樂定(Clonidine hydrochloride，CLO)屬于α2腎上腺受體激動(dòng)劑，化學(xué)名為[2-(2,6-二氯苯基)亞氨基]咪唑啉，其結(jié)構(gòu)式如圖1-A所示，臨床上主要用于治療高血壓、偏頭痛、絕經(jīng)期潮熱、痛經(jīng)等病癥，將其與中樞神經(jīng)抑制藥合用，可產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，與降壓藥合用可加強(qiáng)降壓作用[1-3]。CLO為咪唑啉的衍生物，可刺激垂體分泌生長激素，將其添加在禽畜飼料或者飲水中可在很大程度上促進(jìn)禽畜生長，并改善營養(yǎng)代謝途徑，重新分配脂肪肌肉比例，從而起到提高瘦肉率的作用[4-5]，被視為一種新型的瘦肉精類藥物。有研究表明，CLO具有極大的毒副作用，人食用含CLO殘留的動(dòng)物源性食品后，食品中殘留的CLO將在體內(nèi)大量蓄積，嚴(yán)重危害人身健康，其導(dǎo)致的中毒癥狀主要包括口干、嗜睡、頭痛、惡心、嘔吐、便秘、心悸、精神抑郁等[6-7]。因此，原農(nóng)業(yè)部1519號公告中嚴(yán)令禁止在養(yǎng)殖過程中添加CLO。但出于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，目前仍有一些在家畜養(yǎng)殖中違法使用CLO的現(xiàn)象。因此，建立CLO殘留的簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏和高通量的檢測方法尤為重要，對保障動(dòng)物源性食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前關(guān)于CLO殘留的檢測方法主要包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)[8]、氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)[9]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS)[10]等，此類檢測方法雖然檢測精確度較高，假陽性和假陰性率較低，但需要的儀器較為昂貴，需要專業(yè)培訓(xùn)的操作人員和一定的圖譜分析能力，同時(shí)樣品的前處理過程較為復(fù)雜，不利于運(yùn)輸中易受損樣品和現(xiàn)場高通量樣品的快速篩查[11]。近年來，基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫分析檢測技術(shù)發(fā)展迅速，在農(nóng)獸藥殘留、病原檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)不僅操作簡單、快速，而且具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可克服色譜檢測技術(shù)的部分應(yīng)用局限[12-14]?；诿庖邔游黾夹g(shù)和膠體金示蹤技術(shù)發(fā)展起來的膠體金免疫層析試紙(Colloidal gold immunochromatographic strip，ICS)，可對樣品實(shí)現(xiàn)5～10 min肉眼可見的快速檢測，特別適合基層對樣品的高通量快速篩查[15-17]。CLO分子質(zhì)量較小，無免疫原性，需通過與蛋白載體偶聯(lián)形成半抗原—載體復(fù)合物才能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但CLO分子結(jié)構(gòu)上無可用于偶聯(lián)載體的活潑基團(tuán)，無法與載體蛋白偶聯(lián)。ACLO為CLO的衍生物(圖1-B)，基于結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性原理，可以選擇ACLO為半抗原，利用其分子結(jié)構(gòu)苯環(huán)上活潑的氨基基團(tuán)，采用重氮化法合成CLO人工抗原。本研究以ACLO為半抗原，利用其苯環(huán)4位上的氨基，采用重氮化法將氨基重氮化與蛋白載體偶聯(lián)，合成免疫原性良好的CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后，獲得免疫學(xué)特性較好的CLO鼠源多抗，為制備高親和力CLO單克隆抗體以及建立其免疫學(xué)檢測方法奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑 ACLO(純度≥98%)，購自中國食品藥品鑒定研究所；CLO、苯乙醇胺A(Phenylethanolamine A，PA)、巴氯芬(Baclofen，BA)、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)、弗氏完全佐劑(Freund’s Adjuvant Complete，F(xiàn)CA)、弗氏不完全佐劑(Freund's Adjuvant Incomplete，F(xiàn)IA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、雞卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，均為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，GaMIgG-HRP)為Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析級試劑。

1.1.2 溶液 包被液(pH 9.6的0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液，CBS)；稀釋液(pH 7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)；洗滌液[V(PBS)∶V(Tween20)=2×103∶1，PBST]；封閉液[V(PBST)∶V(脫脂奶粉)=20∶1]；顯色液(TMB)；終止液(2 mol/L的H2SO4溶液)均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.3 儀器 BSA224S型電子天平，德國Sartorius公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀和UV-5100H型紫外—可見分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher Scientific公司；Vortex2型振蕩器和 T8.10高速均質(zhì)乳化機(jī)，艾卡儀器設(shè)備有限公司；SZCL-2型控溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HPX-9052MBE型恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級BALB/c小鼠，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方 法

1.2.1 人工抗原合成 采用重氮化法[18]合成CLO人工抗原，其中免疫原(CLO-BSA)的合成路線圖如圖2所示。稱取3 mg ACLO溶于0.5 mL 0.1 mol/mL的稀鹽酸溶液中，向該溶液中逐滴攪拌滴加0.2 mol/mL的NaNO2溶液至用淀粉碘化鉀試紙檢測變藍(lán)時(shí)為止，并用適量100 mg/mL的氨基磺酸溶液終止反應(yīng)(反應(yīng)全程0～4 ℃避光)。然后稱取2.5 mg BSA溶于1 mL CBS緩沖液中(蛋白液)，將上述反應(yīng)液逐滴攪拌滴加在該蛋白液中，室溫避光攪拌反應(yīng)4 h。最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至潔凈透析袋中，4 ℃條件下用PBS攪拌透析3 d。透析結(jié)束后，離心去除沉淀得免疫原(CLO-BSA)，-20℃保存，備用。包被原(CLO-OVA)制備方法同上。

1.2.2 人工抗原鑒定 紫外掃描鑒定：用PBS緩沖液配置BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和CLO標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其濃度分別與人工抗原濃度一致。然后利用全波長紫外—可見分光光度計(jì)分別對各溶液進(jìn)行掃描，根據(jù)紫外光譜中人工抗原特征吸收峰相比載體蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)品的變化判斷人工抗原偶聯(lián)效果。

SDS-PAGE鑒定：參照文獻(xiàn)[19]配制電泳所需濃縮膠和分離膠，選擇的濃縮膠和分離膠體積分?jǐn)?shù)分別為5%和12%，電泳的電壓分別為60 V和90 V，上樣量為10 μL(含人工抗原5 μg)?？捡R斯亮藍(lán)染液染色3～4 h，脫色液脫色6 h，用凝膠成像儀拍照，根據(jù)蛋白條帶位置差異判斷偶聯(lián)效果。

1.2.3 多抗的制備與鑒定 用合成的免疫原(CLO-BSA)免疫4只SPF級6周的齡雌性BALB/c小鼠，采用背部皮下多點(diǎn)注射方式進(jìn)行免疫。首免為基礎(chǔ)免疫，用滅菌PBS稀釋CLO-BSA后與FCA等體積混合，用乳化器充分乳化后以每只200 μL(含免疫原30 μg)的劑量免疫小鼠，首免21 d后進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，每次間隔21 d，其中免疫佐劑使用FIA代替FCA。在第4 次免疫10 d后斷尾采血，用PBS稀釋100倍，離心去除沉淀后，以包被原(CLO-OVA)包被ELISA板鑒定其免疫學(xué)特性。

多抗效價(jià)測定：采用間接ELISA方法(i-ELISA)[20]測定多抗效價(jià)，具體操作為：首先將包被原CLO-OVA用CBS包被緩沖液稀釋后每孔100 μL包被于96孔ELISA板中，在4 ℃條件下包被過夜，然后用PBST洗滌液洗板并甩干液體，最后每孔加入250 μL封閉液在37 ℃條件下封閉1 h，洗板甩干后于4 ℃保存，備用。檢測時(shí)，取包被好的ELISA板，每孔加入100 μL倍比稀釋的多抗，以小鼠陰性血清為陰性對照，PBS為空白對照，在37 ℃條件下孵育15 min；洗板甩干后加入用封閉液稀釋1 000倍的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃條件下孵育30 min；洗板后每孔加入100 μL顯色液(TMB)，室溫避光顯色10 min，最后加100 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450nm。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：待測孔OD450nm大于0.2，并大于空白孔OD450nm的2.1倍。以陽性孔最小OD450nm所對應(yīng)的多抗稀釋倍數(shù)作為效價(jià)。

多抗敏感性鑒定：采用間接競爭ELISA方法(ic-ELISA)[21]鑒定多抗敏感性，具體操作為：取包被好的ELISA板，首先每孔加入100 μL不同濃度梯度的CLO標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后加入一定倍數(shù)稀釋的多抗(效價(jià)測定時(shí)OD450nm為1.2左右)，在37 ℃條件下孵育15 min。其他操作步驟與多抗效價(jià)測定操作相同。以抑制率(B/B0)為縱坐標(biāo)(其中B為陽性孔的OD450nm，B0為CLO濃度為零時(shí)的OD450nm)，以CLO濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，最后根據(jù)抑制曲線獲得的線性回歸方程計(jì)算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(Half inhibitory concentration，IC50)，并以此來評定多抗的敏感性。

多抗特異性鑒定：選擇PA、BA、SAL、RAC等瘦肉精類藥物作為競爭物，采用ic-ELISA法測定各競爭物對多抗的IC50。以CLO的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為交叉反應(yīng)率(Cross reactivity，CR%)，CR越低，則說明多抗的特異性越強(qiáng)[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對所得的數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行處理并繪圖，對分子結(jié)構(gòu)式及合成路線圖用ChemDraw Pro 18.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原鑒定

2.1.1 紫外掃描鑒定結(jié)果 采用重氮化法合成CLO人工抗原，用紫外掃描法鑒定其偶聯(lián)效果，結(jié)果如圖3所示。從紫外掃描圖譜中可以看出，BSA和OVA在280 nm處左右有明顯的特征吸收峰，CLO在225 nm和270 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，而合成的人工抗原(CLO-BSA和CLO-OVA)的特征吸收峰相比載體蛋白和CLO均發(fā)生明顯偏移，特征吸收峰偏移是由于靶標(biāo)與載體蛋白偶聯(lián)改變了原有的化學(xué)基團(tuán)并形成了新的基團(tuán)所致，進(jìn)而初步證明人工抗原偶聯(lián)成功。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定 采用SDS-PAGE對人工抗原的偶聯(lián)效果進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果如圖4、圖5所示。從圖中可看出，CLO-BSA電泳條帶遷移的位移小于BSA，具拖尾現(xiàn)象，說明其分子質(zhì)量大于BSA，證明ACLO成功偶聯(lián)到BSA上；CLO-OVA的電泳條帶遷移的位移小于OVA，同樣證明ACLO成功偶聯(lián)到載體蛋白(OVA)上。

2.2 多抗制備及鑒定

2.2.1 多抗效價(jià)測定 利用i-ELISA方法測定多抗效價(jià)，結(jié)果如表1所示。利用免疫抗原免疫的4只小鼠所獲得的多抗效價(jià)均達(dá)到1∶25 600以上，其中4號小鼠多抗效價(jià)更高，免疫效果更好。效價(jià)測定結(jié)果表明，免疫原成功刺激小鼠機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗體。

表1 效價(jià)測定結(jié)果

2.2.2 敏感性鑒定 利用ic-ELISA方法鑒定多抗的敏感性，結(jié)果如表2所示。免疫的4只小鼠所獲得的多抗均能夠特異性識別并結(jié)合CLO，CLO對4只小鼠多抗的IC50分別為81.360、7.026、47.474和34.086 ng/mL，其中2號小鼠多抗敏感性最好，其抑制曲線線性回歸方程為y=-0.146 8x+0.624 3，R2=0.991(圖6)，x表示log10CLO質(zhì)量濃度，y表示抑制率。因此，可選擇2號小鼠脾細(xì)胞作為細(xì)胞融合對象，后期可通過細(xì)胞融合及單克隆抗體篩選技術(shù)制備單克隆抗體。

表2 間接競爭ELISA鑒定結(jié)果

2.2.3 特異性鑒定 選擇敏感性最好的2號小鼠多抗，以其他瘦肉精類藥物(PA、BA、SAL、RAC)作為競爭物，利用ic-ELISA方法鑒定多抗特異性。特異性鑒定結(jié)果如表3所示，多抗與PA、BA、SAL、RAC均不存在交叉反應(yīng)，具有較高的特異性，在實(shí)際樣品檢測中可有效排除其他瘦肉精類藥物的干擾。

表3 多抗與競爭物的交叉反應(yīng)

3 討 論

3.1 人工抗原合成

CLO分子質(zhì)量較小，屬于小分子半抗原，無法直接刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，需要連接到大分子載體上才能獲得免疫原性。通常選擇溶解性好，且含有大量活潑基團(tuán)(羧基和氨基)的BSA和OVA作為載體蛋白，而且BSA和OVA同源性較差，選擇BSA作為免疫原載體，而OVA作為包被原載體，可有效排除載體蛋白本身對鑒定多抗敏感性和特異性的影響。在選擇人工抗原合成方法時(shí)，若靶標(biāo)分子含有羧基、氨基、羰基、羥基、巰基和芳香胺等基團(tuán)，則可采用碳二亞胺法、戊二醛法、混合酸酐法、重氮化法等方法進(jìn)行偶聯(lián)。若半抗原分子結(jié)構(gòu)中無活潑基團(tuán)，則可先通過分子改造引入活潑基團(tuán)，或基于結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性原理，選擇靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)類似物為半抗原進(jìn)行偶聯(lián)。CLO分子結(jié)構(gòu)上無可用于連接的活潑基團(tuán)，李丹妮等[2]以CLO的衍生物ACLO為半抗原，利用琥珀酸酐法對苯環(huán)4位氨基基團(tuán)進(jìn)行改造，引入羧基基團(tuán)，進(jìn)而利用碳二亞胺法合成CLO人工抗原。筆者曾采用過此方法，但對半抗原改造時(shí)條件不易控制，合成的人工抗原未達(dá)到預(yù)期的免疫效果。本研究同樣從苯環(huán)4位的氨基基團(tuán)出發(fā)，采用重氮化法，將氨基基團(tuán)重氮化后直接偶聯(lián)到載體蛋白上，通過免疫BALB/c小鼠，獲得了針對CLO敏感性高和特異性強(qiáng)的多抗，證明此方法合成的CLO人工抗原具有較好的免疫原性。

3.2 人工抗原質(zhì)量鑒定

鑒定人工抗原偶聯(lián)效果，通常采用物理和化學(xué)方法，如紫外掃描、SDS-PAGE、紅外掃描、質(zhì)譜鑒定等。紅外掃描和質(zhì)譜鑒定可準(zhǔn)確分析分子基團(tuán)的變化，但操作較為繁瑣，儀器較為昂貴。紫外掃描和SDS-PAGE鑒定方法雖然操作簡單，但準(zhǔn)確度不如紅外掃描和質(zhì)譜鑒定。物理和化學(xué)鑒定方法僅能初步鑒定人工抗原的偶聯(lián)效果，筆者在采用琥珀酸酐法和碳二亞胺法合成CLO人工抗原時(shí)，采用紫外掃描和SDS-PAGE均鑒定CLO偶聯(lián)到載體蛋白上，但免疫小鼠后獲得的多抗血清雖然效價(jià)很高，但并不能特異性的識別CLO，原因可能如下：CLO半抗原在人工抗原偶聯(lián)過程中，決定其免疫原性的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，也就意味著免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體不一定完全是針對CLO的，或者是抗原決定簇并未充分地暴露，從而導(dǎo)致多抗血清表現(xiàn)出較強(qiáng)的非特異性。因此，在人工抗原偶聯(lián)方法選擇時(shí)，應(yīng)盡量避免改變CLO的抗原決定簇結(jié)構(gòu)，盡量使其充分暴露，并通過免疫動(dòng)物，鑒定多抗是否能特異性識并結(jié)合CLO來最終驗(yàn)證人工抗原的偶聯(lián) 效果。

4 結(jié) 論

本研究采用重氮化法成功合成免疫原性良好的CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后獲得效價(jià)高達(dá)1∶25 600以上的鼠源多抗血清，獲得的多抗血清能特異性識別CLO，具備較高的敏感性(IC50=7.026 ng/mL)，同時(shí)與其他瘦肉精類藥物無交叉反應(yīng)，特異性良好，為CLO高親和力單克隆抗體的制備以及ELISA和ICS檢測方法的建立奠定良好的基礎(chǔ)。