miR-509-3p與Rab11a在喉鱗狀細胞癌中的表達及其意義①

金秀琳，詹俊杰，范宗憲

(佳木斯大學附屬第一院耳鼻喉科，黑龍江 佳木斯 154003)

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科多發(fā)病之一，其分子發(fā)病機制的研究目前還有待深入，喉癌患者的早期診斷對精準特異化治療至關重要，因此急需探明喉癌基因源性發(fā)病機制。微小RNA (microRNA, miRNA)是由小于30個核苷酸序列組成的不直接翻譯蛋白產物的小RNA，參與細胞新陳代謝、復制增殖及自噬凋亡等重要生命過程[1,2]。經研究發(fā)現miR-509-3p為調節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子。本研究運用RT-qPCR檢測miR-509-3p和預測靶標基因Rab11a在喉癌及癌旁組織中的表達量；再行miR-509-3p mimics轉染Hep-2細胞，檢測Rab11a的表達量，分析miR-509-3p和Rab11a的相關性。為尋求喉癌的分子發(fā)病機制提供一定的參考依據。通過對miR-509-3p在喉癌中的重要作用，將為今后喉癌miRNAs的診斷治療提供新視點。

1 材料與方法

選取2019-01～2019-10于佳木斯大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科治療的術中新鮮標本15例，均為初次患病，術前未經放療及化療且病理報告為喉部鱗狀細胞癌。癌標本切取腫瘤主體，避開壞死區(qū)域；癌旁正常標本取距腫瘤安全緣0.5cm以上的組織。標本離體清潔后，半小時內置于無RNA酶的專用凍存管液氮罐中速凍。15例喉癌患者中，男12例，女3例，年齡52～76歲，平均62.4歲。其中TNM分期依照UICC2002第6版喉癌分期標準[3]，其中II期3例，III期9例，Ⅳ型3例。組織學類型依照1990年WHO喉癌分類標準[4]分類，其中高分化型5例，中分化型8例，低分化型2例。

1.1 試劑與儀器

Trizol RNA提取液(天根)，PerfectStart Green qPCR SuperMix(AQ601-04全式金)，oligdT(擎科)，RNase inhibitor(E00381 Thermo)，RevertAid Reverse Transcriptase(EP0441 Thermo)，實時熒光定量PCR儀(Q1 ABI)，超微量核酸分析儀(Nano-200 杭州奧盛儀器有限公司)，冷凍離心機(H2100R 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)等。

1.2 提取總RNA

將TRizoI抽提液與組織標本或細胞混勻，加氯仿震蕩，離心，上清液加異丙醇后靜置數小時，離心取沉淀物，待部分溶解后加DEPC水，完全溶解后于超微量核酸分析儀下測提取RNA的純度及濃度(A260/280比值在1.8～2.1時，提示滿意)，瓊脂凝膠電泳測總RNA的完整度情況。檢測合格后將總RNA置于-80 ℃冰箱凍存。見表1。

表1 轉染miR-509-3p-mimics后總RNA純度及濃度檢測

1.3 實時熒光定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)方法

取總RNA為初始模板，在特異引物和逆轉錄酶的作用下，合成與待測模板互補的DNA，產物為模板RNA-cDNA雙鏈結構，該結構中模板RNA被RNA酶H降解，僅留新合成的cDNA作為PCR放應的初始模板進行擴增。通過PCR放應體系中熒光基團發(fā)光程度計算2-△△Ct值，評估初始RNA模板的相對表達量。

引物設計如下： miR-509-3p-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-CAGTTGAGCTACCC；miR-509-3p-F：GCCGAGTGATTGGTACGTCT；has-Rab11a-175-F：AGAAGCATCCAGGTTGATGG；has-Rab11a-175-R：GTTCTTTCAGCCATCGCTCT。GAPDH-127F(H)：CCAGGTGGTCTCCTCTGA；GAPDH-127R(H)：GCTGTAGCCAAATCGTTGT。

1.4 細胞培養(yǎng)、細胞轉染

將Hep-2細胞快速融化，離心后置于10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，吹打混勻后轉移至培養(yǎng)瓶中37℃ 5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。細胞呈對數生長期，平鋪細胞幾近接觸時進行傳代。

轉染：將培養(yǎng)瓶中貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，完全培養(yǎng)基終止消化，按照Hep-2細胞密度為5×104個/孔接種到24孔板中，平鋪細胞后培養(yǎng)18～24h，當細胞長至60%～80%后，給予轉染。RT-qPCR檢測基因表達同前。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用IBM SPSS statistics 23.0統(tǒng)計軟件，應用獨立樣本t檢驗用于兩組以上數據之間的比較，數據均以平均值±標準差表示，皮爾遜相關性分析 miR-509-3p與Rab11a相對表達量之間的相關性。P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測15例喉癌組織中miR-509-3p平均表達量低于癌旁組織(P<0.05)，見圖1A；Rab11a平均表達量高于癌旁組織(P<0.05)，見圖1B；皮爾遜相關分析呈負相關(r<0)。

A B

2.2 miR-509-3p mimic轉染喉癌Hep-2細胞株后預測目的基因Rab11a表達水平，統(tǒng)計結果揭示轉染miR-509-3p mimic組預測靶基因Rab11a表達水平較NC轉染組和空白組下調(P<0.05)。見圖2。Rablla表達圖 RT-9PCT擴增曲線及熔解曲線，見圖3。

圖2 轉染miR-509-3p-mimics后Rab11a表達量

A B

3 討論

喉癌患病率排名僅次于鼻咽癌，大多數為鱗狀細胞癌，僅5%左右為其他類型細胞癌，占全身惡性腫瘤的3%左右。據統(tǒng)計，在中國每十萬人就有一人患有喉癌，東北、華北的發(fā)病率較高。為減少喉癌的患病率及有效的靶向治療，急需尋求喉癌發(fā)病的分子機制。miRNA能夠特異性結合在目標信使RNA ( mRNA)的3' 非翻譯區(qū)，當堿基配對互補結合時，直接將目標mRNA切割降解；如堿基對只部分配對結合，則制止mRNA蛋白質翻譯表達[5]。新研究發(fā)現，miRNA還可結合到目的mRNA 5'非翻譯區(qū)[6]和基因表達區(qū)[7]，從而對蛋白翻譯過程進行修飾。

miRNA-509-3p已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調節(jié)因子。miRNA-509-3p在胃癌組織[8]、腎癌組織[9]及卵巢上皮癌組織[10,11]中表達均下調。而且過表達miRNA-509-3p抑制胃癌細胞的存活能力，提高遠期生存率，還可以誘導了腎癌細胞凋亡作用。同時提高卵巢癌上皮細胞對順鉑的敏感性。

Rab11a在膜受體介導的胞吞大分子物質中發(fā)揮著重要的作用。高表達Rab11a后：通過TBC[12]結構域抑制細胞自噬行為；抑制非小細胞肺癌的細胞凋亡，促進淋巴轉移及預后不良；還可提高胰腺癌細胞的增殖能力，通過磷酸化GSK3β激活Wnt信號通路[13]促進細胞周期蛋白D1、E的表達而實現[14]。

為了明確miRNA-509-3p和 Rab11a在喉癌中表達量及相關性，探索其可能致病機理。本課題分為2部分進行研究：首先運用RT-qPCR檢測miR-509-3p和Rab11a在15例喉癌及癌旁組織中的表達量，發(fā)現miR-509-3p平均表達量低于癌旁組織，Rab11a平均表達量高于癌旁組織(P<0.05)；皮爾遜相關分析呈負相關(r<0)。再行miR-509-3p mimics轉染Hep-2細胞，經轉染miR-509-3p mimic組Rab11a表達水平較NC轉染組和空白組下調(P<0.05)。分析Rab11a的致癌原因可能通過磷酸化GSK3β激活Wnt信號通路促進細胞周期蛋白D1、E的表達，提高喉癌細胞的增殖能力；增強喉癌細胞對大分子物質的攝取，為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)支持；再之通過TBC結構域抑制癌細胞自噬行為，為喉癌細胞的生存提供完整的基本結構和保障。本研究證實miR-509-3p至少可通過負向調控Rab11a的表達而發(fā)揮其抑癌作用，為進一步證實Rab11a是miR-509-3p的靶基因奠定了實驗基礎。如確定Rab11a是miR-509-3p的靶基因還需做雙熒光素酶報告質粒實驗；對于miR-509-3p和Rab11a對喉癌細胞遷移能力的影響及是否抑制喉癌細胞凋亡等方面還有待繼續(xù)研究。