假體周圍感染兔模型中D-二聚體的動(dòng)態(tài)表達(dá)與感染時(shí)間和種植細(xì)菌量的相關(guān)性研究

吳波文 蔡偉良 劉歡歡 劉銀 李潔 朱寶玉 曾偉△

假體周圍感染(Prosthetic Joint Infections，PJI)是全關(guān)節(jié)置換術(shù)中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，因其難以診斷導(dǎo)致2年發(fā)病率達(dá)1%～2%[2-3]。因此，須尋找更敏感的PJI早期診斷指標(biāo)。紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive Protein，CRP)和白細(xì)胞數(shù)(White Blood Cell Count，WBC)已用于PJI診斷，但這些血清指標(biāo)的檢測尚缺乏敏感性和特異性。D-二聚體是體內(nèi)嚴(yán)重感染的關(guān)鍵指標(biāo)[4-6]，與PJI的關(guān)系尚不清楚。因此本研究建立PJI兔模型，監(jiān)測D-二聚體的表達(dá)變化，明確其在PJI早期診斷中的價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MSSA)購買于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，目錄號35521)，并在本實(shí)驗(yàn)室保存。無特定病原(Specified Pathogen Free，SPF)級新西蘭大白兔(成年，雄性，體質(zhì)量(5.84±0.91)kg)購于湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CRP、ESR、WBC試劑盒以及D-二聚體檢測ELISA試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物模型和分組

本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已由本院倫理委員會(huì)審批通過(審批號2020031107)，依照當(dāng)前人初次人工髖關(guān)節(jié)置換多為生物型，通過3D打印技術(shù)制作兔生物型解剖型人工股骨頭。構(gòu)建假體周圍感染動(dòng)物模型：將注射生理鹽水(MSSA含量為0)作為對照設(shè)為MSSA-A組，將MSSA分別以0.5×104，0.5×105，0.5×106cfu/mL濃度1 mL菌液注入關(guān)節(jié)腔，分別按順序設(shè)為MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D組，各10只。圍手術(shù)期不用抗生素，術(shù)后兔分籠喂養(yǎng)，肢體不制動(dòng)，隨意活動(dòng)。術(shù)后2周處死動(dòng)物。選取體型大小基本一致日本大白兔40只，隨機(jī)抽選3只完成計(jì)算機(jī)化X射線體層照相術(shù)(Computerized Tomography，CT)三維重建，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，3D打印人工股骨頭，制作生物型解剖型人工股骨頭及髓腔銼等手術(shù)工具；人工股骨頭仿當(dāng)前臨床常用假體，將鈷-鉻-鉬合金的燒結(jié)多孔涂層燒結(jié)于鈦合金假體上。

細(xì)菌培養(yǎng)：分別取MSSA菌株接種于血瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑選單個(gè)菌落用無菌0.9%氯化鈉溶液2 mL將菌落洗脫并搖勻，用細(xì)菌濃度比濁儀配成0.5×106cfu/mL濃度的MSSA懸濁液。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求細(xì)菌濃度，將其部分稀釋并準(zhǔn)備成0.5×105cfu/mL和0.5×104cfu/mL濃度分裝備用。

構(gòu)建動(dòng)物模型：20 g/L戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg兔耳緣靜脈麻醉，以左側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子為中心，做長4 cm 的弧形切口，從左股前與外側(cè)肌間隙進(jìn)入髖關(guān)節(jié)，切除股骨頭保留股骨距2 mm。以自制髓腔銼擴(kuò)髓，插入假體，輕敲致假體固定牢固，保持20°～30°的前傾角，連續(xù)鎖邊縫合關(guān)節(jié)囊，再間斷縫合關(guān)閉手術(shù)切口。為避免淺層軟組織醫(yī)源性感染，嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)囊及深部肌層后即用無菌針頭將菌液注入關(guān)節(jié)囊(見圖1)。

圖1 手術(shù)過程大體圖片

1.3 觀察指標(biāo)

首先進(jìn)行大體觀察：術(shù)后觀察切口愈合情況，有無紅、腫和生物膜形成。其次，在術(shù)前及術(shù)后1，7，13 d取各組白兔耳緣靜脈抽取血液標(biāo)本，記錄WBC、CRP、ESR及D-二聚體數(shù)值。所有指標(biāo)均嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的說明書進(jìn)行檢測。

術(shù)后2周靜脈注射苯巴比妥100 mg/kg對兔子實(shí)施安樂死。參照肌肉骨骼感染協(xié)會(huì)MSIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，假體周圍感染的診斷需要滿足至少一個(gè)主要指標(biāo)(形成與假體相通的竇道或在兩份獨(dú)立的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到致病菌)，本研究選取兩塊假體周圍組織，如細(xì)菌培養(yǎng)均與接種菌相符，考慮假體周圍感染兔模型構(gòu)建成功。

使用無菌技術(shù)從手術(shù)部位收取植入的螺釘和墊圈，將墊圈用5 mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗5次，獲取假體周圍菌液原樣本。對菌液進(jìn)行涂板培養(yǎng)：培養(yǎng)18～24 h，通過菌落形態(tài)、涂片鏡檢進(jìn)行確認(rèn)，隨后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌陽性率=(接種菌的數(shù)量/總細(xì)菌的數(shù)量)×100%。

1.4 生物膜的電鏡觀察

13 d后靜脈注射苯巴比妥100 mg/kg對兔子實(shí)施安樂死。使用無菌技術(shù)從手術(shù)部位收取植入的螺釘和墊圈。將墊圈用5 mL磷酸鹽緩沖鹽水沖洗5次，在固定劑(2.5%戊二醛)中保存24 h[7]。脫水并涂上金-鈀后，隨機(jī)選擇一個(gè)觀察區(qū)域并標(biāo)記在墊圈上。然后，用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)(日本東京JEOL有限公司)分析墊圈。由于螺釘形狀不規(guī)則，因此無法通過SEM掃描。所有參與微生物實(shí)驗(yàn)和SEM研究的人員都不知道樣品的類型和分組。

1.5 檢測指標(biāo)

比較MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D之間菌液濃度和假體周圍細(xì)菌陽性率。各組對比D-二聚體表達(dá)差異，明確D-二聚體在不同時(shí)間及不同細(xì)菌濃度所致假體周圍感染中敏感性及特異性有無差異。分析D-二聚體與細(xì)菌感染的不同濃度的相關(guān)性及D-二聚體與感染時(shí)間的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 假體周圍感染兔模型的建立及評估

術(shù)后1周觀察兔子的行為，模型組兔子明顯出現(xiàn)右后肢體和左側(cè)不協(xié)調(diào)，兔子拒絕觸地，可明顯觀察到切口出現(xiàn)紅腫等炎癥特征，本實(shí)驗(yàn)中所有兔均無死亡。術(shù)前及術(shù)后1，7，13 d取各組白兔耳緣靜脈抽取血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)CRP、ESR、WBC及D-二聚體的濃度(見表1-4)。

表1 各組白兔耳緣靜脈抽取血液CRP含量

術(shù)后2周安樂死處死兔子，并從MSSA-B組、MSSA-C組、MSSA-D組的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到金黃色葡萄球菌，與接種菌類型一致。另外，從MSSA-B組、MSSA-C組、MSSA-D組的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到金黃色葡萄球菌，與接種菌也一致。以上結(jié)果表明假體周圍感染兔模型構(gòu)建成功(見圖2)。

表2 各組白兔耳緣靜脈抽取血液

表3 各組白兔耳緣靜脈抽取血液D-二聚體的相對水平

表4 各組白兔傷口處WBC含量

2.2 感染后13 d葡萄球菌生物膜的形成

評估MSSA感染后13 d后假體關(guān)節(jié)生物膜形成的變化。用掃描電鏡直接觀察隨機(jī)選取區(qū)域的假體生物膜的形成情況(見圖2)，除MSSA-B組外，MSSA-C組和MSSA-D組可見生物膜大量形成，三組均可見密集的細(xì)菌堆積。

圖2 掃描電子顯微鏡觀察植入假體表面生物膜及附著葡萄球菌的圖像(箭頭指示生物膜，×1 000)

2.3 不同濃度細(xì)菌對假體周圍細(xì)菌陽性率的影響

各組(B、C、D組)之間不同菌液濃度的假體周圍細(xì)菌陽性率有差異(F=214.366，P=6.125×10-5)。與MSSA-B組(25.24±3.61)比，MSSA-C組(31.41±1.92)和MSSA-D組(51.36±2.88)的細(xì)菌陽性率明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.251，9.998；P=0.014，0.005)。另外，與MSSA-C組比，MSSA-D組的假體周圍細(xì)菌陽性率增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.552，P=0.023)。

2.4 D-二聚體的動(dòng)態(tài)表達(dá)與感染時(shí)間的相關(guān)性

分析各組的D-二聚體的表達(dá)與感染時(shí)間的相關(guān)性(見表5)，D-二聚體和感染時(shí)間之間無相關(guān)性(P=0.588，0.247，0.099，0.062)。

表5 各組的D-二聚體水平與感染時(shí)間的相關(guān)性

2.5 D-二聚體的動(dòng)態(tài)表達(dá)與細(xì)菌濃度的相關(guān)性

分析各組的D-二聚體的表達(dá)與細(xì)胞感染濃度的相關(guān)性(見表6)，在1，7，13 d時(shí)間點(diǎn)，D-二聚體和細(xì)菌濃度均正相關(guān)(P=0.003，0.002，0.001；r=0.921，0.955，0.923)。

表6 術(shù)后1 d D-二聚體水平與細(xì)菌濃度的相關(guān)性

3 討論

目前在臨床實(shí)踐中仍缺乏廣泛采用的有效PJI診斷方法。以往研究主要集中于炎癥標(biāo)志物，而最近研究發(fā)現(xiàn)凝血級聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)是PJI的常見早期事件，參與該過程的許多相關(guān)分子也是炎癥反應(yīng)的重要放大因子[8]。血液中D-二聚體是一種重要的凝血生物標(biāo)志物，具有鑒定PJI的疑似病例或排除非PJI病例的潛在作用。

D-二聚體已用于監(jiān)測與全關(guān)節(jié)置換術(shù)發(fā)生后深靜脈血栓形成和失血有關(guān)的纖溶活性波動(dòng)[9-10]。同時(shí)，D-二聚體本身充當(dāng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑，并有助于感染性生物或炎癥細(xì)胞的定位[11-12]。一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究共招募684名敗血癥患者，并觀察到更高水平的D-二聚體與死亡率增加相關(guān)，該研究突顯D-二聚體在敗血癥患者中的預(yù)后意義[13]。Xie等[14]的研究顯示血漿D-二聚體水平在初次PJI后6 h達(dá)到峰值，維持升高24 h，并持續(xù)90 d恢復(fù)到術(shù)前水平。Parvizi等[15]提出了假體周圍關(guān)節(jié)感染的新定義，并列出了三種循環(huán)標(biāo)志物(CRP，D-二聚體和ESR)作為術(shù)前診斷的次要標(biāo)準(zhǔn)。與之前的研究一致，本研究觀察到PJI葡萄球菌感染兔模型中D-二聚體明顯升高，而且還進(jìn)一步觀察到與D-二聚體感染細(xì)菌濃度正相關(guān)。但是同樣觀察到CRP和ESR水平也隨著感染細(xì)菌的濃度增加而持續(xù)增加，表明PJI的診斷可能同時(shí)需要血液D-二聚體、CRP、ESR水平的共同指示。

另外，血液中D-二聚體的診斷價(jià)值受到最近發(fā)表的幾項(xiàng)研究的質(zhì)疑，這些研究認(rèn)為對原發(fā)性或持續(xù)性PJI的診斷僅具有中等敏感性和特異性[16-17]。有薈萃分析的研究總結(jié)表明，單個(gè)特異性D-二聚體測試的陽性結(jié)果仍不能診斷PJI。對于D-二聚體作為PJI的診斷生物標(biāo)志物的價(jià)值判斷，應(yīng)保持保守的態(tài)度[18]。CRP和ESR都是急性期的指標(biāo)，也是廣泛建立的PJI血清標(biāo)志物[16-17，19-20]。CRP，D-二聚體和纖維蛋白原的常規(guī)檢測具有成本效益，CRP檢測的價(jià)格約為ESR的兩倍[21-23]。根據(jù)最新的薈萃分析結(jié)果[18]和本研究的結(jié)果，筆者推測D-二聚體結(jié)合ESR或D-二聚體結(jié)合CRP在診斷PJI中可能具有較好的應(yīng)用前景。

由于大多數(shù)與假體相關(guān)的感染是由表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和MSSA引起的[24]，聚乙烯對表皮葡萄球菌極具吸引力，但是假體金屬更適合MSSA的黏附[25]。因此，PJI治愈率的差異與多種復(fù)雜因素有關(guān)。浮游細(xì)菌附著在植入物上產(chǎn)生的生物膜使PJI的治療更加困難，原因是生物膜可以抵抗宿主的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，而且對抗菌劑的敏感性低。另外，生物膜內(nèi)的細(xì)菌生存時(shí)間更長，并成為細(xì)菌的來源，這些細(xì)菌擴(kuò)散到植入物表面的其他部位，可以形成新的生物膜。本研究觀察到中濃度和高濃度在13 d時(shí)已經(jīng)有較多的生物膜形成，此時(shí)D-二聚體已經(jīng)持續(xù)增加，但是無論高濃度或低濃度MSSA感染1 d即發(fā)現(xiàn)D-二聚體和細(xì)菌數(shù)量明顯增加但是此時(shí)還未觀察到生物膜形成。因此，D-二聚體的濃度變化對PJI的早期診斷有價(jià)值。

本研究中提出的動(dòng)物模型復(fù)制了關(guān)節(jié)假體中常用的生物材料的關(guān)節(jié)內(nèi)植入，但存在如下缺陷：首先，該動(dòng)物模型與人類假體關(guān)節(jié)置換的力學(xué)模式不同。其次，這種動(dòng)物模型適用于PJI中血液和其他指標(biāo)的變化，但不適用于其他人工關(guān)節(jié)研究，例如關(guān)節(jié)假體松動(dòng)。因此，仍需要開發(fā)更接近人類假體的人工關(guān)節(jié)動(dòng)物模型。另外，需要進(jìn)一步分析在不同菌種感染的假體模型中D-二聚體的變化與細(xì)菌感染的相關(guān)性，以確定D-二聚體是否可以作為最敏感的診斷標(biāo)志物。

綜上所述，金黃色葡萄球菌感染假體植入兔模型中可形成生物膜，而且D-二聚體與金黃色葡萄球菌濃度正相關(guān)，因此D-二聚體可作為一種極為敏感金黃色葡萄球菌的變化指標(biāo)，與CRP及ESR指標(biāo)有相當(dāng)?shù)脑\斷效能。