慢性乙型肝炎患者CD4+Th細(xì)胞中LSD1表達(dá)及其作用

毛 雪， 陳志勇， 顧宇峰， 朱雪娟， 譚曉慧*， 汪曉鶯， 朱軼晴， 湯 偉

1. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，南通 226001 2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，南通 226001 3. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫系，南通 226001

目前一致認(rèn)為，乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染的機(jī)制涉及病毒和機(jī)體免疫功能兩方面，后者占主要地位[1-2]。HBV感染后，體內(nèi)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)增殖、分化及各亞群尤其是Th1/Th2之間的平衡狀況，直接或間接影響乙型肝炎的發(fā)病狀況及轉(zhuǎn)歸。各型乙型肝炎患者體內(nèi)均存在明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡。急性乙型肝炎以Th1類細(xì)胞應(yīng)答占優(yōu)勢，上升的Th1 類細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)等]促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)參與清除HBV；慢性乙型肝炎(CHB)則以Th1類細(xì)胞應(yīng)答下降為主，Th1類細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，Th2類細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞免疫應(yīng)答減弱，而Th1/Th2類細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡可能是HBV 感染慢性化的重要機(jī)制之一[3-4]。

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(histone lysine-specific demethylase 1，LSD1)具有特異性去除單甲基化和二甲基化 H3K4 和 H3K9 位點(diǎn)上的甲基基團(tuán)的功能。LSD1在淋巴細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，參與維持Th1/Th2細(xì)胞分化平衡。張潔等[5]的研究顯示，在體外可通過降低LSD1 活性誘導(dǎo)Th1/Th2 細(xì)胞分化偏向Th1 細(xì)胞，Th1類細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，Th1類細(xì)胞免疫應(yīng)答水平增強(qiáng)。但是，目前未明確CHB患者體內(nèi)LSD1的表達(dá)是否與其Th1類細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)、Th2類細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)致Th1 /Th2類細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡有關(guān)。

因此，本研究通過觀察CHB患者外周血CD4+Th細(xì)胞中LSD1的表達(dá)水平，分析其與血清中IFN-γ、IL-4、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乙肝病毒載量(HBV-DNA)等指標(biāo)的相關(guān)性，探討LSD1表達(dá)與Th1、Th2細(xì)胞免疫的關(guān)系，以了解LSD1介導(dǎo)的組蛋白修飾在HBV感染慢性化機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年6月至12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染科住院的65例CHB患者，均依據(jù)慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)[6]診斷。65例CHB患者中，男性41例、女性24例，年齡18～65歲，平均(43.32±12.38)歲。所有患者均排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染及應(yīng)用相關(guān)藥物、酒精或自身免疫性疾病等引起的急慢性肝損害，均未接受過抗HBV藥物、糖皮質(zhì)激素或胸腺肽等免疫調(diào)節(jié)劑的治療。另選擇30例同期于本院接受健康體檢的健康人作為對照，男性18例、女性12例，年齡22～63歲，平均(44.43±11.74)歲。對照組均無病毒性肝炎及自身免疫性疾病病史，肝功能正常，HBV標(biāo)志物陰性，HCV抗體陰性。2組研究對象性別構(gòu)成與年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)CHB患者入院時(shí)的ALT水平將65例患者分為ALT高水平組[>4×ULN(正常上限)]與ALT低水平組(≤4×ULN)；按HBV-DNA定量結(jié)果，將65例患者分為HBV-DNA高載量組(≥106拷貝/mL)與HBV-DNA低載量組(<106拷貝/mL)。

1.2 主要試劑及儀器 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)測定試劑盒購自美國雅培公司；HBV-DNA熒光定量試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司)；人IFN-γ和 IL-4 ELISA檢測試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司)。CD4+Th細(xì)胞陽性分選試劑盒(含試劑A和試劑B)購自美國Dynal公司。人CD3-FITC、CD4-PE單抗購自美國BD公司；兔抗人β-actin 抗體購自美國Bioworld Technology公司；兔抗人LSD1單克隆抗體購自美國CST公司；HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體購自美國Bioworld Technology公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Pierce公司。全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司。

全自動蛋白質(zhì)核酸定量檢測儀購自德國Eppendorff公司。MACS磁力架購自美國Dynal公司?；瘜W(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Chemi-Smart 5000)購自法國Vilber公司。RG3000熒光定量PCR系統(tǒng)購自德國Rotor-Gene公司。i200SR型全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自美國雅培公司。

1.3 外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1檢測 采集受試者空腹靜脈血4 mL(EDTA-Na2抗凝)，常規(guī)分離出單個(gè)核細(xì)胞，采用免疫磁珠法分選出CD4+Th細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度，≥95.0%時(shí)用于后續(xù)研究。提取CD4+Th細(xì)胞總蛋白，以Western 印跡法檢測LSD1蛋白表達(dá)：SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，先后加入一抗(兔抗人LSD1抗體及兔抗人β-actin抗體)和二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔抗體)孵育，ECL發(fā)光化學(xué)試劑處理后，置于Chemismart 5000，用Image J分析軟件測定目標(biāo)條帶的灰度值。以LSD1/β-actin的灰度比值表示LSD1蛋白的相對含量。

1.4 血清CHB指標(biāo)、免疫指標(biāo)檢測 血清HBsAg定量采用全自動微粒子化學(xué)發(fā)光法，按試劑盒說明書操作。血清HBV-DNA定量檢測采用實(shí)時(shí)定量PCR法，按試劑盒說明書操作。HBV-DNA最低檢測限1 000/mL，各標(biāo)本實(shí)際檢測值取常用對數(shù)，以log10表示。血清IFN-γ、IL-4定量檢測采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 CHB患者與健康人外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)水平比較 結(jié)果(圖1)顯示：CHB患者CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量(0.28±0.09)高于健康人(0.52±0.21；t=-7.49，P< 0.001)。

圖1 外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1蛋白表達(dá)情況

2.2 各亞組CHB患者外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量比較 結(jié)果(表1)顯示：CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量在ALT高水平組低于ALT低水平組(P<0.001)，在HBV-DNA高載量組高于低載量組(P<0.001)。

表1 各亞組CHB患者CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量

2.3 CHB患者與健康人血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值比較 ELISA結(jié)果(表2)顯示：CHB患者血清IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值均低于健康人(P<0.05)，IL-4含量高于健康人(P=0.001)。

表2 CHB患者與健康人血清IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平

2.4 CHB患者LSD1表達(dá)量與血清ALT、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4及HBV-DNA載量的相關(guān)性分析 結(jié)果(表3)顯示：CHB患者外周血CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量與血清ALT水平、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與HBV-DNA載量正相關(guān)(P<0.001)，與血清IL-4水平無相關(guān)性。

表3 LSD1表達(dá)量與血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4及HBV-DNA載量的相關(guān)性

3 討 論

LSD1定位于細(xì)胞核內(nèi)，能特異性脫去染色體組蛋白H3K4、H3K9、H3K27等位點(diǎn)上的單甲基化和二甲基化甲基基團(tuán)，對靶基因的表達(dá)產(chǎn)生不同影響[7-9]。

LSD1在CD4+T淋巴細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，參與維持Th1/Th2分化的平衡。T-bet是Th1細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，影響Th1細(xì)胞的分化及Th1反應(yīng)[10]。CD4+T細(xì)胞分化為Th1過程中，LSD1可通過影響T-bet啟動子區(qū)域的H3K27和H3K4的甲基化，使T-bet轉(zhuǎn)錄降低或失活，從而影響Th1/Th2的平衡狀態(tài)[11-12]。本研究中，CHB患者CD4+Th細(xì)胞中LSD1表達(dá)量較健康人升高；在CHB患者中，ALT低水平組CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量高于ALT高水平組，HBV-DNA高載量組CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量高于HBV-DNA低載量組。

近年來免疫學(xué)研究表明，Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)在機(jī)體細(xì)胞免疫中發(fā)揮非常重要作用。慢性HBV攜帶者、CHB及乙肝肝硬化患者的血清Th1細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-12水平低于健康人群，而Th2細(xì)胞因子IL-4水平高于健康人，IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值與HBV-DNA載量負(fù)相關(guān)[13-15]。另有研究[16]發(fā)現(xiàn)，降低小鼠體內(nèi)LSD1表達(dá)，可明顯提高血清中IFN-γ水平。本課題組前期研究[17]中以HBV感染小鼠為模型，給予LSD1抑制劑反苯環(huán)丙胺(TCP) 及LSD1的siRNA抑制LSD1的活性后，在相同時(shí)間段內(nèi)，血清中HBsAg水平、HBV-DNA載量均明顯降低，且肝組織中HBsAg明顯減少。本研究中，與健康人比較，CHB患者血清IFN-γ含量減少、IL-4含量增加、且IFN-γ/IL-4比值降低，提示CHB患者體內(nèi)Th1/Th2平衡偏向Th2；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CHB患者CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)量與血清IFN-γ及IFN-γ/IL-4負(fù)相關(guān)，與IL-4無相關(guān)性，而與HBV-DNA定量正相關(guān)。本研究結(jié)果與上述研究相符。

綜上所述，CD4+Th細(xì)胞LSD1參與調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡。CHB患者CD4+Th細(xì)胞內(nèi)LSD1表達(dá)升高可引起Th1細(xì)胞分化減少和Th1/Th2反應(yīng)失衡，導(dǎo)致機(jī)體對HBV清除及抑制HBV復(fù)制的能力降低，表現(xiàn)為CHB患者CD4+Th細(xì)胞LSD1高表達(dá)時(shí)，其血清IFN-γ水平降低，肝臟組織炎癥較輕和血清HBV-DNA載量升高。本研究提示，CD4+Th細(xì)胞LSD1表達(dá)升高可能是HBV感染慢性化的機(jī)制之一。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。