電針對肝郁脾虛型慢性疲勞綜合征大鼠血清炎癥因子及腸道菌群的影響

謝亞娜，嵇波，張琴，牟秋杰，趙國禎，劉翼天，石天宇，徐塽，韓娜娜，劉玉婷，張靖宇，葛云鵬

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，以顯著而持久的疲勞為主要特征，伴運(yùn)動(dòng)能力下降、認(rèn)知障礙、焦慮、抑郁等表現(xiàn)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球CFS患病率為0.89%[3]，中國CFS患病率為12.21%[4]。CFS存在嚴(yán)重致殘性，可致27%CFS患者完全喪失勞動(dòng)能力，35%～69%CFS患者無法正常工作[1，5]。目前，針對CFS的西醫(yī)藥物和運(yùn)動(dòng)治療均存在作用局限、不良反應(yīng)常見、安全性未知等問題[6-7]。研究表明，電針治療能有效改善CFS患者的疲勞癥狀、認(rèn)知功能、焦慮和抑郁情緒，提高CFS患者生存質(zhì)量并有良好的安全性[8-10]。

CFS的發(fā)生與機(jī)體免疫炎性反應(yīng)密切相關(guān)[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CFS患者血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）過表達(dá)[11-13]，細(xì)菌內(nèi)毒素成分脂多糖釋放增加[13-14]，腸道菌群厚壁菌門、變形菌門等豐度改變[14]。TNF-α是介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)的重要因子[15]，脂多糖是免疫信號的強(qiáng)力激活劑[16]，腸道菌群可調(diào)節(jié)免疫功能，參與炎性反應(yīng)發(fā)生[17]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針“足三里”“合谷”“太沖”對肝郁脾虛型CFS模型大鼠行為學(xué)、血清TNF-α和脂多糖水平及腸道菌群門豐度的影響，探討“足三里”“合谷”“太沖”配穴對肝郁脾虛型CFS的治療效應(yīng)及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級雄性SD大鼠18只，10周齡，體質(zhì)量（375±25）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號SCXK（浙）2019-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫（24±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h晝夜節(jié)律，自由飲食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和電針組，每組6只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審查批準(zhǔn)（BUCM-4-2019090101-3041）。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處理嚴(yán)格遵循2006年中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

烏來糖（上海國藥試劑集團(tuán)，批號20180308），瓊脂糖（美國Bio-rad公司，批號1613102），大鼠脂多糖、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為m1856951-J、m1002859-J），磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，貨號DP712），TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒（美國Illumina公司）。0.20 mm×13 mm華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），二導(dǎo)HAN’S穴位刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，型號LH202H），動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)（美國Plexon公司，型號CinePlex），動(dòng)物行為學(xué)采集分析軟件（荷蘭NOLDUS公司，型號EthoVision XT），酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司，型號Spectra MAX M2），PCR儀（美國Bio-rad公司，型號Bio-rad T100），藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega公司，型號QuantiFluorTM-ST），熒光儀（美國Thermo Fisher公司，型號Qubit 2.0），生物分析儀（美國Agilent公司，型號2100），高通量測序平臺（美國Illumina公司，型號NovaSeq 6000）。

1.3 造模

參照文獻(xiàn)[18-19]并改進(jìn)，采用強(qiáng)迫游泳、慢性束縛和飲食控制方法制備肝郁脾虛型CFS大鼠模型。大鼠每日于水深45 cm、水溫（26±1）℃圓桶內(nèi)強(qiáng)迫游泳15 min，束縛袋束縛3 h，2種應(yīng)激方法隨機(jī)交替施加，避免產(chǎn)生適應(yīng)性，同時(shí)飲食控制（單日進(jìn)食、雙日禁食），持續(xù)造模21 d。以大鼠萎靡嗜臥、食欲減退、易激惹、便溏伴造模后負(fù)重力竭游泳、礦場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮表現(xiàn)明顯削弱為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 干預(yù)

造模同時(shí)進(jìn)行電針治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[20]選取大鼠雙側(cè)“足三里”“合谷”“太沖”?！疤珱_”“合谷”直刺約2 mm，“太沖”連接電針負(fù)極，“合谷”連接電針正極；“足三里”直刺約7 mm，連接電針負(fù)極，并于“足三里”下2 mm處淺刺入皮下，連接電針正極。頻率2 Hz/15 Hz，強(qiáng)度1 mA，每次20 min，每日1次，共21 d。對照組和模型組給予同等條件束縛。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 曠場實(shí)驗(yàn)

第22日，將大鼠放置在開闊箱中央，箱上方安置攝像機(jī)，攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)相連，記錄分析大鼠在箱內(nèi)3 min移動(dòng)總路程和平均速度，以此評估大鼠在陌生環(huán)境中自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力。

1.5.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

第22日，將大鼠面向開放臂放置在十字迷宮中央格內(nèi)，記錄5 min內(nèi)大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間，以此評估大鼠焦慮樣表現(xiàn)。

1.5.3 負(fù)重力竭游泳

第23日，將大鼠置于水深45 cm、水溫（26±1）℃圓桶內(nèi)進(jìn)行負(fù)重游泳，使用秒表記錄力竭游泳時(shí)間，以此評估大鼠體力和疲勞情況。大鼠負(fù)重標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量5%～10%；力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭部沉入水下10 s，不能上浮。

1.5.4 腫瘤壞死因子-α和脂多糖含量檢測

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，20%烏拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心15 min，取上層血清進(jìn)行ELISA檢測，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.5 16S rDNA測序

大鼠麻醉取血，取結(jié)腸新鮮內(nèi)容物置于無菌凍存管，-80 ℃冰箱保存。檢測時(shí)對樣本基因組DNA進(jìn)行提取、稀釋，使用帶Barcode特異引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域16S V3～V4區(qū)（341F-806R），上游341F 5’-CCTAY GGGRBGCASCAG-3’，下游806R 5’-GGACTACNN GGGTATCTAAT-3’，PCR擴(kuò)增、定量檢測及純化，將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，連接測序接頭，使用建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)Qubit定量和Agilent質(zhì)檢合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測序形成OTU，基于OTU的絕對豐度進(jìn)一步獲得各組腸道菌群門分類水平上各物種的相對豐度，以百分比表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Graphpad Prism 8.4.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以±s表示，滿足正態(tài)分布且方差齊時(shí)用方差分析，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Welch檢驗(yàn)；非正態(tài)分布用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力的影響

與對照組比較，模型組大鼠曠場活動(dòng)總路程和平均速度明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠曠場活動(dòng)總路程和平均速度明顯增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，每組6只）

2.2電針對模型大鼠焦慮樣表現(xiàn)的影響

與對照組比較，模型組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間均明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間均明顯增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，每組6只）

2.3 電針對模型大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響

與對照組比較，模型組大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間明顯延長（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間比較（±s，每組6只）

2.4 電針對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、脂多糖含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量比較（±s，每組6只）

2.5 電針對模型大鼠腸道菌群門水平豐度的影響

在門分類水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、螺旋體門和放線菌門是主要優(yōu)勢菌群。與對照組比較，模型組大鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門豐度下降，變形菌門和螺旋體門豐度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，電針組大鼠腸道厚壁菌門和放線菌門豐度升高，變形菌門和螺旋體門豐度下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，CFS可歸屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”“郁證”等范疇，病位多涉及肝、脾兩臟，臨床常見肝郁脾虛證型[21-22]?！端貑枴ゐ粽撈酚小案沃魃碇钅?，脾主身之肌肉”，強(qiáng)調(diào)肝脾與人的精神情志和肌肉筋膜運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，而精神情志、肌肉筋膜運(yùn)動(dòng)變化與CFS臨床癥狀的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密[23]?！锻ㄐ敢x》言“三里卻五勞之羸瘦”，認(rèn)為足三里能補(bǔ)中益氣，改善疲勞。《針灸穴名解》有“合谷、太沖各兩穴，名為四關(guān)，以其能大開通也”，認(rèn)為合谷、太沖同用能調(diào)治氣血、疏理氣機(jī)，是解郁安神要穴。研究發(fā)現(xiàn)，針刺“足三里”“合谷”“太沖”可健脾解郁、扶正培元，顯著改善CFS模型小鼠的心理及軀體疲勞癥狀[24]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用電針“足三里”“合谷”“太沖”三穴。

本實(shí)驗(yàn)通過模擬人類生活中生理及心理應(yīng)激、飲食不節(jié)現(xiàn)象，建立肝郁脾虛型CFS大鼠模型。結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及模型組大鼠隨著造模推進(jìn)出現(xiàn)的倦怠、嗜臥、食欲減退、大便稀溏、易激惹等表現(xiàn)，與臨床上肝郁脾虛型CFS患者表現(xiàn)出的乏力、氣短神疲、急躁易怒、緊張焦慮、納呆、便溏等癥狀較為接近，提示造模有效。

負(fù)重力竭游泳時(shí)間是反映大鼠體力狀態(tài)的經(jīng)典指標(biāo)，用以評價(jià)大鼠的疲勞情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間明顯縮短，表現(xiàn)為體力下降、易疲勞。電針組大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間明顯延長，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”能增強(qiáng)CFS大鼠體力并改善疲勞。曠場實(shí)驗(yàn)是反映大鼠在陌生環(huán)境中自發(fā)活動(dòng)行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，用以評估大鼠運(yùn)動(dòng)能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠曠場活動(dòng)總路程和平均速度明顯減少，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力下降，與臨床上CFS患者的運(yùn)動(dòng)能力降低相一致[2]。電針組大鼠曠場活動(dòng)總路程和平均速度明顯增加，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”能提高CFS大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。高架十字迷宮是反映大鼠緊張情緒的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，用以評估大鼠的焦慮狀態(tài)。模型組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間減少，表現(xiàn)為明顯焦慮。電針組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間明顯增加，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”具有抗焦慮樣作用。

免疫炎性反應(yīng)是機(jī)體移除有害刺激，促進(jìn)損傷修復(fù)的保護(hù)性措施，應(yīng)答過度可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞、器官等功能受損，介導(dǎo)疾病產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，CFS患者免疫系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，血液中多種細(xì)胞因子水平失衡[12]。TNF-α是免疫系統(tǒng)中重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與炎性反應(yīng)的病理過程[15]。TNF-α過表達(dá)可降低機(jī)體免疫功能，促使炎性介質(zhì)或其他細(xì)胞因子爆發(fā)式增長，加劇機(jī)體炎性反應(yīng)，導(dǎo)致多系統(tǒng)功能損傷[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α過表達(dá)與脂多糖介導(dǎo)的免疫激活密切相關(guān)[13，16，27]。脂多糖存在于革蘭陰性菌外膜中，是一種炎性反應(yīng)誘導(dǎo)劑[16，28]。根據(jù)促炎效力，脂多糖可分為激動(dòng)性、弱激動(dòng)性和拮抗性三類，其中激動(dòng)性脂多糖的釋放與變形菌門變化相關(guān)，可以刺激免疫細(xì)胞活化，上調(diào)TNF-α表達(dá)[13，16，27，29-30]。研究顯示，TNF-α與脂多糖共同參與CFS患者體內(nèi)免疫炎性反應(yīng)，二者含量遞增與CFS患者臨床癥狀（疲勞、情志改變等）變化緊密相關(guān)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，與既往研究一致[11-14]。電針后，大鼠血清TNF-α、脂多糖含量減少，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”改善肝郁脾虛型CFS模型大鼠癥狀是通過下調(diào)大鼠血清TNF-α、脂多糖水平，抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮作用。

腸道內(nèi)菌群水平改變可影響機(jī)體免疫器官發(fā)育或介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)發(fā)生，從而影響宿主健康。CFS患者腸道菌群厚壁菌門豐度下降，變形菌門豐度升高，這種改變可能與CFS患者腸道內(nèi)促炎性物種增加，抗炎性物種減少相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門豐度下降，變形菌門和螺旋體門豐度升高，與既往研究變化趨勢相似[14]；電針組大鼠厚壁菌門和放線菌門豐度升高，變形菌門和螺旋體門豐度下降。由于3組間門水平物種豐度變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故尚不能認(rèn)為電針“足三里”“合谷”“太沖”改善肝郁脾虛型CFS大鼠癥狀是通過調(diào)節(jié)腸道菌群門水平豐度變化發(fā)揮作用的。

綜上所述，電針“足三里”“合谷”“太沖”能增強(qiáng)肝郁脾虛型CFS大鼠運(yùn)動(dòng)能力，改善疲勞狀態(tài)和焦慮情緒，其機(jī)制可能與下調(diào)血清TNF-α及脂多糖水平、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，但尚不能認(rèn)為與調(diào)節(jié)腸道菌群門水平豐度相關(guān)。今后可深化腸道菌群種屬和代謝水平的研究，以期挖掘腸道菌群免疫介導(dǎo)作用與CFS之間的關(guān)系。