活血榮絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠PINK1/Parkin信號(hào)通路的影響

顏思陽，楊仁義，劉利娟，郭純，尹倩，張宇星，周德生

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是腦動(dòng)脈狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死，具有高致殘率、致死率，是腦卒中死亡的首要原因[1]。近年來，我國缺血性腦卒中發(fā)病率、患病率持續(xù)升高[2]?；謴?fù)缺血腦組織血液供應(yīng)是急性缺血性腦卒中治療的主要措施，但快速再灌注可對(duì)腦功能造成損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[3]，CIRI病理生理過程較為復(fù)雜，近年來發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在CIRI過程中發(fā)揮重要作用[4]。PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）和帕金蛋白（Parkin）在CIRI過程中可啟動(dòng)線粒體自噬，特異性清除受損線粒體，保護(hù)組織免受損傷[5]。故研究PINK1/Parkin在CIRI過程中的表達(dá)及調(diào)控，對(duì)缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。課題組在腦藏象理論指導(dǎo)下提出缺血中風(fēng)之榮氣虛滯病機(jī)體系[6-7]，認(rèn)為榮氣為一切精微物質(zhì)的總稱[8]，并將線粒體的生理、病理與榮氣理論相聯(lián)系，榮氣的物質(zhì)屬性相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的線粒體，而線粒體功能可體現(xiàn)榮氣的作用[9]?；跇s氣虛滯理論創(chuàng)制的活血榮絡(luò)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用10余年，療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，活血榮絡(luò)方能減輕CIRI，減少線粒體活性氧（ROS）產(chǎn)生，降低線粒體鈣超載等[10]，但其對(duì)CIRI過程中線粒體自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待明晰。因此，本研究通過建立CIRI大鼠模型，

以PINK1/Parkin通路為切入點(diǎn)，從線粒體自噬角度探討活血榮絡(luò)方干預(yù)CIRI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，12～15周齡，體質(zhì)量250～280 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%，通風(fēng)良好，晝夜交替光照。分籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（20201010-13）。

1.2 藥物及制備

活血榮絡(luò)方（雞血藤30 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，玄參10 g，黃精15 g，乳香10 g，沒藥10 g，川芎10 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張?jiān)Ｃ裰魅嗡帋熻b定符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定。上述飲片加10倍量水浸泡12 h，加熱回流2 h，過濾，殘?jiān)?倍量水，加熱回流1 h，過濾，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得活血榮絡(luò)方浸膏，無菌玻璃瓶分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時(shí)蒸餾水稀釋至濃度約1.17 g/mL。雷帕霉素（美國Selleck公司，貨號(hào)S1039），按說明書配制為0.5 mg/mL的溶液，-80 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

RIPA裂解液、JC-1線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)分別為P0013B、C2006，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、線粒體提取試劑盒，貨號(hào)分別為P0100、SM0020，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，貨號(hào)70-PQ0012，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，貨號(hào)CW0022S，北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；PINK1、Parkin、LC3B、p62、TOMM20、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，貨號(hào)分別為ab23707、ab77924、ab48394、ab91526、ab186735、ab6721、ab6789，英國Abcam公司；RT First Strand cDNA Synthesis Kit、RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX），貨號(hào)分別為G3330、G3013、G3321，武漢賽維爾生物科技有限公司。大鼠栓線（型號(hào)2636A4、2638A4，北京西濃科技有限公司），透射電子顯微鏡（型號(hào)Tecnai G2 Spirit BioTWIN，美國FEI公司），石蠟切片機(jī)（型號(hào)HM325，美國Thermo Scientific公司），顯微成像系統(tǒng)（型號(hào)BA410E，中國Motic公司），低溫高速離心機(jī)（型號(hào)Fresco17，美國Thermo Scientific公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀（型號(hào)ChemiDocTMXRS＋，美國Bio-Rad公司），小型垂直電泳槽（型號(hào)1658001，美國Bio-Rad公司），熒光定量PCR儀（型號(hào)C1000 TouchTMThermal Cycler，美國Bio-rad公司），超微量分光光度計(jì)（型號(hào)NanoDrop2000，美國Thermo Scientific公司），超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-1FD，蘇州蘇凈安泰），多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)Enspire，美國Perkinelmer公司），超純水儀（型號(hào)Milli-QIQ-7000，美國Millipore公司）。

1.4 造模、分組及給藥

40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、活血榮絡(luò)方（HXRLF）組和自噬激活劑（RAP）組，每組10只。模型組、HXRLF組、RAP組參考文獻(xiàn)[11]，采用大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注法制備CIRI大鼠模型：鈍性分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），從距ECA與ICA分叉部約4 mm處45°剪口進(jìn)栓線，插入栓線約18 mm梗阻右側(cè)大腦中動(dòng)脈，梗阻2 h后拔出栓線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅分離CCA、ECA、ICA，不插入栓線。采用Zea-Longa 5級(jí)評(píng)分法[11]對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分1～3分大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HXRLF組分別于造模前36、12 h及造模后12 h灌胃活血榮絡(luò)方藥液11.7 g/kg，假手術(shù)組、模型組、RAP組予等體積蒸餾水灌胃；RAP組于再灌注同時(shí)予雷帕霉素溶液1.5 mg/kg腹腔注射[12-14]，假手術(shù)組、模型組、HXRLF組予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24 h后，采用Zea-Longa 5級(jí)評(píng)分法[11]對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，分值越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。0分：活動(dòng)正常，提尾時(shí)兩前爪伸向地面，無神經(jīng)缺損癥狀；1分：提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；2分：提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：站立不穩(wěn)，爬行時(shí)向偏癱側(cè)跌倒；4分：有意識(shí)障礙，不能自發(fā)行走。

1.6 尼氏染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，以4%多聚甲醛溶液繼續(xù)充分灌注，斷頭，取缺血損傷側(cè)腦組織，于4%多聚甲醛中固定保存。腦組織經(jīng)脫水、透明、浸泡、石蠟包埋、冠狀位切片、脫蠟、復(fù)水、尼氏染色等步驟后，光學(xué)顯微鏡下觀察每組切片5個(gè)不同視野，顯微成像系統(tǒng)獲取皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元尼氏染色圖像，采用Image J軟件處理，觀察大鼠皮質(zhì)區(qū)完整神經(jīng)元數(shù)量[15]。

1.7 超微結(jié)構(gòu)觀察

大鼠斷頭取腦，冷凍臺(tái)上分離大鼠腦組織，取皮質(zhì)區(qū)約1 cm3組織于4%戊二醛中固定，電鏡室包埋、檢測(cè)。

1.8 線粒體膜電位檢測(cè)

取100 mg皮質(zhì)區(qū)腦組織，生理鹽水清洗，于2 mL EP管中剪碎，加入1 mL預(yù)冷的裂解緩沖液，冰上研磨20次；4 ℃梯度離心獲得線粒體沉淀，加入0.5 mL洗滌緩沖液重懸，再次梯度離心后獲得高純度線粒體沉淀；0.1 mL貯存緩沖液重懸；配制JC-1染色工作液和緩沖液，0.9 mL JC-1染色工作液中加入0.1 mL純化的線粒體，多功能酶標(biāo)儀激發(fā)波長514 nm、發(fā)射波長529 nm檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長585 nm、發(fā)射波長590 nm檢測(cè)紅色熒光強(qiáng)度，以紅綠熒光比值計(jì)算MMP。當(dāng)MMP較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，呈紅色熒光；當(dāng)MMP較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。

1.9 免疫組化檢測(cè)

腦組織石蠟包埋，切片（5 μm），常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、漂洗、封閉；分別滴加LC3B（1∶200）、p62（1∶200）、TOMM20（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，于顯微鏡（×400）下觀察。陽性染色為棕黃或棕褐色。隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image J軟件分別計(jì)算LC3B、p62、TOMM20陽性表達(dá)的平均光密度。

1.10 Western blot檢測(cè)

取皮質(zhì)區(qū)腦組織置于冰上，加入裂解液（裂解液∶PMSF＝100∶1）裂解，勻漿機(jī)充分研磨，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；各組取30 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉，加入LC3B（1∶1 000）、p62（1∶2 000）、TOMM20（1∶2 000）、PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜3次，10 min/次，加山羊抗兔（1∶8 000）、山羊抗小鼠（1∶8 000）二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后凝膠成像分析儀成像。使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)蛋白灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.11 RT-PCR檢測(cè)

取100 mg皮質(zhì)區(qū)腦組織，加入1 mL Trizol，勻漿機(jī)充分研磨，提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，熔解曲線60～95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃（循環(huán)40次）。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，神經(jīng)功能評(píng)分采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，其余指標(biāo)比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能的影響

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 只數(shù) 神經(jīng)功能評(píng)分假手術(shù)組 10 0模型組 10 2.80±0.63**HXRLF組 10 2.40±0.52##RAP組 10 2.20±0.63##

2.2 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響

完整神經(jīng)元經(jīng)尼氏染色后在光鏡下呈藍(lán)紫色，可見尼氏小體包圍，見圖1。假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尼氏小體數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明完整神經(jīng)元數(shù)量減少；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠尼氏小體數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明完整神經(jīng)元數(shù)量增加。見圖2。

圖1 各組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（尼氏染色，×400）

圖2 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)尼氏小體數(shù)目比較（±s，每組5只）

2.3 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體數(shù)目增多；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質(zhì)區(qū)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體數(shù)目明顯增多。見圖3。

圖3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)超微結(jié)構(gòu)（bars＝2 μm）

2.4 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)線粒體膜電位的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP比較（±s，每組5只）

2.5 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3B、p62、TOMM20蛋白表達(dá)的影響

免疫組化及Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3B、p62蛋白表達(dá)升高，TOMM20蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3B蛋白表達(dá)升高，p62、TOMM20蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5～圖8。

圖5 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)LC3B蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

圖8 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)p62、LC3B、TOMM20蛋白表達(dá)比較（±s，每組5只）

2.6 活血榮絡(luò)方對(duì)模型大鼠皮質(zhì)區(qū)PTEN誘導(dǎo)激酶1、帕金蛋白蛋白和mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖9、圖10。

圖6 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)p62蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

圖9 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin mRNA表達(dá)比較（±s，每組5只）

圖10 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin蛋白表達(dá)比較（±s，每組5只）

圖7 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)TOMM20蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

3 討論

腦梗死后局部腦缺血和再灌注引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可激活線粒體自噬。腦缺血發(fā)生后，腦血流急劇減少導(dǎo)致氧、糖缺乏，引起線粒體結(jié)構(gòu)異常，氧化磷酸化發(fā)生障礙；再灌注期間，由氧供恢復(fù)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是再灌注損傷的核心環(huán)節(jié)，而線粒體是其中的關(guān)鍵場(chǎng)所。CIRI過程中低氧、鈣超載等多種因素作用引起線粒體氧化磷酸化障礙、ROS生成增多、清除能力下降，導(dǎo)致ROS大量積累引發(fā)過度氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重線粒體損傷，而損傷的線粒體是加重CIRI的關(guān)鍵因素。因此，應(yīng)及時(shí)清除受損或功能失調(diào)的線粒體。但目前對(duì)于線粒體自噬在CIRI過程中的作用仍存在爭議。Wang等[16]研究表明，在CIRI大鼠模型中，激活線粒體自噬改善了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能損傷，減輕了神經(jīng)功能損傷。而Shi等[17]研究表明，抑制線粒體自噬，可抑制自噬性細(xì)胞死亡。因此，進(jìn)一步探究CIRI與線粒體自噬的關(guān)系，可為缺血性腦卒中的治療提供重要依據(jù)。

活血榮絡(luò)方基于榮氣虛滯理論創(chuàng)立而成，以雞血藤、石楠藤為君，生地黃、玄參、黃精為臣，佐以乳香、沒藥、川芎為使。全方雖有滋補(bǔ)肝腎之品，但不會(huì)滋膩妨礙氣血運(yùn)行；雖有辛溫微燥之品，亦不致傷陰加重陰虛，而能鼓動(dòng)氣血，促進(jìn)活血化瘀之功；其有陰有陽，陰陽相互制約，又互根互用，以達(dá)陰陽平衡之態(tài)，切合線粒體自噬異常之病機(jī)[9]。LC3作為自噬標(biāo)志蛋白，主要包括胞質(zhì)中的LC3Ⅰ和自噬小體膜上的LC3Ⅱ，二者可相互轉(zhuǎn)化，LC3Ⅱ被認(rèn)為是自噬形成的標(biāo)志分子。p62可充當(dāng)支架蛋白與LC3結(jié)合，進(jìn)而被溶酶體降解，其表達(dá)通常與自噬水平呈負(fù)相關(guān)，即自噬水平升高時(shí)，p62表達(dá)降低，反之表達(dá)升高；當(dāng)自噬小體與溶酶體形成受阻時(shí)，自噬小體降解受阻，LC3Ⅱ和p62會(huì)累積，可能出現(xiàn)p62與LC3Ⅱ表達(dá)同時(shí)升高[18-19]。線粒體膜蛋白TOMM20可反映線粒體含量變化，且在線粒體自噬激活時(shí)表達(dá)下調(diào)[20]。本研究結(jié)果表明，HXRLF組和RAP組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有所改善，自噬小體數(shù)量增加，MMP升高，p62、TOMM20蛋白表達(dá)降低，LC3B蛋白表達(dá)升高，提示活血榮絡(luò)方可能通過激活線粒體自噬以保護(hù)受損腦組織。

Wu等[21]研究表明，激活PINK1/Parkin通路可激活線粒體自噬，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。PINK1是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在線粒體外膜上募集OPTN、CALCOCO2/NDP52等自噬受體，而OPTN可與SQSTM1/p62形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)選擇性自噬。Parkin是一種E3泛素連接酶，位于細(xì)胞質(zhì)中，在線粒體降解中起重要作用，通常Parkin募集至受損線粒體需PINK1介導(dǎo)，其在線粒體外膜上積累以對(duì)線粒體損害作出響應(yīng)，最終通過p62蛋白與LC3蛋白結(jié)合，使線粒體降解。本研究結(jié)果表明，活血榮絡(luò)方和雷帕霉素均可上調(diào)PINK1、Parkin蛋白及mRNA水平，激活線粒體自噬。

綜上，活血榮絡(luò)方可能通過激活PINK1/Parkin信號(hào)通路，激活線粒體自噬，減輕CIRI，本研究可為闡明活血榮絡(luò)方干預(yù)CIRI的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。