丹參通絡解毒湯聯(lián)合內(nèi)皮祖細胞對心肌缺血再灌注損傷大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

李彩云，肖青，李鑫輝，陳聰，杜建芳，王靜雯，陳欣

湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是威脅人類生命健康的主要疾病之一，早期恢復缺血心肌再灌注可顯著提高患者存活率，但易引發(fā)心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI）[1-2]，因此研發(fā)MIRI的靶點藥物對防治AMI具有重要意義。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）具有較強的促血管生成和修復血管內(nèi)皮功能[3]。Morishita等[4]研究表明，循環(huán)EPCs具有分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力，在心肌缺血和血管損傷時，EPCs可誘導血管生成和促進血管修復。中藥干預可調控EPCs歸巢、增殖及分化，并可增強其保護心肌的作用[5]。Li等[6]研究表明，丹酚酸A能增加EPCs數(shù)量，提高EPCs遷移能力，促進缺血心肌組織血管新生。另有研究表明，PI3K/Akt信號通路參與了MIRI引起的炎癥和凋亡[7]。前期臨床研究顯示，丹參通絡解毒湯可治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛[8]，但有關丹參通絡解毒湯保護心肌的作用機制尚未完全明了。本研究從PI3K/Akt信號通路觀察丹參通絡解毒湯聯(lián)合EPCs對MIRI模型大鼠心肌損傷的影響，探討其可能的作用機制，為研發(fā)MIRI的靶點藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

丹參通絡解毒湯（丹參15 g，玄參15 g，當歸10 g，梔子15 g，黃連6 g，黃芪30 g），飲片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，常規(guī)煎煮、濃縮至含原藥材3.5 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物

清潔級SD雄性大鼠，3～4周齡20只，體質量90～110 g；10～12周齡60只，體質量180～220 g，湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%，明暗12 h循環(huán)，普通詞料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.3 主要試劑與儀器

內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基（EBM-2，美國Lonza公司，貨號CC3156），LY294002（美國Sigma公司，貨號S1105），p-PI3K一抗（美國Sigma公司，貨號SAB1300436），p-Akt一抗（美國CST公司，貨號AB1019），F(xiàn)ITC標記兔抗大鼠CD133（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號Abp52923），PE標記山羊抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2，美國Epitomics公司，貨號2296-1）。RM-6280型生理信號采集系統(tǒng)（成都儀器廠），HZQ-QB型恒溫振蕩搖床（蘇州威爾實驗用品有限公司），GE-100型凝膠電泳儀（杭州大和熱磁電子有限公司），IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），DH-140型小動物呼吸機（上海奧爾特生物科技公司）。

1.4 內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)及鑒定

取3～4周齡SD大鼠，脛骨及股骨骨髓腔中采集細胞，密度梯度離心法及差數(shù)貼壁法分離EPCs，鏡下觀察細胞生長情況。免疫熒光染色鑒定EPCs，取培養(yǎng)第10～14日細胞，接種至24孔板，4%多聚甲醛固定爬片，加入FITC標記兔抗大鼠CD133和PE標記山羊抗大鼠VEGFR-2孵育過夜，滴加二抗孵育，DAPI染細胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 分組、造模及給藥

將10～12周齡SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、EPCs組、丹參通絡解毒湯組（中藥組）、丹參通絡解毒湯＋EPCs組（聯(lián)合組）、丹參通絡解毒湯＋EPCs＋PI3K阻斷劑組（阻斷劑組），每組10只。參考文獻[9]方法，采用左冠狀動脈前降支結扎法制備MIRI大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉并固定，氣管切開處接小動物呼吸機，暴露胸腔，在左心耳根部1～2 mm處進針，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，QRS波群改變，J點偏移超過0.1 mV，缺血區(qū)心肌顏色變白；結扎30 min后松開結扎線實現(xiàn)再灌注，ST段出現(xiàn)回落，可見梗死區(qū)心肌充血，表明再灌注成功，關閉胸腔。假手術組只穿線不結扎。EPCs組、聯(lián)合組和阻斷劑組大鼠術后尾靜脈注射含1.0×106個EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen Vector的PBS 1 mL，其余各組大鼠尾靜脈注射1 mL PBS；阻斷劑組大鼠尾靜脈注射LY294002稀釋液（0.3 mg/kg）[10]，中藥組、聯(lián)合組和阻斷劑組大鼠術后每日予丹參通絡解毒湯藥液灌胃，參照人與大鼠體表面積換算給藥劑量，相當于原藥材18.125 g/kg，給藥體積10 mL/kg，其余各組予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。

1.6 心功能檢測

切開大鼠氣管，接呼吸機輔助通氣后，動脈夾阻斷右頸總動脈血流，并在其上剪一“V”字切口，將其充滿肝素水，一端連接RM-6280型生理信號采集系統(tǒng)PE-50導管，插管至左心室，監(jiān)測左心室形成壓（LVDP）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室射血分數(shù)（LVEF）。

1.7 病理觀察

取大鼠心肌組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（4 μm），放入二甲苯中浸泡，行HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。

1.8 Western blot檢測

取大鼠心肌組織，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE后轉膜至PVDF膜，加入稀釋的p-PI3K、p-Akt一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3 000），37 ℃孵育1 h，化學發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image Pro Plus 6.0軟件分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算各條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布及方差齊性用方差分析，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Games-Howell檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 內(nèi)皮祖細胞鑒定

對分離培養(yǎng)的細胞進行鑒定，倒置熒光顯微鏡下觀察VEGFR-2、CD133陽性表達，表明分離培養(yǎng)的細胞為EPCs。見圖1。

圖1 EPCs VEGFR-2和CD133陽性表達（免疫熒光染色，×100）

2.2 丹參通絡解毒湯和內(nèi)皮祖細胞對模型大鼠心功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，EPCs組、中藥組、聯(lián)合組及阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與EPCs組比較，中藥組、聯(lián)合組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與中藥組比較，聯(lián)合組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.01），阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與聯(lián)合組比較，阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠LVDP、LVSP和LVEF比較（±s）

表1 各組大鼠LVDP、LVSP和LVEF比較（±s）

注：1 mm Hg＝0.133 kPa；與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與EPCs組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01；與聯(lián)合組比較，★★P＜0.01

組別 只數(shù) LVDP/mm Hg LVSP/mm Hg LVEF/%假手術組 10 80.03±3.54 125.50±3.31 85.75±2.21模型組 10 50.50±3.57** 92.30±3.43** 41.49±3.47**EPCs組 10 62.61±3.59## 105.94±4.45## 65.86±2.97##中藥組 10 65.90±2.96##△ 109.96±4.40##△ 68.75±2.49##△聯(lián)合組 10 72.67±3.79##△△▲▲ 115.90±2.74##△△▲▲ 75.56±3.46##△△▲▲阻斷劑組 10 53.68±3.53#△△▲▲★★ 96.03±2.78#△△▲▲★★ 44.58±2.44#△△▲▲★★

2.3 丹參通絡解毒湯和內(nèi)皮祖細胞對模型大鼠心肌組織形態(tài)的影響

假手術組大鼠心肌纖維排列較整齊，無明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、腫脹，心肌組織間質有大量炎性細胞浸潤，且可見部分心肌細胞壞死；EPCs組大鼠心肌纖維排列較模型組整齊，心肌細胞壞死程度減輕；中藥組大鼠心肌纖維排列較EPCs組整齊，可見少量炎性細胞浸潤；聯(lián)合組大鼠心肌纖維排列較整齊，炎性細胞浸潤較EPCs組及中藥組有所改善；阻斷劑組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌纖維腫脹及炎性細胞浸潤較明顯，并可見部分心肌細胞變性及壞死。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.4 丹參通絡解毒湯和內(nèi)皮祖細胞對模型大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，EPCs組、中藥組、聯(lián)合組及阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與EPCs組比較，中藥組及聯(lián)合組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與中藥組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.01），阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與聯(lián)合組比較，阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。見表2、圖3。

表2 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組相比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與EPCs組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01；與聯(lián)合組比較，★★P＜0.01

組別 只數(shù) p-PI3K/GAPDH p-Akt/GAPDH假手術組 10 0.66±0.04 0.04±0.02模型組 10 0.89±0.04** 0.09±0.02**EPCs組 10 1.01±0.02## 0.17±0.02##中藥組 10 1.05±0.03##△ 0.20±0.02##△聯(lián)合組 10 1.20±0.03##△△▲▲ 0.25±0.03##△△▲▲阻斷劑組 10 0.92±0.04#△△▲▲★★ 0.12±0.03#△△▲▲★★

圖3 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前臨床對AMI多采用介入、抗凝治療，但無法調節(jié)梗死后心肌的再生和修復能力，因此效果并不理想。EPCs是骨髓和外周血的干細胞，具有較強的促血管生成和修復血管內(nèi)皮功能[11]。中藥可通過調控EPCs促進心血管疾病恢復。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能改善體外培養(yǎng)的人EPCs生物學功能，具有調節(jié)EPCs介導的血管新生潛能[12]，黃芪多糖可通過上調血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及相關受體的表達保護EPCs[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，EPCs組較模型組心肌纖維排列整齊，心肌細胞壞死程度減輕，LVDP、LVSP、LVEF明顯升高（P＜0.01），提示EPCs移植可改善MIRI病理形態(tài)，提高心功能，保護心肌組織。EPCs聯(lián)合丹參通絡解毒湯灌胃治療后，大鼠心肌纖維較單用EPCs或丹參通絡解毒湯排列整齊，心功能明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明丹參通絡解毒湯能促進EPCs改善MIRI病理形態(tài)及心功能，保護心肌組織。

PI3K/Akt信號通路是再灌注損傷補救激酶信號通路之一，在MIRI中有重要作用。PI3K可被細胞外信號通路受體激活，活化的PI3K以磷酸化形式存在，可進一步激活二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3可將細胞外信號傳導至下游Akt，p-Akt具有保護MIRI的作用[14]。馬陽等[15]研究表明，Id-1和E2-2協(xié)同對PI3K/Akt信號通路起調控作用，進而影響EPCs的增殖。吳海衛(wèi)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素能降低EPCs凋亡率，其作用依賴PI3K/Akt信號通路。本研究結果顯示，EPCs聯(lián)合丹參通絡解毒湯灌胃治療后，大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達較單用EPCs或丹參通絡解毒湯明顯升高（P＜0.01），采用PI3K阻斷劑后，p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01），提示丹參通絡解毒湯可促進EPCs保護心肌組織，可能與調節(jié)PI3K/Akt信號通路有關。

MIRI可歸屬中醫(yī)學“胸痹”“心悸”等范疇?；稹⒍?、瘀在胸痹發(fā)病中有重要作用，火熱積聚成毒，損傷心營，灼傷血脈，日久成瘀，導致“火”“毒”“瘀”積聚于心脈，引發(fā)胸痹[17]。MIRI從血瘀向毒證轉化時，增加了急性心血管事件的發(fā)生，治療當用活血解毒法[18]。丹參通絡解毒湯由丹參、玄參、當歸、黃連、梔子、黃芪組成，具有活血通絡、清營解毒、益氣養(yǎng)陰功效。本實驗雖未完全闡明丹參通絡解毒湯促進EPCs保護MIRI的作用機制，但結果提示，該方干預EPCs保護MIRI具有優(yōu)勢互補、協(xié)同增效的特點，推測該方還可能在EPCs動員、歸巢、增殖和分化中起多靶點、多效應的調節(jié)作用，有待今后進一步研究。

綜上，丹參通絡解毒湯聯(lián)合EPCs移植可顯著保護MIRI，其機制可能與調控PI3K/Akt信號通路有關。本研究結果可為中醫(yī)藥干預干細胞移植、防治AMI提供實驗依據(jù)。