利用InDel分子標記輔助選育辣椒抗黃瓜花葉病毒病種質

郭廣君 朱雪梅 潘寶貴 刁衛(wèi)平 劉金兵 高長洲 王述彬

摘要：? 黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）是危害中國辣椒生產的第一大病毒，創(chuàng)制抗性育種材料、培育抗性品種是防治CMV最有效的方法。以高抗CMV材料PBC688為母本，與感病甜椒材料G29為父本雜交，通過連續(xù)自交獲得F? 6 代自交系。利用與抗性基因 ?qCmr2.1? 緊密連鎖的3個InDel分子標記，結合人工接種鑒定和農藝性狀調查對109個株系進行篩選。分子標記鑒定結果顯示，攜帶純合抗性片段的株系有28個，攜帶純合感病片段的株系有65個，攜帶雜合片段的株系有16個，雜合率為14.7%。農藝性狀調查結果顯示，大部分攜帶? qCmr2.1? 基因的自交系果實較小，首花節(jié)位高，花期和成熟期顯著晚于感病材料G29。篩選到1份高抗CMV且農藝性狀優(yōu)良的育種材料H? 6 -223，人工接種鑒定結果顯示，21個純合抗病型對CMV表現為高抗、抗;在14個純合感病型中，13個株系表現為感病，1個株系表現為中抗;9個雜合型株系的抗病性出現分離，表現為抗、中抗;3個在分子標記間出現重組的自交系中，H? 6 -223表現為高抗，另外2個表現為中抗。由研究結果可以看出，3個InDel分子標記可以輔助創(chuàng)制辣椒抗CMV種質，創(chuàng)制的高抗CMV且農藝性狀優(yōu)良的種質H? 6 -223可進一步用于辣椒抗CMV育種。

關鍵詞：? 辣椒; 黃瓜花葉病毒; 分子標記輔助選育

中圖分類號：? S436.418.1 +2??? 文獻標識碼： A? ??文章編號：? 1000-4440（2021）05-1251-11

Innovation of pepper germplasm resource with resistance to cucumber mosaic virus by InDel molecular marker assisted selection

GUO Guang-jun? 1 ， ZHU Xue-mei? 1，2 ， PAN Bao-gui? 1 ， DIAO Wei-ping? 1 ， LIU Jin-bing? 1 ， GAO Chang-zhou? 1 ，WANG Shu-bin? 1

（1.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China; 2.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：? Cucumber mosaic virus （CMV） is the most serious virus threatening the production of pepper in China. Innovation of pepper germplasm resources and breeding varieties with resistance to CMV is the most effective method to prevent CMV. Using the resistant material PBC688 as female parent and the susceptible sweet pepper G29 as male parent， F? 6 ?inbred lines were obtained through successive inbreeding in this study. Totally 109 F? 6 ?inbred lines were identified by three InDel markers tightly linking to?? qCmr2.1? . The pepper germplasms with resistance to CMV were chosen by combining with the artificial inoculation identification and the investigation of agronomic traits. The results of molecular marker identification showed that there were 28 lines carrying homozygous resistant fragment， 65 lines carrying homozygous susceptible fragment， and 16 lines carrying heterozygous fragments. The heterozygous rate was 14.7%. The investigation results of agronomic traits indicated that most inbred lines carrying?? qCmr2.1?? gene had smaller fruits， higher node position of the first flower， and significantly later flowering and ripening than susceptible material G29. A breeding material H? 6 -223 with high resistance to CMV and excellent agronomic characters was screened. The results of artificial inoculation identification indicated that 21 disease-resistant materials with homozygous genotypes showed high resistance or resistance to CMV. The 13 lines with homozygous susceptible fragment were susceptible to CMV and one line was middle resistance to CMV. The resistance to CMV of nine lines with heterozygous genotypes was separated proportionally. Among the three inbred lines with recombinant molecular markers， H? 6 -223 showed high resistance and the other two showed moderate resistance. In general， we established InDel molecular marker assisted selection system for pepper resistance to CMV， and innovated one germplasm H? 6 -223 with resistance gene?? qCmr2.1?? and excellent agronomic traits， which could be applied in breeding for resistance to CMV in pepper.

Key words：? pepper; cucumber mosaic virus; molecular marker assisted selection

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是世界十大植物病毒之一，可以侵染超過100個科的 1 200 種植物? [1] 。劉勇等? [2] 調查發(fā)現，從辣椒中檢出的33種病毒中，CMV的檢出率高達20.29%，超過煙草花葉病毒的檢出率（14.64%）而成為危害中國辣椒生產的第一大優(yōu)勢病毒。在辣椒生產過程中，CMV不僅影響產量，而且危害果實品質，而培育抗性品種是防治CMV最經濟、最有效的方法，也是中國辣椒抗病育種的主要目標。

國內外育種家通過抗性轉育，已經育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品種，但高抗CMV的品種稀缺? [3] 。由于很多新CMV病毒株系可突破原有抗性，導致現有品種已無法滿足產業(yè)需求? [4] 。鑒定和轉育新的抗CMV基因或將多個抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗品種稀缺最有效的方法。目前，人們已經從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關的數量性狀座位（Quantitative trait locus， QTL）和基因，除單顯性基因? Cmr1? 外，其他抗性基因均未得到轉育應用? [5] 。

傳統育種技術通過雜交和回交進行抗性基因轉育，通過田間鑒定或人工接種鑒定進行抗性單株的篩選，耗時長、效率低?，F代育種技術可以通過分子標記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）技術實現抗性基因的快速積累? [6-7] 。近年來，高通量基因分型結合新一代測序技術可快速檢測與抗病基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性標記，大大縮短了高密度圖譜構建、QTL位點分析和候選基因鑒定所需的時間? [8-10] 。隨著分子標記開發(fā)技術的完善和標記類型的增多，越來越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技術在辣椒育種中的應用愈發(fā)廣泛。Barka等? [11] 對辣椒上真菌、細菌、病毒和線蟲等引起的相關病害的抗性基因連鎖標記開發(fā)和抗性基因克隆進行了總結分析。李寧等? [12] 根據已有文獻公布的抗病分子標記對209份辣椒資源進行了抗病基因檢測，明確了供試種質的抗性基因。中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所利用種間雜交、回交和分子標記輔助篩選技術創(chuàng)制出辣椒抗番茄斑萎病病毒的育種材料0516Tsw? [13] ，育成了首個抗番茄斑萎病病毒（TSWV）的甜椒品種中椒115號? [14] 。綜上所述，采用分子標記輔助篩選技術能夠快速鑒定種質資源的抗性基因，分子標記輔助回交可以提高抗性基因轉育和抗病育種材料的創(chuàng)制效率，加快辣椒抗病育種的進程。

本課題組前期在辣椒抗源材料灌木狀辣椒PBC688（ Capsicum frutescens ?cv. PBC688）的2號染色體上定位到1個抗CMV的主效QTL（? qCmr2.1? ），并開發(fā)出3個與? qCmr2.1? 緊密連鎖的InDel分子標記? [15] 。抗源材料PBC688的果實極小，果實呈橢圓形，單果質量僅為1.0 g左右，在江蘇地區(qū)側枝多、首花節(jié)位高，花期和成熟期晚，無法直接用于抗CMV育種。感病材料 C.annuum ?cv. G29坐果性好，果形為長燈籠形，單果質量約為50 g，首花節(jié)位低，花期和成熟期早，是一個優(yōu)良的甜椒育種材料（圖1）。據此，利用PBC688與G29進行種間雜交，將抗性基因? qCmr2.1? 進行遺傳轉育，創(chuàng)制新的高抗CMV且農藝性狀優(yōu)良的種質材料。本研究利用上述3個InDel分子標記對創(chuàng)制的F? 6 代自交系進行輔助篩選，結合人工接種鑒定和農藝性狀調查，檢驗抗性基因的轉育效率，以期篩選高抗CMV的育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母本材料為高抗CMV的 C.frutencens ?cv.PBC688，父本材料為高感CMV的甜椒材料G29。2013年通過父母本種間雜交獲得F? 1 代雜種（圖1），連續(xù)自交5代，2020年6月獲得109個F? 6 代高代自交系材料。每個自交系選取2株代表1個自交系的遺傳信息，單株留種作為F? 7 代，用于抗CMV效果的人工接種鑒定。

1.2 試驗方法

2020年2-7月在江蘇省農業(yè)科學院六合動物科學基地對F? 6 代株系進行農藝性狀調查和留種;4-6月在江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所實驗室對F? 6 代株系進行分子標記檢測;8-10月在實驗室用部分F? 7 代株系進行抗CMV效果的人工接種鑒定。

1.2.1 DNA提取? 基因組DAN提取使用DNA提取試劑盒（Cat#DP3112，北京百泰克生物技術有限公司產品），按照說明書要求逐步提取DNA。使用1%瓊脂糖凝膠和Nano Drop One （Thermo Scientific）檢測DNA的質量和質量濃度，調整DNA的質量濃度為40 ?ng/μl 。

1.2.2 InDel分子標記輔助篩選抗CMV基因? qCmr2.1??? 用于抗CMV基因輔助篩選的3對InDel分子標記的引物分別為InDel- ?2-134? -F（5′-TGCTTCAGTTGAGTTGTCCA-3′）+InDel- ?2-134? -R（5′-TAAATCCCCTTGTGGTGGCT-3′）、InDel- ?2-140? -F（5′-GGTTGGTTAGCATGGGTGTG-3′）+InDel- ?2-140? -R（5′-CGAAACCGAACCGTTAAAGAC-3′）、InDel- ?2-151? -F（5′-ACCCACGACTTAAACTCAAAACT-3′）+InDel- ?2-151? -R（5′-TCAAGAGAGAAATAGTGATGCCA-3′）。

PCR擴增：擴增體系為20.0 μl，包含2.0 μl DNA模板、10.0 μl ?2× TSINGKEMaster Mix、各0.4 μl上下游引物，補充ddH? 2 O至總體積為20.0 μl。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將擴增產物于4 ℃保存。PCR產物檢測：用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR擴增產物。電泳結束后，用銀染法染色，觀察并記錄擴增結果。

1.2.3 F? 6 代自交系果實性狀的調查? 參照《辣椒種質資源描述規(guī)范和數據標準》? [16] ?對F? 6 代自交系的果實性狀進行調查。

1.2.4 人工接種CMV鑒定F? 7 代自交系對CMV的抗性? 2020年7月選擇父母本材料和47個F? 7 代自交系育苗，待4葉1心時用于人工接種CMV。接種方法參照姚敏等? [17] 建立的CMV侵染性克隆法，在農桿菌的介導下進行侵染，并根據實際需求進行改進。構建在pCB301-2×35S-MCS-HDV? RZ -NOS植物表達載體上的CMV侵染性克隆由南京農業(yè)大學陶小榮老師提供。高抗CMV的父本PBC688為抗性對照，易感CMV的母本G29為感病對照。每個F? 7 代株系人工接種25株，5株接種蒸餾水，5株接種空白載體，15株接種CMV侵染性克隆。

2 結果與分析

2.1 InDel分子標記輔助篩選抗CMV基因? qCmr2.1

本研究利用3個與抗CMV基因? qCmr2.1? 緊密連鎖的InDel分子標記對109個F? 6 代自交系進行抗性基因篩選。InDel- ?2-134? 和InDel- ?2-151? 為側翼分子標記，InDel- ?2-140? 為中間分子標記，InDel- ?2-140? 與抗性基因連鎖最為緊密。由圖2可以看出，InDel- ?2-134? 在部分株系的擴增條帶為230 bp，與高抗CMV材料PBC688一致;在部分株系的擴增條帶為211 bp，與感CMV材料G29一致;在部分株系的擴增條帶為雜合狀態(tài)。InDel- ?2-140? 在部分株系的擴增條帶為168 bp，與PBC688一致;在部分株系的擴增條帶與G29一致，為178 bp;在部分株系為雜合型。InDel- ?2-151? 在抗CMV株系中的擴增條帶為100 bp，在感CMV株系中的擴增條帶為107 bp;在部分株系表現為雜合。通過統計分析發(fā)現，在109個自交系中，28個自交系的擴增條帶與高抗CMV材料PBC688完全一致;65個自交系的擴增條帶與感CMV材料G29完全一致;16個自交系表現為雜合型。在16個雜合自交系中，標記間出現重組的自交系有3個。自交系H? 6 -92、H? 6 -210中間標記為雜合型，側翼標記分別為純合感病型、純合抗病型;自交系H? 6 -223側翼標記為雜合型，中間標記為純合抗病型（表1）。上述結果顯示，經過1次種間雜交和5次自交后，3個標記的純合率達到85.3%，其中感病自交系的純合率為59.6%，抗病自交系的純合率為25.7%，雜合率為14.7%，重組率為2.8%。

2.2 F? 6 高代自交系的果實性狀

由于F? 6 代自交系的父母本分別來自 C.frutencens 和 C.annuum ，種間雜交導致后代群體存在不育材料，所以F? 6 代群體只有109個自交系。農藝性狀調查結果顯示，109個自交系的果形分離顯著，包括與父本類似的橢圓形小果、與母本相似的長燈籠形甜椒以及父母本中間類型的錐形、羊角形、指形等多種類型（圖3）。單果質量為 0.63～ 52.23 g，部分材料表現出超親遺傳，其中3個自交系的單果質量小于父本材料，6個自交系的單果質量超過母本材料。結合分子標記鑒定結果分析發(fā)現，攜帶純合或雜合抗病基因的自交系材料單果質量偏小，均未超過20.00 g。其中H? 6 -243為純合抗CMV材料，呈長燈籠形，單果質量為19.83 g，約為母本材料的50%。17個形狀為長燈籠形且單果質量超過20.00 g的自交系均攜帶純合感病基因（表1）。在3個標記間發(fā)生重組的自交系材料H? 6 -92的果實與母本類似，呈長燈籠形，單果質量為7.00 g;H? 6 -210果實呈短錐形，單果質量僅為4.00 g;H? 6 -223果實呈羊角形，單果質量為18.77 g，果實縱徑為8.93，果實橫徑為3.27 cm，首花節(jié)位低，連續(xù)坐果率高，整株果實數量為63個（圖4）。綜上可見，H? 6 -223是為數不多的攜帶抗性基因且農藝性狀優(yōu)良的材料，可進一步用于抗CMV育種。

2.3 F? 7 代自交系對CMV的抗性

InDel- ?2-134? 、InDel- ?2-140? 和InDel- ?2-151? 這3個分子標記，本研究選擇的47個F? 7 代自交系包括21個與抗病材料PBC688一致的自交系、14個與感病材料G29一致的自交系、9個雜合狀態(tài)自交系、3個在InDel分子標記間發(fā)生重組的自交系。由表2可以看出，21個與PBC688的3個InDel分子標記一致的自交系的平均病情指數為8.18，其中5個株系表現為高抗，16個株系表現為抗;14個與G29 3個InDel分子標記一致的自交系的平均病情指數為49.95，其中13個株系表現為感病，1個株系表現為中抗;9個雜合自交系的平均病情指數為21.07，其中4個株系表現為抗，5個株系表現為中抗，同一株系內不同單株對CMV的抗性出現分離;3個分子標記間發(fā)生重組的自交系的平均病情指數為20.25，其中2個株系表現為中抗，1個表現為高抗。高抗株系H? 6 -223在InDel- ?2-140? 標記處的基因型與抗性材料PBC688一致，兩翼標記為雜合狀態(tài)，其H? 7 代的病情指數為1.48。由以上結果可以看出，人工接種鑒定結果與分子標記鑒定結果具有很高的一致性。結合分子標記鑒定、果實性狀調查和人工接種鑒定結果可以看出，H? 6 -223同時具有高抗CMV和優(yōu)良農藝性狀，是一份優(yōu)異的抗CMV育種材料。

3 討 論

黃瓜花葉病毒為世界十大植物病毒之一，可侵染果樹、蔬菜和觀賞植物等100多個科的1 200多種植物，其中茄科蔬菜，特別是辣椒、番茄極易受CMV侵染? [18] 。在中國，抗CMV育種一直是辣椒抗病育種的主要目標之一，但CMV病毒株系類型多、變異快、重組頻繁、傳播媒介多、寄主范圍廣，而高抗CMV辣椒資源稀缺、抗性機制復雜、抗性基因在轉育過程中易丟失，以上原因導致目前生產上推廣的辣椒品種不能滿足抗CMV的需求? [3] 。鑒定和應用新的抗CMV基因或將多個抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗CMV品種稀缺最有效的方法? [19] 。

目前，人們已經從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關的QTL和基因，除顯性基因? Cmr1? 外，其他抗性基因均未得到轉育應用，根本原因在于抗性基因和抗性機制尚不清晰? [3] 。筆者所在課題組在 C. frutescens ?cv. PBC688的2號染色體上定位到1個抗CMV的主效QTL（? qCmr2.1? ），預測的候選基因? Ca02g19570? 與擬南芥中抗CMV基因? RCY1? 同屬于NBS-LRR家族基因，經基因表達模式分析和病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術驗證，明確了? Ca02g19570? 是辣椒抗CMV的抗性基因，與其緊密連鎖的InDel標記可用于辣椒抗CMV的輔助篩選? [15， 20] 。

本研究通過3個與? qCmr2.1? 緊密連鎖的InDel標記分析顯示，F? 6 代自交系3個InDel分子標記的純合率為85.3%，其中感病自交系的純合率為59.6%，抗病自交系的純合率為25.7%，雜合率為14.7%。這一結果說明，經過1代種間雜交和5代自交，F? 6 代自交系材料不能達到完全純合的狀態(tài)。王立浩等? [13] 研究發(fā)現，經過1次雜交和5次回交，果實的大小和單果質量快速提高，但方差較大，說明群體內基因尚未純合。郭聚領等? [21] 利用重測序技術和生物信息學相結合的方法對甘藍型油菜BC? 3 F? 3 世代中選單株進行背景分析發(fā)現，背景回復率不能完全純合，中選單株的背景回復率較高的2個單株的背景回復率分別為97.93%和98.18%。前期未經過分子標記輔助篩選，F? 6 代純合抗病材料比例顯著低于純合感病材料，筆者猜測其原因可能是父母本分別為 C. frutencens 和 C. annuum ，種間雜交導致后代群體存在不育材料，而抗性基因與不良農藝性狀連鎖遺傳，導致攜帶抗性基因的株系不育率更高。盧倩倩等? [22] 利用白菜抗根腫病基因連鎖標記對F? 2 代單株進行分子標記輔助篩選，同樣發(fā)現攜帶純合抗病基因的植株偏少。

109個自交系中在3個分子標記間發(fā)生重組的自交系為3個，重組率為2.8%，說明在抗性基因轉育過程中，基因間重組效率低，會導致不良農藝性狀的連鎖累贅。在本研究中，通過農藝性狀調查發(fā)現，攜帶純合或雜合抗病基因的自交系果實較小，首花節(jié)位高，花期、成熟期顯著晚于母本材料。研究還發(fā)現，首花節(jié)位、花期及成熟期這3個與果實成熟相關的性狀有6個顯著關聯的單核苷酸多態(tài)性（SNP）定位到了2號染色體的 154 815 667～? 155 002 754 ?bp區(qū)域? [23] 。本研究所用3個分子標記的物理區(qū)間為 152 845 012～? 153 206 189 ?bp，與果實成熟相關性狀的定位區(qū)間毗鄰，它們之間很有可能連鎖遺傳，最終導致首花節(jié)位高以及花期和成熟期晚。祝光濤? [24] 通過比較栽培種番茄和野生番茄基因組的相似性發(fā)現，抗病基因在栽培種中的應用導致較大外源DNA片段的滲入，而這些長DNA片段在栽培種中的滲入可能會產生嚴重的連鎖累贅。在小麥抗赤霉病育種過程中，豐產性與赤霉病抗性之間的矛盾是小麥育種的世界性難題? [25-27] 。綜上，在抗病基因轉育過程中需要綜合利用分子標記輔助選擇和常規(guī)育種策略，從而創(chuàng)制出抗病性強、綜合農藝性狀優(yōu)良的育種材料，才能更好地推進抗病品種選育。

本研究通過人工接種CMV鑒定F? 7 代自交系對CMV的抗性顯示，3個InDel分子標記與感病材料G29一致的14個自交系的平均病情指數為49.95，其中13個株系表現為感病，1個株系表現為中抗;3個InDel分子標記與抗病材料PBC688一致的21個自交系的平均病情指數為8.18，其中高抗株系5個，抗病株系16個;而雜合基因型的株系單株抗性出現了分離，當自交系的中間分子標記InDel- ?2-140? 與抗病材料PBC688一致時，后代單株均表現出抗病。以上結果表明，人工接種鑒定結果與分子標記鑒定結果基本吻合，中間分子標記InDel- ?2-140? 與抗性基因? qCmr2.1? 的連鎖最為緊密，篩選準確度最高。蘇曉梅? [28] 通過基因型分析發(fā)現，F? 2 群體中具有純合抗病基因型的為12株，而人工選育的單株中具有純合抗病基因型的為3株，這一結果說明，傳統的田間選擇方法降低了目標基因（純合抗病）入選率，而利用分子標記篩選可以防止目標基因丟失。郭聚領等? [21] 利用與油酸含量性狀基因連鎖的InDel分子標記輔助選擇高油酸含量的甘藍型油菜，結果顯示，改良材料的種子油酸含量明顯高于輪回親本且差異極顯著，說明利用分子標記輔助選擇進行油酸含量改良是可行的。以上研究結果表明，利用分子標記進行目的基因的輔助選擇效率更高，可以有效地應用于植物育種。

綜上所述，本研究以高抗CMV種質PBC688為母本和感病甜椒品種G29為父本，通過種間雜交和連續(xù)自交獲得了F? 6 代自交系，輔以InDel分子標記篩選結合農藝性狀調查和人工接種鑒定，建立了辣椒抗CMV分子標記輔助篩選體系，并創(chuàng)制出1份高抗CMV且農藝性狀優(yōu)良的自交系材料H? 6 -223，可用于后續(xù)的辣椒抗CMV育種。

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（責任編輯：徐 艷）