一步法快速構(gòu)建長(zhǎng)片段RNAi發(fā)夾的載體

劉廷利 郭冬姝 姚瑤 張保龍

摘要：? 利用RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)可以進(jìn)行基因功能研究以及作物遺傳改良，但常規(guī)構(gòu)建RNAi載體方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究報(bào)道了一種基于 USER 酶一步法快速構(gòu)建RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體2301/RNAi/OS及其應(yīng)用方法，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。與已報(bào)道的利用酶切連接、Gateway兼容的同源重組或PCR直接連接等構(gòu)建RNAi載體相比，該載體不需要酶切片段，片段擴(kuò)增完成后即可與制備好的線性化載體進(jìn)行反應(yīng)，縮短操作流程和時(shí)間，提高成功率;該載體對(duì)插入片段的酶切位點(diǎn)和長(zhǎng)度沒(méi)有要求，理論上任何位置和長(zhǎng)度的片段均可進(jìn)入2301/RNAi/OS載體中，尤其是長(zhǎng)片段RNAi的構(gòu)建。本試驗(yàn)以本氏煙（ Nicotiana ??benthamiana ） PDS ?（ Phytoene desaturase ） 基因?yàn)槔棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系驗(yàn)證了該RNAi能夠在植物體內(nèi)有效地實(shí)現(xiàn)基因沉默。該載體以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ NPTII ）作為篩選標(biāo)記基因，可以利用卡那霉素（Kanamycin）和G418（Geneticin）等抗生素篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，適合單子葉和雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：? RNA干擾（RNAi）; ?USER 酶; 一步法; 載體構(gòu)建; 基因沉默

中圖分類號(hào)：? Q782??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A??? 文章編號(hào)：? 1000-4440（2021）05-1131-06

A one-step method for rapid construction of long-fragment RNA interference vector

LIU Ting-li， GUO Dong-shu， YAO Yao， ZHANG Bao-long

（Excellence and Innovation Center， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：? RNA interference （RNAi） technology can be used for gene function research and crop genetic improvement， but the conventional construction method of RNAi vector is time-consuming and laborious. In this research， we provide a one-step method for rapid construction of long-fragment RNAi vector using uracil-specific excision reagent （ USER ） enzyme. The method is simple， time-saving and labor-saving. Compared with the reported RNAi vectors constructed by restriction enzyme ligation method， Gateway compatible homologous recombination method and PCR direct ligation method， this vector dose not need enzyme digestion fragments. After the fragment amplification is completed， it can react with the prepared lineurized vector. Therefore， the operation process and time are shortened， and the success rate is improved. This vector has no requirements for the restriction site and length of the inserted fragment. Using ?neomycin phosphotransferase ?（ NPTII ） as selective marker gene in this vector， kanamycin and geneticin （G418） can be used to screen transgenic positive plants. It is suitable for genetic transformation of dicot and monocot plants.

Key words：? RNA interference（RNAi）; ?USER ?enzyme; one-step method; vector construction; gene silencing

Fire等發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA （dsRNA）可引發(fā)線蟲(chóng)體內(nèi)的基因沉默，并將這一現(xiàn)象命名為RNA干擾（RNAi）。真核生物體內(nèi)形成的雙鏈RNA或部分雙鏈RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被雙鏈RNA專一的核酸內(nèi)切酶 Dicer 或 Dicer-like ?（ DCL ） 剪切，產(chǎn)生的siRNA （Small interference RNA）形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex， RISC），通過(guò)RNA堿基序列間的堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別靶標(biāo)基因并抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)? ?[1-2] 。

根據(jù)RNAi的原理，人為地在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與靶標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)的具有回文結(jié)構(gòu)的序列，利用細(xì)胞內(nèi)源的RNAi元件，可以阻斷某個(gè)基因的表達(dá)或降低某個(gè)基因的表達(dá)量，引起細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)基因表達(dá)量下降，產(chǎn)生相應(yīng)的表型。目前，RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因的功能研究，具有較高特異性? ?[3-7] 。利用RNAi技術(shù)，可以選取基因特異性區(qū)段作為靶標(biāo)，用于沉默特異的基因或基因家族中的單個(gè)或部分成員;也可以選取基因間的保守區(qū)段作為靶標(biāo)，用于沉默某一類基因。

將具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的載體轉(zhuǎn)化到植物中能夠產(chǎn)生siRNA，并實(shí)現(xiàn)基因的沉默。常規(guī)構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)的方法是將靶標(biāo)基因通過(guò)一段間隔序列連接，形成反向互補(bǔ)的核苷酸序列，由組成型啟動(dòng)子或時(shí)空特性啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)?，F(xiàn)有的RNAi載體的構(gòu)建方法，一類是通過(guò)兩步法進(jìn)行構(gòu)建，包括酶切連接法、Gateway兼容的同源重組法等? [3-7] 。利用酶切連接法，首先將反向互補(bǔ)序列分別構(gòu)建到中間載體，再利用限制性內(nèi)切酶將反向互補(bǔ)序列從中間載體上切下來(lái)，連接到目的載體? [3，6-7] 。傳統(tǒng)的兩步法具有明顯的缺點(diǎn)，利用Gateway兼容的同源重組的方法，首先需要將反向互補(bǔ)序列分別構(gòu)建到入門載體，再通過(guò)LR反應(yīng)連入植物表達(dá)終載體? [4-5] ;酶切連接法不易設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，難以構(gòu)建長(zhǎng)片段RNAi載體。另一類是基于同源重組的一步法構(gòu)建，即分別擴(kuò)增2段反向互補(bǔ)片段、內(nèi)含子片段，再與酶切后的植物表達(dá)載體進(jìn)行四片段同源重組反應(yīng)，然而實(shí)際操作中，多片段同源重組反應(yīng)往往效率偏低，不能保證快速地成功構(gòu)建RNAi載體。

USER 酶包含DNA糖基化酶-裂解酶 Endo ?VIII和尿嘧啶DNA糖基化酶（ UDG ），可特異性切割尿嘧啶。該酶可不依賴限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將PCR產(chǎn)物裝載到目的載體? [8] 。目前使用 USER 酶進(jìn)行一步法構(gòu)建長(zhǎng)片段RNAi載體尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以 PDS 基因?yàn)槔?，基?USER 酶體系，將 PDS 基因片段構(gòu)建到2301/RNAi/OS載體，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)， 實(shí)現(xiàn) PDS 基因的沉默。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

用于載體構(gòu)建的 USER 酶、限制性內(nèi)切酶 Pac ?I和 Nt . Bbv C I購(gòu)自New England Biolabs公司;用于目標(biāo)片段擴(kuò)增的高保真DNA聚合酶、用于大腸桿菌和農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選的 Taq ?DNA聚合酶預(yù)混液購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DNA純化試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 質(zhì)粒和菌株

用于植物表達(dá)的雙元載體質(zhì)粒pCambia2301和2301.GFP4載體為本實(shí)驗(yàn)室保存，用于擬南芥（ Arabidopsis thaliana ） ?FAD2? 基因? [9] 內(nèi)含子克隆的pHurricane質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌（ Agrobacterium tumefaciens ）菌株GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化所用的本氏煙（ Nicotiana ??benthamiana ）種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物合成和測(cè)序

本試驗(yàn)所用引物（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。構(gòu)建載體過(guò)程中的Sanger測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 2301/RNAi/OS載體的構(gòu)建? 以pHurricane質(zhì)粒為模板，利用引物Intron-CF和Intron-CR擴(kuò)增 1 154 ?bp的擬南芥? FAD2? 基因內(nèi)含子序列，用 Bam H I和 Xba ?I分別對(duì)? FAD2? 內(nèi)含子的擴(kuò)增產(chǎn)物和2301.GFP4載體進(jìn)行雙酶切，1% 瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠回收擴(kuò)增片段和線性化載體片段，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 菌株的感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，利用引物 TEV -F和 FAD -R進(jìn)行菌落PCR篩選，選取含有陽(yáng)性擴(kuò)增條帶的單菌落，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。

1.4.2 本氏煙的RNA提取和cDNA合成? 取產(chǎn)生表型的本氏煙葉片，在研缽中液氮速凍，研磨成粉末，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.4.3 2301/RNAi/OS- PDS 載體的構(gòu)建? 以幼嫩煙草葉片的cDNA為模版，利用引物 PDS -F1和 PDS -F2擴(kuò)增576 bp的 PDS 基因區(qū)段作為正向插入片段，利用引物 PDS -R1和 PDS -R2擴(kuò)增與正向插入片段序列相同的區(qū)段作為反向插入片段。用限制性內(nèi)切酶 Pac ?I和 Nt.Bbv C I將2301/RNAi/OS載體進(jìn)行雙酶切，1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收線性化載體和? FAD2?? 內(nèi)含子條帶。配制連接反應(yīng)體系： PDS 正向片段150 ng， PDS 反向片段150 ng，2301/RNAi/OS酶切產(chǎn)物200 ng， USER 酶1 μl，補(bǔ)ddH ?2 O至10 μl。反應(yīng)條件：37 ℃ 20 min ，25 ℃ 20 min，獲得連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α 菌株中。挑取單菌落，分別利用引物 TEV -F和 FAD -R，以及 FAD -F和 NOST -SR進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化? 分別取100 ng 2301/RNAi/OS- PDS 質(zhì)粒和2301/RNAi/OS質(zhì)粒（作為空載體對(duì)照），利用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌菌株，涂布于固體LB培養(yǎng)基平板上（含有50 ?mg/ml 利福平和50 ?mg/ml 卡那霉素），28 ℃倒置培養(yǎng)36 h，挑取單菌落，利用引物 TEV -F和 FAD -R進(jìn)行菌落PCR，挑取3個(gè)陽(yáng)性單菌落，28 ℃振蕩培養(yǎng)36 h用于煙草瞬時(shí)表達(dá)。配制農(nóng)桿菌侵染液（20 ml）：2 ??mol/L? ?MgCl ?2 ?15 μl， 1 ?mol/L ??pH ?5.7 MES 200 μl ，200 ?μmol/L 乙酰丁香酮100 μl，用超純水補(bǔ)足到20 ml。農(nóng)桿菌? OD ??600 = 0.05，用1 ml無(wú)菌注射器將侵染液從煙草葉片背面注射到葉片內(nèi)，每種質(zhì)粒注射3個(gè)單株。

1.4.5 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)? 反應(yīng)體系： 2× 實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液10.0 μl，10 ?μmol/L 引物 PDS -TF（或? EF1? -AF） 0.5 μl，10 ?μmol/L 引物 PDS -TR（或? EF1? -AF） 0.5 μl， 1∶ 30稀釋的cDNA 3.0 μl; 無(wú)離子水6.0 μl。反應(yīng)程序： 95 ℃? 1 min; 94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);熔解曲線， 60～ 95 ℃，每0.1 ℃讀數(shù)1次。通過(guò)2? -△△ Ct? ?法分析基因表達(dá)差異? [10] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)和植物表達(dá)載體構(gòu)建

本試驗(yàn)采用2301.GFP4作為骨架構(gòu)建RNA載體2301/RNAi/OS。2301.GFP4為本實(shí)驗(yàn)室改造，該載體以商業(yè)化的pCambia2301質(zhì)粒作為骨架，在多克隆位點(diǎn)處順序連有含有 2× 花椰菜花葉病毒（CaMV）35S增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動(dòng)子、煙草蝕紋病毒（TEV）的翻譯增強(qiáng)子TEV leader序列? [11] 、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的編碼序列和35S終止子（圖1）。該載體以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ NPTII ）基因作為篩選標(biāo)記基因。

以pHurricane質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增擬南芥? FAD2? 基因的內(nèi)含子序列，通過(guò)引物在? FAD2? 內(nèi)含子編碼序列上游和下游分別引入限制性內(nèi)切酶（ Bam H I和 Xba ?I）位點(diǎn)，以便將? FAD2? 內(nèi)含子編碼序列定向連入同樣用 Bam H I和 Xba ?I雙酶切的2301.GFP4載體中。同時(shí)在? FAD2? 內(nèi)含子序列兩側(cè)，分別引入 Nt . Bbv C I- Pac ?I- Nt . Bbv C I酶切位點(diǎn)，使得所得載體在 Nt . Bbv C I- Pac ?I的作用下能夠形成含有9 nt黏性末端的載體片段。測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為2301/RNAi/OS（圖1），即為本試驗(yàn)構(gòu)建的RNAi植物表達(dá)載體。后續(xù)只需擴(kuò)增出目標(biāo)基因的反向互補(bǔ)序列，即可通過(guò) USER 酶介導(dǎo)的方法連入該載體。

2.2 煙草 PDS ?基因的瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建

為了驗(yàn)證利用2301/RNAi/OS構(gòu)建的RNAi載體能夠在植物中有效地實(shí)現(xiàn)基因沉默，我們選取本氏煙 PDS 基因作為靶標(biāo)基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化沉默 PDS 基因? [6] 。 PDS 突變體會(huì)表現(xiàn)出葉片白化失綠以及植株生長(zhǎng)受抑制的表型，因而容易通過(guò)表型變化，直觀地觀察基因沉默情況。

35S promoter：花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子;dual enhancer：2×花椰菜花葉病毒35S增強(qiáng)子;TL：煙草蝕紋病毒翻譯增強(qiáng)子;MCS：限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn);eGFP：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白;Ter：35S終止子;? FAD2?? intron：擬南芥? FAD2? 基因內(nèi)含子。上部放大圖中的黑色豎線和折線表示相應(yīng)限制性內(nèi)切酶的切割位置。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中本氏煙的cDNA選取從編碼區(qū)121位到696位之間的576 bp的基因特異性區(qū)段作為靶標(biāo)區(qū)段，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物（ PDS -F1和 PDS -F2， PDS -R1和 PDS -R2），以本氏煙幼苗葉片的cDNA為模板，分別擴(kuò)增靶標(biāo)區(qū)段。設(shè)計(jì)引物時(shí)，在引物中基因特異區(qū)段的5′側(cè)依次引入 USER 酶的識(shí)別堿基尿嘧啶（U）和特異的序列（表1），以便目標(biāo)區(qū)段的PCR產(chǎn)物在 USER 酶作用后，可產(chǎn)生與2301/RNAi/OS酶切產(chǎn)物一致的9 nt的黏性末端。用 USER 酶處理2段含有靶標(biāo)基因序列的PCR產(chǎn)物，以及 Pac ?I和 Nt.Bbv C I雙酶切的2301/RNAi/OS載體，反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（圖2A）。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，鑒定兩段目標(biāo)序列均連入2301/RNAi/OS載體的克隆。本試驗(yàn)隨機(jī)挑取16個(gè)單菌落，2組引物均能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的有13個(gè)菌落，正確率超過(guò)80%（圖2B、圖2C、圖2D）。選取2號(hào)和5號(hào)克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果都正確，命名為2301/RNAi/OS- PDS -2和2301/RNAi/OS- PDS -5，后續(xù)選取2號(hào)質(zhì)粒進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。

2.3 瞬時(shí)沉默本氏煙 PDS 基因

利用電擊法將質(zhì)粒2301/RNAi/OS- PDS -2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101的感受態(tài)細(xì)胞中，同樣利用 TEV -F和 FAD -R進(jìn)行菌落PCR篩選。隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆，接種于含有利福平、慶大霉素和卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和。離心收集菌體沉淀，利用煙草注射緩沖液重懸至終 OD ??600 =0.5，靜置活化后注射 4～ 5片平展的本氏煙葉片。以注射含有2301/RNAi/OS空載體的農(nóng)桿菌的煙草作為對(duì)照。每隔2 d注射1次，共注射3次，于最后一次注射后10 d觀察煙草葉片表型。結(jié)果表明，注射含有2301/RNAi/OS空載體的農(nóng)桿菌的葉片（對(duì)照）仍然保持綠色，并且能夠長(zhǎng)出多片綠色新葉（圖3A）;而注射了含有2301/RNAi/OS- PDS -2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的煙草植株葉片明顯失綠，較老的葉片白化壞死，植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制（圖3B），呈現(xiàn)出典型的 PDS 基因功能缺失的表型。除了被注射的葉片失綠白化，沒(méi)有被注射的新葉的葉脈也可以觀察到明顯的白化表型。除了表型觀察，本試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè) PDS 基因表達(dá)水平的變化。本試驗(yàn)針對(duì)RNAi載體靶標(biāo)序列以外的3′端區(qū)段設(shè)計(jì)引物，提取葉脈白化的新葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄了后，檢測(cè) PDS 基因表達(dá)水平，以煙草延伸因子基因（ ?EF1a? ）作為內(nèi)參基因。結(jié)果表明，相比于對(duì)照，注射了含有2301/RNAi/OS- PDS -2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的煙草植株中 PDS 基因的表達(dá)水平下降20%（圖3C），這與相應(yīng)葉片葉脈白化的表型相一致。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)構(gòu)建的RNAi載體可以有效地在植物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因沉默。

A： Pac ?I和 Nt.Bbv C I雙酶切后的2301/RNAi/OS載體和 USER 酶切后的 PDS 基因擴(kuò)增產(chǎn)物混合后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落;B：利用引物 TEV -F和 FAD -R進(jìn)行菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;C和D：利用引物 FAD -F和 NOST -SR進(jìn)行菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;M：DNA marker;數(shù)字1～16代表被測(cè)單克隆的編號(hào)。

A：注射含有空載體2301/RNAi/OS的農(nóng)桿菌的煙草植株的表型（對(duì)照）;B：注射含有2301/RNAi/OS- PDS 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的煙草植株的表型。用白色的數(shù)字標(biāo)注被注射的葉片，從基部計(jì)算第1片被注射的葉片計(jì)為1;C：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)照和注射含有2301/RNAi/OS- PDS 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的煙草植株中 PDS 基因的相對(duì)表達(dá)水平。對(duì)照中 PDS 基因的相對(duì)表達(dá)水平被設(shè)為1，煙草延伸因子基因（? EF1a? ）被用作內(nèi)參基因，誤差線表示3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。 PDS -RNAi代表2301/RNAi/OS- PDS -2質(zhì)粒。

3 討 論

近年來(lái)，新近發(fā)展起來(lái)的基因編輯技術(shù)能夠相對(duì)容易地在多種植物中實(shí)現(xiàn)基因功能缺失突變? [12-16] 。但對(duì)于純合突變致死的基因，基因功能的徹底喪失可能導(dǎo)致純合體不能成活，影響后續(xù)表型和基因功能的分析。利用RNAi技術(shù)，可不同程度地降低靶標(biāo)基因的表達(dá)，而不會(huì)徹底敲除目標(biāo)基因，進(jìn)而能夠在植株成活的情況下，研究基因功能。此外，對(duì)于序列相似性較高的基因家族，RNAi技術(shù)可高效地同時(shí)降低多個(gè)基因的表達(dá)，尤其是串聯(lián)重復(fù)的基因家族，通過(guò)雜交將多個(gè)單基因突變聚合在一起是幾乎不能達(dá)到的，這時(shí)候RNAi技術(shù)便更能體現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)。

目前在植物中，利用小RNA干擾基因表達(dá)主要有RNAi和人工微RNA（amiRNA）2種策略。與形成較長(zhǎng)的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA前體不同，amiRNA的策略是選取較短（通常為21 nt）的1段與靶標(biāo)基因互補(bǔ)的序列，同時(shí)借用植物內(nèi)源存在的microRNA前體基因作為骨架構(gòu)建載體，在植物中表達(dá)。一般來(lái)講，amiRNA策略在體內(nèi)只產(chǎn)生一種小RNA，雖然可能有益于提高干擾的特異性，但干擾效率有時(shí)低于產(chǎn)生多段小RNA的RNAi策略。此外，不同的靶標(biāo)序列對(duì)所使用的內(nèi)源RNA骨架可能具有一定程度的選擇性。因而，RNAi相比于amiRNA仍具有自己的優(yōu)勢(shì)? [1] 。

本研究采用基于 USER 酶的一步法構(gòu)建RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體。該方法簡(jiǎn)便高效，植物表達(dá)終載體一旦構(gòu)建好，每次只需擴(kuò)增2條反向互補(bǔ)的序列，再用 USER 酶處理，就可以與酶切后的終載體相連接。本研究以本氏煙 PDS 基因?yàn)槔?，?gòu)建 PDS 基因的2條反向重復(fù)序列，成功構(gòu)建了RNAi載體，載體構(gòu)建成功率超過(guò)80%。 USER 酶可產(chǎn)生比普通酶切位點(diǎn)更長(zhǎng)的黏性末端，且不需要DNA連接酶的作用即可完成連接，快速、穩(wěn)定、高效。與LIC連接方法? [17] 相比，本研究報(bào)道的方法成功率更高，操作更簡(jiǎn)便。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證該載體的沉默效果，結(jié)果表明，利用該載體可以有效沉默煙草 PDS 基因，使注射含有2301/RNAi/OS- PDS -2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的煙草葉片明顯失綠，植株生長(zhǎng)明顯受到抑制。有意思地是，除了直接注射的葉片失綠黃化，沒(méi)有直接注射的新生葉片的葉脈也表現(xiàn)出明顯的白化表型，并且 PDS 基因的表達(dá)水平降低到對(duì)照的80%。這可能是小RNA可以在細(xì)胞間移動(dòng)導(dǎo)致的? [2，18] 。這一現(xiàn)象表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)RNA干擾能夠在一定程度上實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性的基因沉默。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）