擬南芥 AtFAD6 基因突變體的構(gòu)建

徐雪珍 鄭月萍 張夏婷 宋孜元

摘要：? 運用優(yōu)化后的CRISPR/Cas9基因編輯載體，創(chuàng)建了2個不同的擬南芥脂肪酸去飽和酶6基因（? AtFAD6? ）突變體，其? AtFAD6? 基因的保守位點氨基酸序列均發(fā)生變化，同時終止密碼子被提前引入，基因功能喪失。脂肪酸組分分析結(jié)果顯示，這2種突變體的葉片中單不飽和脂肪酸 16∶ 1和 18∶ 1大量積累，多不飽和脂肪酸 16∶ 3和 18∶ 3含量則大幅下降，同時伴隨著葉片發(fā)黃、地上部生物量顯著降低、抽薹提前 2～ 3 d的表型變化。多不飽和脂肪酸 18∶ 3作為茉莉酸合成的前體物質(zhì)，其含量的下降致使突變體中茉莉酸信號標(biāo)記基因? AtVSP1? 在葉片中的表達(dá)量有所降低，而莖中的表達(dá)量提高了40%以上。所獲得的2個? AtFAD6? 功能喪失型突變體為進(jìn)一步研究脂類代謝與植物生長發(fā)育之間的關(guān)系提供了重要的遺傳材料。

關(guān)鍵詞：? 擬南芥; CRISPR/Cas9; 脂肪酸去飽和酶（ FAD ）; 基因突變體

中圖分類號：? Q754??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A??? 文章編號：? 1000-4440（2021）05-1125-06

Construction of?? Arabidopsis AtFAD6?? gene mutant

XU Xue-zhen， ZHENG Yue-ping， ZHANG Xia-ting， SONG Zi-yuan

（School of Agricultural and Food Sciences， Zhejiang A&F University， Hangzhou 311300， China）

Abstract：?? The optimized CRISPR/Cas9 gene editing vector was used to create two distinct ?Arabidopsis ???AtFAD6?? gene mutant. As the nucleotide sequence of the conserved amino acid residues was mutated， and the stop codon was introduced in advance， the?? fad6?? gene function of these two mutants was completely lost. The results of fatty acid composition analysis showed that monounsaturated fatty acids ?16∶ 1 and ?18∶ 1 accumulated significantly while the content of polyunsaturated fatty acids ?16∶ 3 and ?18∶ 3 decreased significantly in the leaves of these two mutants. At the same time， phenotypes of the mutants were appeared， including yellowed leaves， significantly decreased above-ground biomass， and bolting ?2- 3 days earlier than wild-type. The paly unsaturated fatty acid ?18∶ 3 was used as the precursor substance of jasmonic acid synthesis. The decrease of its content reduced the expression of the jasmonic acid signal marker gene?? AtVSP1?? in the leaves， while the expression in stems increased by more than 40%. The two?? AtFAD6?? loss-of-function mutants obtained in our study provide important genetic material for further research on the relationship between lipid metabolism and plant growth and development.

Key words：? ?Arabidopsis ; CRISPR/Cas9; fatty acid desaturase（ FAD ）; gene mutant

不飽和脂肪酸是植物細(xì)胞內(nèi)一類重要的代謝物質(zhì)，也是植物膜脂的主要結(jié)構(gòu)成分，在植物生長發(fā)育、應(yīng)答各種環(huán)境信號等過程中發(fā)揮重要作用? [1] 。脂肪酸去飽和酶（ FAD ）是催化脂肪酸鏈特定位置形成雙鍵和產(chǎn)生不飽和脂肪酸的酶類，它的種類和數(shù)量在很大程度上可以調(diào)控植物組織的脂肪酸組成。而膜脂中不飽和脂肪酸種類及其含量的改變常常引起膜功能的變化。在模式植物擬南芥（ Arabidopsis thaliana ）中， ?AtFAD6? 是質(zhì)體內(nèi)膜上的ω-6型脂肪酸去飽和酶，可將初步形成的甘油脂甘油骨架上的油酸（ 18∶ 1）或棕櫚油酸（ 16∶ 1）還原成亞油酸（ 18∶ 2）或棕櫚亞油酸（ 16∶ 2）? [2] ，它不僅對維持膜的穩(wěn)定性和流動性具有重要作用，還參與茉莉酸（Jasmonic acid， JA）生物合成的前體物質(zhì)三烯脂肪酸（Trienoic fatty acid）的合成? [3] 。茉莉酸是植物體內(nèi)一種重要的內(nèi)源激素，具有促進(jìn)植物根系生長與再生、抑制擬南芥葉片和花瓣伸展、抑制植物下胚軸生長、調(diào)節(jié)氣孔開關(guān)、調(diào)控擬南芥雄蕊發(fā)育、促進(jìn)葉片衰老等作用? ?[3] 。現(xiàn)有許多研究結(jié)果表明， ?FAD6? 在植物抵御低溫、高鹽脅迫等非生物脅迫中具有重要作用? [4] 。

在早期的基因功能研究中，研究者常采用反向遺傳學(xué)手段，構(gòu)建基因突變體。受到技術(shù)水平的限制，前人構(gòu)建突變體的方法多為化學(xué)誘變法。然而，這種方式構(gòu)建的突變體常常只在目標(biāo)基因發(fā)生點突變，使氨基酸殘基發(fā)生變化，不一定造成基因功能的完全喪失。例如有研究結(jié)果顯示使用EMS誘變創(chuàng)建的? ATS1? 基因突變體存在嚴(yán)重的基因滲透現(xiàn)象? [5] 。因此，構(gòu)建功能完全喪失型突變體成為明晰基因功能的重要前提。隨著基因定點編輯技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的成功應(yīng)用使構(gòu)建功能喪失型突變體變得簡便。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由sgRNA和Cas9蛋白兩部分構(gòu)成，其基本工作原理是sgRNA在受體基因組中找到與其互補(bǔ)配對的片段，引導(dǎo)Cas9蛋白對該位點進(jìn)行切割，而后在植物DNA自我修復(fù)過程中引入突變? [6] 。

目前在植物脂類代謝研究領(lǐng)域，使用的? AtFAD6? 基因突變體均為非同義突變，其中只有單個氨基酸殘基發(fā)生改變? [7] ，因而難以判定這類突變體是否含有部分 ?AtFAD6? 酶活性。在這種情況下，人們不能完全了解? AtFAD6? 基因的功能。因而，為了進(jìn)一步闡明? AtFAD6? 的基因功能，本研究利用優(yōu)化后的CRISPR/Cas9基因編輯載體對? AtFAD6? 基因進(jìn)行定點編輯，構(gòu)建功能完全喪失型突變體，并分析? AtFAD6? 基因功能的喪失對擬南芥抽薹及茉莉酸信號強(qiáng)度的影響。

1 材料與方法

1.1?? AtFAD6? 基因功能喪失型突變體的構(gòu)建

1.1.1 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建? CRISPR/Cas9靶序列的設(shè)計和載體的構(gòu)建參照Wang等? [8] 和朱麗穎等? [9] 的方法。以擬南芥脂肪酸去飽和酶基因 ?AtFAD6? 為靶基因，從中選取G、C含量較高、基因特異性較強(qiáng)的2個關(guān)鍵片段? AtFAD6?? target sequence 1 （5′-CAGAAGAAGCAGCAAGCTTAGG-3′）和? AtFAD6?? target sequence 2 （5′-AAACCGCCATGGCTCATATGGG -3′）作為靶序列。其中，第一個靶序列含有 Hin d III酶切位點，可規(guī)避常用的PAGE法篩選遇到的難以篩選到堿基替換和小片段缺失的問題? [10] 。用高保真酶以稀釋100倍的pCBC-DT1T2為模板進(jìn)行四接頭引物（5′-TGCAGAAGAAGCAGCAAGCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，5′-AACATA￣T￣G￣A￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣C￣G￣G￣T￣T￣T￣CAATCTCTTAGTCGACTCTCTAC-3′，￣5′-A￣T￣A￣T￣A￣T￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣G￣A￣T￣T￣G￣C￣A￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣C￣A￣G￣C￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣-3′和5′-A￣T￣T￣A￣T￣T￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣G￣A￣A￣A￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣A￣G￣C￣C￣A￣T￣GGCGGTTTC -3′ ）PCR擴(kuò)增并純化回收PCR產(chǎn)物。同時用? Bsa? I酶切回收的PCR產(chǎn)物和CRISPR/Cas9載體，T4連接酶組裝最終載體，獲得雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體。

1.1.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化? 供試材料為哥倫比亞野生型擬南芥（Col-0），生長條件為14 h光照/10 h黑暗，晝夜溫度為22 ℃/18 ℃，相對濕度為40%，水肥供應(yīng)充足。使用農(nóng)桿菌侵染法將構(gòu)建好的編輯基因載體轉(zhuǎn)化至擬南芥? [11] 。

1.1.3 擬南芥陽性轉(zhuǎn)基因后代的篩選? 我們在CRISPR/Cas9編輯載體中克隆了種子特異性表達(dá)的? At2S3? 啟動子驅(qū)動的熒光蛋白報告基因? mCherry? 作為篩選標(biāo)記? [9] ，因此，在將編輯載體轉(zhuǎn)化擬南芥獲得T ?1 代轉(zhuǎn)基因種子后，使用熒光顯微鏡篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子。轉(zhuǎn)基因陽性種子具有熒光蛋白報告基因 ?mCherry? 的轉(zhuǎn)入，在藍(lán)色激發(fā)光下可以顯示紅色熒光? [12] 。

1.1.4 突變體的分子篩選? 在靶序列? AtFAD6?? target sequence 1和? AtFAD6?? target sequence 2兩端分別設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物為包括靶序列在內(nèi)約200 bp的片段。提取T ?1 代陽性轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA為模板進(jìn)行PCR。取具有? AtFAD6?? target sequence 1序列的PCR產(chǎn)物用 Hind Ⅲ充分酶切，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取具有? AtFAD6?? target sequence 2序列的PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰 胺∶ 甲叉雙丙烯酰 胺=? 29∶ 1）檢測? [9] 。

1.2 葉片脂肪酸組分分析

取生長33 d的植株葉片樣品，經(jīng)液氮研磨后稱取500 mg進(jìn)行試驗。以100 μl 100 ?μg/ml 的十七烷酸甘油三酯正己烷溶液為內(nèi)標(biāo)，用6 ml氯 仿∶ 甲 醇∶ 甲酸 （10∶? 10∶ 1，體積比）和2 ml氯 仿∶ 甲 醇∶ 水 （5∶? 5∶ 1，體積比）經(jīng)2次抽提，合并上清提取液，加入3 ml含0.2 ?mol/L 磷酸和1.0 ?mol/L 氯化鉀的水溶液，抽提下層氯仿相。經(jīng)氮氣吹干后，加入 300 μl氯仿將沉淀重新溶解，再加入2 ml 1%硫酸-甲醇溶液，于80 ℃恒溫干式金屬浴2 h。冰上冷卻，用2 ml 0.9% NaCl（質(zhì)量體積比）溶液和2 ml正己烷萃取后，再用2 ml正己烷二次萃取，合并萃取液。通過氮吹法濃縮萃取液體積至100 μl? [9] ，然后用氣相色譜儀進(jìn)行檢測? [13] 。每個株系設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。用單因素方差分析法分析株系間的差異顯著性。

1.3 葉綠素含量測定

取播種后 3～ 4周的植株整個地上部，放入干凈的12 ml帶蓋玻璃管中，加入3 ml 80%丙酮溶液。4 ℃下保存14 h，參照Arnon的方法對其葉綠素含量進(jìn)行測定? [14] 。每個株系設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，用單因素方差分析法分析株系間的差異顯著性。

1.4 地上部生物量測定

取播種后 21～ 28 d的植株整個地上部，分別在烘干前、后稱量其鮮質(zhì)量與干質(zhì)量，通過其鮮質(zhì)量與干質(zhì)量的差值占鮮質(zhì)量的比例計算含水量。每個株系設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)，用單因素方差分析法分析株系間的差異顯著性。

1.5 基因表達(dá)量分析

基因表達(dá)量分析采用qRT-PCR 法。根據(jù)已知的? AtVSP1? 和? AtVSP2? 基因（Gene ID： AT5G24780）序列（數(shù)據(jù)來源于擬南芥信息資源庫www. Arabidopsis .org）設(shè)計實時定量PCR引物。? AtVSP1? 的正向引物和反向引物分別為5′-TGGATCTTTGACCTAGACGACA-3′和5′-CGAGTTCCAAGAGGTTTTVGTA-3′。

取播種后40 d的相同葉位葉片和莖，依次進(jìn)行總RNA的提?。═rizol法）及基因組DNA的去除、反轉(zhuǎn)錄，并以反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測。以擬南芥 AtACTIN 為內(nèi)參基因，其擴(kuò)增引物序列為5′-GTCGTACAACCGGTATTGTGCT-3′和5′- TGTCTCTTACAATTTCCCGCTCT-3′。采取2? -△△ Ct? 法計算待測基因的相對表達(dá)量? [15] 。

2 結(jié)果與分析

2.1?? AtFAD6? 基因突變體的獲得

2.1.1?? AtFAD6? 基因突變體基因型的分子鑒定? 使用酶切法和PAGE法對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行基因型鑒定。經(jīng)過多代連續(xù)篩選鑒定后，獲得了2個純合的突變體，沿襲前人命名方式，并根據(jù)獲得突變體的順序，將其命名為? fad6? -2和? fad6? -3。

獲得純合可穩(wěn)定遺傳的突變體后，對其靶位點附近序列進(jìn)行分析驗證。結(jié)果表明? fad6? -2和? fad6? -3突變體分別在2個靶位點處，即第5個和第2個外顯子處，發(fā)生了47 bp缺失和1 bp插入的突變（圖1），其CDS序列發(fā)生相應(yīng)變化，造成移碼突變。在轉(zhuǎn)錄后翻譯過程中，fad6-2的第187位氨基酸殘基由蘇氨酸（T）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕），并在繼續(xù)錯誤翻譯2個氨基酸（VG-AV）后，引入終止密碼子UAA，提前終止翻譯;fad6-3的第25位氨基酸殘基由亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S），并在繼續(xù)錯誤翻譯17個氨基酸（AASSARVSPGVYAVKPI-CCFFCSCFSWCICCEAD）后，引入終止密碼子UGA，提前終止翻譯。二者均造成由原位于207、210、211、367、370、371位點處的6個組氨酸殘基的氨基酸序列發(fā)生變化，而這些位點對鐵離子的結(jié)合具有重要作用? [16] 。因此，我們構(gòu)建的突變體可判斷為功能喪失型突變體。

2.1.2??? AtFAD6? 基因突變體的脂肪酸組分分析??? AtFAD6? 負(fù)責(zé)編碼質(zhì)體脂肪酸去飽和酶，它可以催化在單不飽和脂肪酸 16∶ 1或 18∶ 1中再引入一個雙鍵成為 16∶ 2或 18∶ 2的反應(yīng)，因此，還可以通過測定葉片脂肪酸組分的變化驗證? AtFAD6? 的基因功能完整性。對生長33 d的植株葉片進(jìn)行脂肪酸組分分析，結(jié)果（表1）顯示，與野生型相比，2個突變體中? AtFAD6? 的底物 16∶ 1和 18∶ 1大量累積，均上升5倍以上。而其最終產(chǎn)物不飽和脂肪酸 16∶ 3和 18∶ 3含量大幅下降，此結(jié)果同樣表明獲得的突變體為? AtFAD6? 基因功能喪失型突變體。

2.2?? AtFAD6? 基因突變體的表型分析

播種后21 d，? AtFAD6? 基因功能喪失型突變體與野生型相比表現(xiàn)出了明顯的表型差異。植株葉片變黃（圖2A）;葉綠素a與葉綠素b的比值約上升23.4%（圖2E）;地上部生長勢變?nèi)?，地上部生物量減少至野生型的62%左右（圖2D），而葉片含水量未發(fā)生顯著變化（數(shù)據(jù)未顯示）。另外，?? AtFAD6? 基因功能的喪失可顯著加速植物抽薹（圖2C），突變體擁有 8～ 9片蓮座葉時即可抽薹，而野生型蓮座葉需 11～ 13片時開始抽薹（圖 2B），與野生型相比，突變體抽薹日期比野生型提前了 2～ 3 d（圖2F）。另外，? AtFAD6? 產(chǎn)物 18∶ 3參與植物體內(nèi)茉莉酸的生物合成? [3] ， ??AtFAD6? 基因突變可能影響植物體內(nèi)茉莉酸信號強(qiáng)度。本研究對茉莉酸信號標(biāo)記基因? AtVSP1? 進(jìn)行了表達(dá)量分析。結(jié)果顯示? AtVSP1? 表達(dá)量在葉片中稍有下降，在莖稈中提高了40%以上（圖2G），表明該生長階段，? AtFAD6? 功能的喪失對植物體內(nèi)茉莉酸信號的影響具有組織特異性。

3 討 論

AtFAD6? 是質(zhì)體 ω -6型脂肪酸去飽和酶，對葉片中脂肪酸組分具有重要影響。在本研究中創(chuàng)制的2個? AtFAD6? 基因功能喪失型突變體中，底物 16∶ 1和 18∶ 1大幅積累，產(chǎn)物 16∶ 3和 18∶ 3含量大幅下降，這與前人研究結(jié)果一致? [16-17] 。另外，脂肪酸組分的改變常常影響質(zhì)體膜的完整性和流動性，進(jìn)而影響植物對逆境脅迫的響應(yīng)? [7，18] 。研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下， ?AtFAD6? 基因突變導(dǎo)致植株葉片整體發(fā)黃。出現(xiàn)葉片整體發(fā)黃表型的原因通常為受到了光、溫、水、土、肥、病蟲等方面非生物和生物脅迫，或自然衰老代謝。本研究中，植株生長過程中未受到生物和非生物脅迫，葉片含水量也未發(fā)生顯著變化，表明該表型不是由于葉片生理性缺水或衰老造成的。突變體葉片發(fā)黃可能是由于? AtFAD6? 直接負(fù)責(zé)質(zhì)體內(nèi)膜脂合成，其功能喪失影響了葉綠體內(nèi)膜的完整性和流動性，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠體含量下降。而由于在不同部位形成的不飽和脂肪酸之間存在交換? [19] ，因此 ?AtFAD6? 基因喪失功能后，植株僅出現(xiàn)葉片發(fā)黃的表型，未直接死亡。而? AtFAD6? 基因功能的喪失是否導(dǎo)致了植株內(nèi)源性氮元素的缺乏，還需進(jìn)一步探究。

（A）播種后第21 d植株表型;（B）、（C） 播種后第33 d植株表型;（D）播種后第21 d地上部鮮質(zhì)量（ n =10）;（E）播種后第21 d葉綠素a與葉綠素b的比值（ n =5）;（F）野生型和突變體抽薹所需天數(shù)（ n =20）;（G）播種后第33 d?? AtVSP1? 相對表達(dá)量。? * * 表示存在0.01水平上的顯著差異;? * * * 表示存在0.001水平上的顯著差異;? * * * * 表示存在 0.000 1 水平上的顯著差異。Bar=2 cm。

早期研究結(jié)果表明，在正常生長條件下，? AtFAD6? 基因功能的喪失對植株的生長及生長發(fā)育進(jìn)程無明顯影響? [17] ，但本研究結(jié)果與其并不完全一致。我們發(fā)現(xiàn)， ?AtFAD6? 基因的突變造成植株地上部生物量顯著下降，抽薹顯著提前。這可能是由于在早期研究中，植株基因突變體的創(chuàng)建主要通過EMS誘變的途徑，創(chuàng)建的突變體? fad6? -1僅發(fā)生非同義突變，其翻譯的多肽鏈中，僅第160位的甘氨酸（G）殘基突變?yōu)榫彼幔≧）? [7] ，在這種突變體中， ?AtFAD6? 基因功能可能未完全喪失，而我們構(gòu)建的突變體為功能喪失型突變體。這些差異表明，我們獲得的功能喪失型突變體將有助于徹底了解? AtFAD6? 基因功能。同時也表明，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制基因功能喪失的植物突變體具有重要的實踐應(yīng)用價值? [20-21] 。

在本研究中，我們還對茉莉酸信號標(biāo)記基因? AtVSP1? 在擬南芥野生型和突變體抽薹期葉片和莖稈中的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，? AtFAD6? 的突變造成? AtVSP1? 在植株葉片中表達(dá)量稍有降低，在莖稈中表達(dá)量大幅提升，表明? AtFAD6? 對植物體內(nèi)茉莉酸信號的影響具有組織特異性。大量研究結(jié)果表明，茉莉酸信號途徑對植物開花時間和雄蕊發(fā)育等生育進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用? [22] 。 ?AtFAD6? 基因是否通過影響茉莉酸合成前體多不飽和脂肪酸的形成，進(jìn)而影響茉莉酸信號強(qiáng)度的變化對植物抽薹以及生育期造成影響，及其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建? AtFAD6? 基因功能喪失型突變體，不僅有助于完善對? AtFAD6? 基因功能的認(rèn)識，同時為進(jìn)一步研究脂類代謝與植物生長發(fā)育的關(guān)系提供了有用的遺傳材料。

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（責(zé)任編輯：張震林）