應(yīng)用高通量測序方法研究CRF01-AE亞型HIV-1毒株耐藥突變的分子進(jìn)化規(guī)律

鄧永岳,吳守麗,邱麗君,嚴(yán)延生

(1.福建醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,福建 福州,350001;2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院 感染科,福建 廈門,361000;3.福建省疾病預(yù)防控制中心 福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州,350001;4.福建省立醫(yī)院 醫(yī)院感染管理部,福建 福州,350001)

大量研究[1-3]表明，隨著艾滋病抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(ART)的推廣，耐藥的流行趨勢(shì)也越來越嚴(yán)重。一項(xiàng)針對(duì)來自64 個(gè)低中收入國家的56 044例感染人類免疫缺陷病毒(HIV)的成年人的薈萃分析[4]估計(jì)，在所有地區(qū)中每年的治療前耐藥率的年增長率均大幅增加。鑒于耐藥現(xiàn)狀，世界衛(wèi)生組織(WHO)強(qiáng)烈推薦更有效地利用有限的資金對(duì)治療患者進(jìn)行耐藥監(jiān)測并努力確保提供適當(dāng)?shù)囊痪€藥物[5],這就要求對(duì)當(dāng)?shù)亓餍卸局昴退幫蛔兊姆肿舆M(jìn)化規(guī)律有足夠的了解，才能合理選擇耐藥監(jiān)測的時(shí)間點(diǎn)。近年來，國外學(xué)者應(yīng)用高通量測序方法研究HIV耐藥突變?nèi)〉昧撕芎玫男Ч?，但國?nèi)未見報(bào)道。本研究參考DUDLEY D M等[6]建立的檢測方法，重新設(shè)計(jì)適合的測序引物，研究本地區(qū)流行毒株在接受抗病毒治療過程中耐藥突變發(fā)生和發(fā)展的規(guī)律，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇5例在福建省疾控中心經(jīng)6～8年一線抗病毒治療并發(fā)生耐藥的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01-AE亞型艾滋病患者作為研究對(duì)象，每例患者每年至少隨訪1次，總隨訪次數(shù)≥6次，隨訪時(shí)收集患者的EDTA抗凝全血,-80 ℃低溫冰箱保存，統(tǒng)一檢測。共收集41份血清標(biāo)本用于分析，病毒載量>1 000 copies/mL的標(biāo)本可用于耐藥檢測。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增子文庫準(zhǔn)備:① 提取RNA,取140 μL血漿，采用Qiagen試劑盒提取RNA,操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。② 巢式PCR第1輪，采用一步法RT-PCR,PCR反應(yīng)條件為50 ℃ 60 min,94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)2次),94 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)2次),94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)16次),68 ℃ 10 min。引物信息見表1。③ 巢式PCR第2輪，分3個(gè)片段擴(kuò)增pol基因2 199～3 285區(qū)域，標(biāo)記為Pro、RT-A、RT-B,PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)2次),94 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)2次),94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環(huán)16次),68 ℃ 10 min。模板特異性引物序列信息見表2。

表1 一步法RT-PCR引物信息

表2 模板特異性引物序列信息

1.2.2 高通量測序:擴(kuò)增子文庫經(jīng)過純化、質(zhì)控和定量以及稀釋和富集后進(jìn)行EmPCR和Roche 454高通量測序。

1.2.3 序列分析:使用Mothur軟件(Version 1.31.2,http://www.mothur.org/)對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，根據(jù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)修剪3′端，去除Roche/454 amplicon adaptors和短于50 bp的序列。將序列與HXB2參考株(GenBank NC_001802)進(jìn)行比對(duì)，然后采用GATK軟件進(jìn)行SNP calling,使用參數(shù)為“stand_call_conf 50 -stand_emit_conf 10”。最后根據(jù)Stanford HIV drug resistance data base (Stanford HIVDB)已知耐藥突變，列出相應(yīng)位點(diǎn)的特定氨基酸改變，將SNP calling的結(jié)果與之比對(duì)，計(jì)算含有某個(gè)位點(diǎn)耐藥突變的序列在覆蓋到該位點(diǎn)的總序列中的比率，<20%的耐藥突變定義為劣勢(shì)耐藥突變。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本的基本信息

共選取5例患者在抗病毒治療前后的系列標(biāo)本進(jìn)行高通量測序分析，隨訪7～9次，時(shí)間跨度6～8年，標(biāo)本的基本信息見表3。

表3 標(biāo)本的基本信息

2.2 耐藥突變特征

第1例患者治療5個(gè)月后，即檢測到接近100%高頻的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)M184V突變，此后一直持續(xù)存在，即使更換治療方案并停用3TC長達(dá)29個(gè)月，也始終能被檢測到，見表4。治療3個(gè)月后，即檢測到高頻胸腺嘧啶脫氧核苷類似物變異(TAMs)D67N和K70R,其中D67N在整個(gè)治療過程中持續(xù)存在，但K70R在下一次隨訪中就不再出現(xiàn)。一線方案治療40個(gè)月后出現(xiàn) Q151M/A62V/V75I,換二線方案治療后又出現(xiàn)F77L和F116Y,形成完整的151復(fù)合體。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)類耐藥突變比較簡單，在用藥后第1次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,比率接近100.00%,停用奈韋拉平(NVP)后未用其他NNRTIs藥，但4年后仍存在該類藥物的高頻突變?；颊咴趩?dòng)治療后第3次隨訪時(shí)換用含蛋白酶抑制劑(PIs)類藥物茚地那韋(IDV)的方案，在第4次隨訪時(shí)就檢測到PI類耐藥，即高頻的M46I(99.96%)和中高頻的I84V(61.66%),第5次隨訪時(shí)其頻率都接近100.00%,同時(shí)還新出現(xiàn)了L76V(100.00%),這3種耐藥突變?cè)陔S后的幾次檢測中一直存在，即使換含克力芝的二線方案也一樣。

表4 第1例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第2例患者治療3個(gè)月后，即出現(xiàn)高頻M184V突變，且一直維持在整個(gè)治療過程中，見表5。在治療過程中也形成TAMs突變，與第1例患者不同的是，第2例患者主要通過TAM1途徑?；颊咴谟盟幒蟮?次隨訪即檢測到NNRTIs類高頻主要耐藥突變K101E和G190A,停用相應(yīng)藥物或換二線藥物后，突變也始終存在;患者換用含PIs類藥物IDV的方案5個(gè)月后，檢測到低頻V82A(2.73%);在換含克力芝的二線方案2個(gè)月后，檢測到都接近100.00%的M46I和V82A;第6次隨訪時(shí)，在此基礎(chǔ)累加了高頻的I47V(100.00%)、F53L (98.44%)和I54V(99.72%);第7次隨訪時(shí)繼續(xù)增加了L76V(80.11%);總體上而言，使用PIs類藥后,PIs類藥物突變不斷累加，至末次隨訪時(shí)共檢測到5個(gè)接近100.00%高頻的主要突變。

表5 第2例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第3例患者治療7個(gè)月后出現(xiàn)M184V突變且一直維持在整個(gè)治療過程中，見表6。與第1例和第2例患者不同的是，該患者的一線和二線方案都含拉米夫定(3TC),治療過程中主要通過TAM2途徑形成多重耐藥TAMs,治療早期即出現(xiàn)高頻D67N、K70R,治療中T215F和K219Q頻率逐漸增加。治療中還形成不完整的第2種多重耐藥:69插入復(fù)合物，可以看到T69N/D從低頻到高頻的演變過程。NNRTIs類耐藥突變方面，患者在用藥后第1次隨訪即檢測到K103N和G190A,停用相應(yīng)藥物或換二線藥物，突變也始終存在。該患者在治療后第6次隨訪前使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，隨后就檢測到高頻的M46I(100.00%)、I47V/A(98.88%)、I84V(100.00%)和低頻V82A(1.16%);第7次隨訪時(shí),3種高頻突變維持不變,V82A未檢測到，但檢測到低頻G73S(1.03%)。

表6 第3例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第4例患者治療7個(gè)月后出現(xiàn)M184V突變并一直維持在整個(gè)治療過程中，換二線方案前未出現(xiàn)明顯的多重耐藥,TAM類突變僅有K219Q,而M41L和K70R一度出現(xiàn)低頻，但隨后消失。NNRTIs類耐藥突變方面，患者在用藥后第1次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,還出現(xiàn)一過性低頻K103N和V108I。該患者在第6次隨訪前才使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，更換方案后治療有效，病毒轉(zhuǎn)陰。在整個(gè)治療過程中，未監(jiān)測到高頻PIs類突變，僅在第2次隨訪時(shí)檢測到一過性的低頻PIs類K20R(14.15%),第4次隨訪時(shí)檢測到一過性的低頻PIs類I84V(1.69%)。

第5例患者治療2個(gè)月后出現(xiàn)M184V突變并一直維持在整個(gè)治療過程中，治療中通過TAM2途徑形成TAMs突變，但出現(xiàn)時(shí)間較第3例患者更晚，在第3次隨訪后逐漸形成，換二線方案前未出現(xiàn)明顯的多重耐藥?；颊咴谟盟幒蟮?次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,治療中后期出現(xiàn)高頻K103N。在第6次隨訪前才使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，更換方案后治療有效，病毒轉(zhuǎn)陰。整個(gè)治療過程中未監(jiān)測到高頻PIs類突變。

3 討 論

HIV-1在宿主體內(nèi)不斷變異，形成了一個(gè)由高度同源而又各不相同的變異體組成的病毒群，即所謂的準(zhǔn)種。由于耐藥突變的適應(yīng)性代價(jià)，耐藥準(zhǔn)種在治療前一般以低比率劣勢(shì)準(zhǔn)種的形式存在，在藥物選擇壓力下，劣勢(shì)耐藥準(zhǔn)種具有生長優(yōu)勢(shì)，會(huì)被篩選出來，逐漸變成體內(nèi)優(yōu)勢(shì)病毒株，這被認(rèn)為是治療失敗的主要原因。掌握劣勢(shì)耐藥準(zhǔn)種分子進(jìn)化規(guī)律對(duì)制訂耐藥監(jiān)測方案有重要意義，但由于受到檢測劣勢(shì)突變的方法學(xué)限制，在這方面的研究較少。既往研究[7-9]大多采用的是克隆RT-PCR產(chǎn)物測序法、單基因組擴(kuò)增法、等位基因特異性PCR法等，但都不能很好地體現(xiàn)比率<20%的“劣勢(shì)準(zhǔn)種”，因此無法掌握耐藥突變?cè)缙诘陌l(fā)生發(fā)展規(guī)律。本研究成功運(yùn)用高通量測序方法，檢測出比率<1%的HIV“劣勢(shì)準(zhǔn)種”，觀察到耐藥準(zhǔn)種從極低占比開始逐漸發(fā)展為高占比優(yōu)勢(shì)毒株的過程，這將為臨床制訂恰當(dāng)?shù)哪退幈O(jiān)測方案提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 NRTIs類耐藥突變的進(jìn)化規(guī)律

NRTIs是首類被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)的藥物，也是目前應(yīng)用得最多的一類藥物。本研究的一線和二線方案中均包含3TC,本研究的5例患者均在治療后第1次隨訪時(shí)就出現(xiàn)M184V,第5例患者更是在啟動(dòng)治療2個(gè)月后即檢測到了這一突變，提示耐藥監(jiān)測的時(shí)間應(yīng)適當(dāng)提前。本研究還發(fā)現(xiàn)的顯著特征是M184V的頑固性，作者觀察到M184V一旦出現(xiàn)后，就會(huì)一直維持在整個(gè)治療過程中，即使停用3TC也不會(huì)消失，例如第1例患者停藥達(dá)29個(gè)月，第2例患者停藥達(dá)21個(gè)月，但仍然能繼續(xù)檢測到M184V突變。一線方案中的另一種NRTI藥物是胸苷類似物齊多夫定(AZT)或司他夫定(D4T),其選擇出來的耐藥突變主要是TAMs,TAMs促進(jìn)焦磷酸水解，并參與AZT和的D4T的切除[10-11]。TAMs的形成是不斷積累的過程，其在HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸變化包括2個(gè)不同的的途徑:TAM1途徑(M41L、L210W、T215Y,偶見D67N)和TAM2途徑(D67N、K70R、T215F、K219E/Q)[12]。作者觀察到第1、3、4、5例患者是TAM2路徑，第2例患者是TAM1途徑。借助于低頻突變的檢測，本研究從第2例患者身上發(fā)現(xiàn)2種不同途徑的進(jìn)化模式，即在用藥初期時(shí)所有6種突變TAMs都會(huì)產(chǎn)生，但存在競爭關(guān)系，其中一種途徑的突變會(huì)占上風(fēng)，頻率逐漸增加，而另一種途徑的突變會(huì)被淘汰。但是2種不同途徑的突變并不是絕對(duì)不相容的，隨著治療時(shí)間的延長，不同途徑的突變也會(huì)發(fā)生組合，例如第3例患者前期只有途徑2的突變，第6次隨訪后累加途徑1的突變(M41L),其原因可能是這位患者當(dāng)時(shí)已經(jīng)持續(xù)使用了5年的D4T。

3.2 NNRTIs類耐藥突變進(jìn)化規(guī)律

與其他類耐藥顯著減少復(fù)制適應(yīng)性不同的是,NNRTIs的單核苷酸的變化就可能導(dǎo)致高水平耐藥性，同時(shí)只有輕微的復(fù)制適應(yīng)性損失[13]。本研究觀察到5例患者中只有第3例患者在用藥后期累積了4種突變，其他4例患者都只有1～2種突變。既往報(bào)道中，一般主要的NNRTIs突變包括:K103N、V106A/M、A98G、Y181C/I,但本研究觀察到的是G190A幾乎“一枝獨(dú)秀”，其特點(diǎn)和此前討論的M184V類似，出現(xiàn)的時(shí)間極早、持續(xù)時(shí)間極長、停藥后不消失，似乎在CRF01-AE亞型中,G190A的競爭優(yōu)勢(shì)非常明顯。因?yàn)?，通過高通量測序可以發(fā)現(xiàn)治療過程中其他突變通常只會(huì)低頻出現(xiàn)，大多數(shù)隨即消失，只有少數(shù)逐漸累積到耐藥中,G190A的這種適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象在之前的報(bào)道中未被提及。有學(xué)者[14-15]分析中國治療失敗的HIV感染者耐藥變異結(jié)果,NRTI類最多的是M184V(42.7%),NNRTI類最多的是G190A(23.4%),與本研究結(jié)果一致,5例患者都存在M184V+G190A的基本組合，說明這種組合有治療失敗的預(yù)警價(jià)值。關(guān)鍵的是，作者發(fā)現(xiàn)這2種突變都是非常迅速地出現(xiàn)，都在治療后第1次隨訪就可以檢測到，說明了及早進(jìn)行耐藥監(jiān)測的重要性。

5例患者更換相同的二線方案后,3例無效,2例病毒轉(zhuǎn)陰，換藥有效。與患者開始二線方案前的耐藥情況比較發(fā)現(xiàn)不同之處在于換藥前是否存在針對(duì)NRTIs類的多重耐藥突變，第1例患者有Q151M多重耐藥復(fù)合體，第2例患者有TAM1途徑耐藥組合，第3例患者有T69插入多重耐藥復(fù)合體，其都出現(xiàn)換藥失敗，而第4、5例患者未發(fā)現(xiàn)這些多重耐藥突變，二線治療獲得成功。因此，耐藥監(jiān)測對(duì)用藥及一線方案失敗后更換二線治療方案具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究應(yīng)用高通量測序方法初步闡明了CRF01-AE亞型患者在接受抗病毒治療過程中pol基因區(qū)耐藥突變的分子進(jìn)化規(guī)律，這對(duì)準(zhǔn)確監(jiān)測耐藥發(fā)生并確保提供適當(dāng)?shù)囊痪€藥物方案有重要意義。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，隨訪間隔時(shí)間過長，特別是治療初期沒有盡早開展耐藥檢測，對(duì)完全掌握耐藥突變的進(jìn)化規(guī)律會(huì)造成一定的影響，今后的研究中還需改進(jìn)。