動(dòng)物源抗菌肽治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的研究進(jìn)展

郭停停,陸超榕,高 潔,開龍?chǎng)?孫曉利, 楊厲穎,焦紅梅,孔桂美,李國(guó)才,3

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225009;2.江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州,225009;3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州,225001)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab)是一種革蘭陰性、非發(fā)酵、過氧化氫酶陽(yáng)性和氧化酶陰性的芽孢桿菌[1]。鮑曼不動(dòng)桿菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，主要發(fā)生在免疫功能低下的患者中，具有很高的發(fā)病率和死亡率[2]。此外，鮑曼不動(dòng)桿菌極易形成生物被膜，而抗生素的濫用又會(huì)導(dǎo)致多種菌株對(duì)多類抗生素產(chǎn)生耐藥性[3]。

抗菌肽(AMPs)是一種短肽，結(jié)構(gòu)繁多，長(zhǎng)度一般小于100個(gè)氨基酸，是由核糖體合成的天然抗生素，具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)揮抗菌活性、抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)等作用。與常用抗生素相比,AMPs對(duì)多種耐藥菌株表現(xiàn)出較低的耐藥性、快速殺傷作用、廣譜活性和顯著的臨床療效[4]。

抗菌肽的類別主要包括動(dòng)物來源抗菌肽、微生物來源抗菌肽和植物來源抗菌肽。動(dòng)物抗菌肽主要包括哺乳動(dòng)物源抗菌肽、兩棲動(dòng)物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽。人源抗菌肽作為哺乳動(dòng)物源抗菌肽的成員，因其物種特點(diǎn)，在臨床使用中不容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性以及排異反應(yīng)，更具備優(yōu)先發(fā)展成為新型抗菌藥物的潛力。兩棲類動(dòng)物中的組織蛋白酶抑制素(Cathelicidins)家族抗菌肽具有高效廣譜的抗菌活性，相比其他動(dòng)物源抗菌肽而言，這一類抗菌肽更具獨(dú)特性，比如特殊的酶作用、強(qiáng)修復(fù)活性等[5]。因此，研究?jī)蓷悇?dòng)物中的Cathelicidins家族抗菌肽對(duì)動(dòng)物免疫學(xué)和新藥研發(fā)都具有重要意義。昆蟲源抗菌肽在治療哺乳動(dòng)物疾病的過程中具有極大潛能[6]。本文對(duì)人源抗菌肽、兩棲動(dòng)物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 人源抗菌肽

人源抗菌肽主要由Cathelicidins、防御素(Defensins)和富組蛋白(Histains)組成。

1.1 Cathelicidins

LL-37是人體內(nèi)抗菌肽Cathelicidins家族的唯一成員,LL-37是目前被研究最多的一種抗菌肽。LL-37是Cathelicdin肽Hcap-18的C末端切割產(chǎn)物，該抗菌肽包含37個(gè)氨基酸[7],LL-37與LPS的相互作用是其抗菌作用的主要機(jī)制。LPS的結(jié)構(gòu)重塑可增加革蘭陰性菌(如腸道沙門氏菌)對(duì)LL-37的耐藥性[8]。

最低抑菌濃度和最低生物膜根除濃度試驗(yàn)[9]表明LL-37可降低鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成能力，或可成為治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的潛在治療方法。在最低抑菌濃度的測(cè)定過程中，LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的最低抑制濃度(MIC)為16～32 μg/mL。最低生物膜根除濃度(MBEC)實(shí)驗(yàn)[10]表明，LL-37在32 μg/mL對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜不僅有抑制作用，也有分散作用。LL-37截短片段在濃度為64～128 μg/mL時(shí)對(duì)生物膜有抑制作用。KS-30是LL-37的截短片段，能在64 μg/mL的濃度下有效分散生物膜。因此，該類抗菌肽對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有顯著的抗菌和抗生物膜活性，并且無細(xì)胞毒性[10]。

鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白A (OmpA)通過OmpA樣結(jié)構(gòu)域參與鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性[11]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)[12]表明，LL-37除了可以對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜有抑制和分散作用之外，還可以結(jié)合鮑曼不動(dòng)桿菌的OmpA 蛋白。以BA-LL37為探針，在野生型菌株中檢測(cè)到OmpA信號(hào)，但OmpA缺失菌株中未發(fā)現(xiàn)該蛋白，驗(yàn)證了二者的相互作用。因此,LL-37也可以通過與OmpA蛋白結(jié)合來拮抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

1.2 Defensins

Defensins是先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)效應(yīng)成分，具有廣泛的抗菌活性，是哺乳動(dòng)物防御系統(tǒng)中具有殺菌能力的組分。Defensins和帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜之間的靜電相互作用是殺死細(xì)菌的主要機(jī)制[13]。人類有2種防御素，即α-防御素和β-防御素(hBDs)。根據(jù)表達(dá)模式和遺傳結(jié)構(gòu)，α-防御素可進(jìn)一步細(xì)分為髓系(HNP1-4)和腸系(HD5和HD6)。α-防御素是一種豐富的抗菌肽，具有廣泛、強(qiáng)效的抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒活性[14]。HNP1-4主要由中性粒細(xì)胞表達(dá)，但也可在單核/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、部分T細(xì)胞、B細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞(DCs)中表達(dá)[15]。人防御素5 (HD5)是一種α-亞家族肽，能夠在體內(nèi)滅活致病菌，是一種潛在的能夠消除多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的殺菌劑。HD5是一種32位殘基陽(yáng)離子肽，由3個(gè)二硫鍵提供特定的構(gòu)象[16],主要在腸帕內(nèi)特細(xì)胞中檢測(cè)到，因其已經(jīng)進(jìn)化出了抑制病原體的能力，因此是拮抗MDR Ab的潛在候選者。HD5d5是由二硫鍵還原和引入精氨酸構(gòu)建的HD5的簡(jiǎn)化衍生物，能夠結(jié)合并穿透MDR Ab膜，通過災(zāi)難性的崩潰和代謝中斷導(dǎo)致細(xì)菌死亡。HD5d5對(duì)MDR Ab具有強(qiáng)大的抗菌活性，因此是一種有希望在臨床環(huán)境中拮抗MDR Ab的候選藥物[16]。

人hBDs是上皮細(xì)胞來源的陽(yáng)離子AMPs,在先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間起橋梁作用。通過檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)原代口腔和皮膚上皮細(xì)胞hBD-2和hBD-3的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)hBD-3的誘導(dǎo)作用大于對(duì)hBD-2的誘導(dǎo)作用。研究[17]顯示,hBDs可以通過輔助和化學(xué)吸引T細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)適應(yīng)性免疫。鮑曼不動(dòng)桿菌感染氣道上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)hBD-2的產(chǎn)生。通過研究2株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)原代口腔和皮膚上皮細(xì)胞hBD-2和hBD-3的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)hBD-3優(yōu)先以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)依賴的方式誘導(dǎo)。雖然這兩種抗菌肽對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌都有抗菌活性，但hBD-3更有效，可能是因?yàn)槠鋬絷?yáng)離子電荷高于hBD-2。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌AB0057和ATCC 17978進(jìn)行藥敏試驗(yàn),hBD-2和hBD-3對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌均表現(xiàn)出濃度依賴性的殺滅作用,hBD-3在0.062 5 μmol/L濃度下幾乎完全殺滅了這2株鮑曼不動(dòng)桿菌[18]。

2 兩棲動(dòng)物源抗菌肽

兩棲動(dòng)物源抗菌肽是指來源于蛙類皮膚的抗菌肽，這些肽構(gòu)成了先天免疫系統(tǒng)的組成部分以抵抗微生物的入侵，也可以在阻止捕食者捕獵的方面發(fā)揮作用。該種抗菌肽具有多樣性，表現(xiàn)在不同種類的兩棲動(dòng)物皮膚中有不同種類的抗菌肽。兩棲動(dòng)物源抗菌肽在醫(yī)藥、食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用，尤其在臨床上的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。

2.1 馬蓋寧(Magainin)及其類似物培西加南(Pexiganan)

馬蓋寧(Magainin)是由非洲爪蟾的皮膚中分離出來的抗肽素，有Magainin-1和 Magainin-2,都具有抗不動(dòng)桿菌活性，但Magainin-2抗菌活性更強(qiáng)。研究[19]報(bào)道Magainin-2在4.9～64 μg/mL的濃度下抑制鮑曼不動(dòng)桿菌敏感菌株和耐藥菌株的生長(zhǎng)，而Magainin-1需要達(dá)到256 μg/mL才能發(fā)揮相同效果。Magainin-2對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT)無細(xì)胞毒性及溶血活性，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜有明顯的抑制和消除作用。上述結(jié)果表明,Magainin-2是一種有效的抗鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌和抗生物膜制劑。

在發(fā)現(xiàn)Magainin-2后，研究者試圖通過改變氨基酸序列來提高肽的抗菌活性和穩(wěn)定性，此后Pexiganan和MSI-78被研發(fā)出來[20]。Pexiganan具有很高的抗鮑曼不動(dòng)桿菌活性，在1～8 μg/mL濃度下能抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感和耐藥臨床分離株的生長(zhǎng)[21]。Pexiganan對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性表明誘導(dǎo)100%溶血的最低濃度為250 μg/mL[22],遠(yuǎn)低于許多菌株的MIC。這說明Pexiganan對(duì)紅細(xì)胞具有高選擇性，因此毒性較低。MSI-78已完成了臨床試驗(yàn)Ⅲ期階段，雖然美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)還沒有批準(zhǔn)MSI-78的臨床使用，但其仍然是迄今為止最好的用于治療的AMPs。臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及肽生產(chǎn)的改進(jìn)都將大大增加FDA批準(zhǔn)Pexiganan進(jìn)入臨床使用的可能性[23]。

2.2 布萊溫素-2(B2RP)相關(guān)肽

B2RP是從水貂蛙和匠蛙的皮膚分泌物中分離出來的，具有廣譜抗菌活性，但其治療潛力受到中度溶血活性的限制。B2RP具有抗病毒活性，特別是保護(hù)細(xì)胞免受HIV-1感染。B2RP能在29.0 μg/mL濃度下抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)，但在7.0～13.9 μg/mL濃度下對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果更好[24]。該肽導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)抑制或細(xì)菌死亡的機(jī)制可能是在目標(biāo)細(xì)胞附近形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致磷脂雙分子層的擾動(dòng)。由于這種肽對(duì)人紅細(xì)胞有著中等毒性，所以其應(yīng)用受到了極大的限制。為了解決這一局限性，科學(xué)家想出了氨基酸替代的方法。目前研究人員已經(jīng)制造了一種類似于這種肽的物質(zhì)，替代位置為4、16和18 (D4K,K16A,L18K),結(jié)果是抗鮑曼不動(dòng)桿菌活性提高了2倍且溶血活性降低。研究[25]稱替代模式D4K的B2RP類似物可以抑制敏感的和黏菌素耐藥菌株，也可以抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的XDR分離株。

3 昆蟲源抗菌肽

昆蟲源抗菌肽主要包含蜂毒肽(Melittin)、天蠶素(Cecropins)、昆蟲類防御素、富含脯氨酸的抗菌肽等，這類抗菌肽主要針對(duì)革蘭陰性細(xì)菌。將這些分子引入市場(chǎng)是一個(gè)較大的挑戰(zhàn)，例如作為藥物將會(huì)是一種具有成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。昆蟲源性肽主要有免疫活性肽、肽激素和毒液中的肽[26],其中蜂毒肽屬于毒液中的肽，天蠶素屬于免疫活性肽。

3.1 Melittin

Melittin是蜜蜂毒液的主要成分[26],具有10～14個(gè)氨基酸，其中包括獨(dú)特的疏水氨基酸和兩親α-螺旋構(gòu)象，其是一種多功能肽，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒和抗癌特性[27]。蜂毒肽具有較強(qiáng)的抗不動(dòng)桿菌活性，在0.125～2.000 μg/mL濃度下可以抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的MDR和XDR臨床分離株[28]。蜂毒肽對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有一定的殺菌活性，且細(xì)胞黏附分子的殺菌活性不受莢膜存在的影響。采用掃描電鏡觀察分析[29]發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽和黏菌素在0.125～0.250 μg時(shí)的協(xié)同作用完全抑制了生物膜的形成，對(duì)耐黏菌素鮑曼不動(dòng)桿菌分離株具有快速的殺菌作用，因此蜂毒肽可以作為克服鮑曼不動(dòng)桿菌多黏菌素耐藥性的有前途的替代方案。研究[30]表明，蜂毒肽在無毒劑量下與多酚青霉烯、頭孢他啶協(xié)同作用，可作為外用藥物治療MDR細(xì)菌引起的燒傷感染。

3.2 天蠶素

Cecropins最初是從巨型蠶蛾的血淋巴中分離出來的[31],其主要是由鱗翅目和雙翅目昆蟲中分離到的大量抗菌和有毒肽組成，構(gòu)成了昆蟲無細(xì)胞免疫的主要組成部分。Cecropins是一種小蛋白質(zhì)，約有35個(gè)氨基酸殘基，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌都有活性。天蠶素可以溶解細(xì)菌細(xì)胞膜，也可以抑制脯氨酸的攝取，并導(dǎo)致細(xì)胞膜滲漏[32]。

3.2.1 天蠶素A(Cecropin A):Cecropin A是一種具有穩(wěn)定α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽。天蠶素A可顯著降低還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和谷胱甘肽水平，通過形成活性氧簇(ROS)進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[33]。臨床研究[34]表明,Cecropin A能在0.5～32.0 μg/mL時(shí)抑制鮑曼不動(dòng)桿菌活性。研究[35]還表明,Cecropin A能分別在32 μg/mL和256 μg/mL濃度下抑制鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株和黏菌素耐藥株的生長(zhǎng)。

從埃及伊蚊中分離到的抗菌肽BR003-天蠶素A(BR003-Cecropin A)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制活性高于其他抗菌肽，在4.5 μg/mL濃度下對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感和耐多藥菌株具有抑制作用，其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞膜的通透性可能是其殺菌的潛在機(jī)制[36]。

Cec是家蠅產(chǎn)生的天蠶素家族基因，其中Cec4的抑菌活性更為廣譜，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌效果非常強(qiáng)[37]。Cec4能在24 h內(nèi)快速、濃度依賴性地殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌。此外，掃描電鏡分析[37]表明Cec4通過破壞細(xì)胞膜完整性來殺菌。

3.2.2 Mdc:Mdc是一種從家蠅幼蟲中提取的新型天蠶素抗菌肽，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌標(biāo)準(zhǔn)株均有較強(qiáng)的抑制活性[38]。Mdc的MIC為4 μg/mL,其殺菌動(dòng)力學(xué)顯示對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌快速滅活需30 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果[38]表明,Mdc誘導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞膜通透，且其作用時(shí)間與濃度有關(guān)。透射電鏡檢查顯示,Mdc能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致必要的細(xì)胞質(zhì)成分外排。本研究中抗菌肽及其氨基酸序列見表1。

表1 本研究中抗菌肽及其氨基酸序列

4 總結(jié)與展望

本文主要闡述了人源抗菌肽、兩棲動(dòng)物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽在治療鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染中的作用及其機(jī)制。目前有關(guān)抗菌肽藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)方面的研究還比較少，大多數(shù)的抗菌肽試驗(yàn)只適用于局部治療，比如LL-37的應(yīng)用[39]。目前，已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的抗菌肽有乳鏈菌肽、源于Magainin的MSI-78及源于protegin的IB-367,用于治療局部感染。因此，要在臨床上更多地使用抗菌肽時(shí)，還要解決好它的毒性、免疫原性、應(yīng)用方法、藥物制劑等方面的問題。

抗菌肽的另一種潛在的應(yīng)用是與抗生素共同給藥?？咕穆?lián)合抗生素治療可減少抗生素耐藥性的發(fā)生。此外，許多研究已觀察到抗菌肽和抗生素之間的體外協(xié)同作用[40]。當(dāng)藥物聯(lián)合使用時(shí)，以更低的劑量可以減少毒性或不良副作用。本文可指導(dǎo)抗菌肽在控制臨床感染中的應(yīng)用，并為新型抗菌肽的研發(fā)提供思路。