紅菊苣花色素純化工藝研究及組分分析

孫飛龍，寧景葉，王鳳娟，原 龍，朱 琳

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

0 引 言

赤色葉球的紅菊苣也稱為結(jié)球紅菊苣和軟化白菊苣，是一種食藥同源的無公害蔬菜[1]，具有較高的抗氧化活性，有利尿消腫、清肝利膽、健胃解膩等功效[2-3]，可用于預(yù)防心血管疾病、癌癥和延緩衰老[4-6]。

花色素富含酚類物質(zhì)，具有保健功效和營養(yǎng)作用，常用于食品著色、衣料染色、化妝品上色及醫(yī)藥等方面[7-9]?；ㄉ卦诩t菊苣中含量豐富，經(jīng)粗提物提取獲得的花色素含有較多的小粉、果膠、卵白和易分解的糖等雜物，影響并限制了花色素的質(zhì)地和純度[10-12]。為了提煉優(yōu)質(zhì)和雜物少的花色素，提高紅菊苣花色素的產(chǎn)量和質(zhì)量，需對粗提物進行提純。多孔微球吸附因工藝簡單、成本低廉、分離效率高、不和糖類相互作用、洗脫容易等優(yōu)點在花色素的眾多純化方法中脫穎而出[13-15]。本文采用動靜態(tài)吸附及解析實驗分析多孔微球法純化紅菊苣花色素的最佳工藝，并采用高效液相色譜分析其組成,探究多孔微球?qū)t菊苣花色素的提純效果。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 新鮮紅菊苣(市場所售)；8種型號多孔微球(AB-8、D-280、HPD300、HPD600、X-5、D101、D3520)、聚酰胺(源辰化工材料有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品(矢車菊-3-O-葡萄糖苷，成都曼斯特生物科技有限公司)；氫氧化鈉(NaOH,四川西隴試劑有限公司)；鹽酸(HCl,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鉀(K2HPO4，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(CA，西安百盛化工有限公司)；丙酮(C3H6O,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(C2H6O,天津廣成化學(xué)試劑有限公司)；氯化鉀(KCl，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(H3PO4，天津恒興化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(CH3OH,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；以上試劑均為分析純，無菌水為實驗室自制。

1.1.2 儀器 超聲波清洗機(SK5200LHC，超聲儀表上?？茖?dǎo)有限公司)；電熱恒溫水箱(W13-40，天津泰斯特器械有限公司)；真空干燥箱(DJ-IBC，天津泰斯特器械有限公司)；分光光度計(可見光722，上海精密科學(xué)儀表有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGF-1AB立式，天津泰斯特儀器有限公司)；電子天平(托利多-梅特勒儀器有限公司)；水式循環(huán)真空泵(SHA-D，鞏義英裕予華儀表廠)；精密酸度計(pH-3C，上海雷磁儀器廠)；渦旋混合儀(XW-80A，上海滬西分析儀器廠)；液相色譜儀(Agilent1200，美國Agilent公司)。

1.2 紅菊苣花色素純化工藝

1.2.1 制備粗提液 使用無菌水清洗紅菊苣，切成小塊，在60 ℃電熱鼓風(fēng)環(huán)境下干燥24 h后破碎，經(jīng)80目篩過濾。稱取紅菊苣粉末4 g，與體積分數(shù)為70% 的酸性乙醇(含0.1%鹽酸)在41 mL∶1 g的液固比條件下混勻，在40 kHz、200 W避光條件下超聲提取28 min，經(jīng)減壓過濾、濃縮得到粗提花色素液體，置于5 ℃冰箱中備用。

1.2.2 預(yù)處理多孔微球脂 在體積分數(shù)為95%乙醇的液體中浸入多孔微球24 h，當(dāng)樹脂脹大，排空微球中的空氣，用無菌水將其反復(fù)沖至無異味；再浸入體積分數(shù)為5%的HCl溶液中12 h，用流動的無菌水進行清洗；最后在體積分數(shù)為5%NaOH液體中浸入12 h，浸畢，用無菌水清洗并調(diào)節(jié)pH為7，多孔微球中殘存的單體化合物和防腐物質(zhì)經(jīng)過上述步驟可去掉[16]。

1.2.3 篩選最佳多孔微球 真空過濾多孔微球，在250 mL的燒杯中分別放入8種4 g多孔微球，再加入100 mL質(zhì)量濃度為110.89 mg/mL，pH=2.76未提純的花色素液體。在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃，速度120 r/min的條件下振蕩24 h。浸泡完全后，進行抽濾，用pH示差法計算濾液中所含花色素[17]的吸附率。

8種多孔微球經(jīng)過真空過濾，分別放4 g于250 mL燒杯中，加入100 mL體積分數(shù)為50%的乙醇，振蕩24 h，抽濾，測定花色素在濾液中的含量，計算解吸程度[18]。

多孔微球的反應(yīng)效率：

(1)

(2)

式中：C0為處理前樣液中紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL；C1為處理后濾液中紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL；C2為濾液解吸后紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.4 AB-8多孔微球靜態(tài)實驗 在150 mL定量瓶中放入8份2 g經(jīng)前處理的多孔微球，加入50 mL質(zhì)量濃度為110.89 mg/mL的粗提取液，在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃，速度120 r/min的條件下振蕩24 h，每隔0.5 h進行1次抽濾，測得溶液中所含花色素的量。

在150 mL容量瓶中放入6份2 g處理后的樹脂，設(shè)置好添加樣液的pH值梯度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)，在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃、速度120 r/min條件下振蕩24 h，待其充分吸入后，再進行抽濾，測得花青素溶解在濾液中的量，計算吸附率。

1.2.5 AB-8多孔微球動態(tài)實驗 1) 濃度影響。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，分別配制100 mL質(zhì)量濃度分別為64.87、108.29、153.79、197.21、249.76、304.08、341.33、378.88、432.34 mg/L未提純的樣液，流過柱內(nèi)速度為2 mL/min，測定流出液中所含花色素的量。

2) 流速影響。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，添加200 mL的未提純樣液，速度梯度分別為1、2、3 mL/min，測出流出液中所含花色素的量并計算吸附率。

3) 流出液體積。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，在柱內(nèi)以2 mL/min的速度加入吸光值A(chǔ)=1.654的花色素粗提取液，每隔20 min測量獲得液的吸光度值A(chǔ)+，A+=A/10開始記錄[19]，取5次數(shù)據(jù)求平均數(shù)，得到AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏討B(tài)吸附泄露曲線。

4) 乙醇解吸。濕法向柱內(nèi)裝入AB-8型多孔微球，用無菌水清理，再以2 mL/min的流速對100 mL不同體積分數(shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇進行清洗，測得洗脫液所含花色素的量并計算樹脂解吸效率。

5) 洗脫影響。濕法在柱內(nèi)裝入AB-8型多孔微球，先用無菌水清洗，再用速度為2 mL/min乙醇(60%)進行洗脫，每收集10 mL解吸液測定吸光值1次，當(dāng)解吸液吸光值不變時，停止上樣。

1.2.6 純化后色價測定 依照GB 6718—86測定紅菊苣中花色素色價，稱取1 g提純后的花色素細粉，用pH=3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖劑稀釋100倍。在520 nm波長下測定吸光值，保證吸光值在0.2～0.6之間，取5次數(shù)據(jù)求平均數(shù)。花青素色價計算公式[20]為

(3)

1.3 紅菊苣花色素組分

1.3.1 溶液配置及處理 流動相A：過濾甲醇采用0.45 μm微孔濾膜，超聲至無氣泡。流動相B：磷酸-蒸餾水體積比為0.3∶99.7；進樣液。用0.45 μm微孔濾膜過濾紅菊苣的花色素提純液[21]。

1.3.2 色譜條件及程序洗脫步驟 采用高效液相色譜法(HPLC)分析紅菊苣所含花色素的成分，采用程序洗脫法在0～35 min內(nèi)，用體積分數(shù)為25%的流動相A進行洗脫；在30～50 min內(nèi)，用體積分數(shù)為75%的流動相A進行洗脫；洗脫液體積為10 μL，洗脫流速1 mL/min，將520 nm的波長作為檢測波長，設(shè)置柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定多孔微球類型

在花色素中存在多個酚類基團，易與多孔微球中的原子團形成次級鍵，因此花色素在極性多孔微球中得到的吸收效果較好，但多孔微球表面積也會影響花色素的吸附效果。花色素自身的結(jié)構(gòu)有較強的極性與親水性，也可選用弱極性的多孔微球。多孔微球篩選結(jié)果如圖1所示。

圖1 多孔微球的篩選Fig.1 Selection of porous microsphere

從圖1可以看出，AB-8型多孔微球的吸附效率最高，解吸效率與D280型多孔微球差距較小，因此AB-8型多孔微球為最佳吸附微球，在處理過程中多孔微球中的原子團易與花色素形成次級鍵。

2.2 AB-8型多孔微球靜態(tài)實驗

2.2.1 確定靜態(tài)吸附/解吸平衡時間 靜態(tài)吸附/解吸動力曲線如圖2所示。

圖2 靜態(tài)吸附/解吸動力曲線圖Fig.2 Kinetic curve of static adsorption/desorption

從圖2可以看出，吸附率在0.5～1.0 h之間出現(xiàn)較大的波動，吸附率在2.5 h后趨于穩(wěn)定，多孔微球處于飽和吸附狀態(tài)，因此2.5 h被視作靜態(tài)的吸附時間。隨時間的增加解吸率也增加，1.5 h后達到穩(wěn)定，大都在多孔微球中吸附的花色素可以被解吸下來，所以選擇1.5 h作為靜態(tài)解吸時間。

2.2.2 上樣液pH對多孔微球吸附效率的影響 上樣液pH對多孔微球吸附效率的影響如圖3所示。

圖3 上樣液pH對多孔微球吸附率的影響Fig.3 Effect of pH of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖3可以看出，在pH=1～2區(qū)間內(nèi)，多孔微球?qū)ι蠘右旱淖饔弥饾u平穩(wěn)；但當(dāng)pH>2，尤其是在2～3之間時，作用效率迅速下降，因為紅菊苣花色素在較強酸性條件下，主要以陽離子的形式存在，易與弱極性的多孔微球相聯(lián)結(jié)，伴隨酸性的削減，花色素的存在形式在結(jié)構(gòu)比例上發(fā)生變化，干擾花色素與多孔微球的聯(lián)結(jié)，故選用pH=2的樣液。

2.3 AB-8型多孔微球動態(tài)實驗

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對多孔微球作用的影響 上樣液質(zhì)量濃度對多孔微球吸附率的影響如圖4所示。

圖4 上樣液質(zhì)量濃度對多孔微球吸附率的影響Fig.4 Effect of concentration of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖4可以看出，在紅菊苣花色素的質(zhì)量濃度不斷增加過程中，多孔微球的作用效果在304.08 mg/L之前平穩(wěn)上升并在341.33 mg/L達到最高，隨后開始減弱。因此太低的花色素含量減弱了多孔微球的作用；太高的花色素含量，使多孔微球吸收無用的雜物，從而干擾花色素流過多孔微球中的速度，導(dǎo)致上樣液過早泄露，減弱了多孔微球的作用效果，因此選擇質(zhì)量濃度為341.33 mg/L的樣液最佳。

2.3.2 上樣液流速對多孔微球吸附率的影響 隨著上樣液流過柱內(nèi)的速度下降，花色素和多孔微球的交匯時間延遲，效果顯著但導(dǎo)致效率衰減，實驗周期更長；增大速度會縮短樣液和多孔微球的接觸時間，效果越差；上樣流速對多孔微球吸附率的影響如圖5所示。

圖5 上樣液流速對多孔微球吸附率的影響Fig.5 Effect of flow rate of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖5可以看出，隨著流出液體積的不斷增加，吸附率不斷下降，并且上樣液的速率越小，吸附率下降越慢，因此越小的上樣液流速吸附效果越好，最佳上樣液流速為2 mL/min。

2.3.3 花青素泄露曲線測定 AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏討B(tài)吸附泄漏曲線如圖6所示。

圖6 AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏討B(tài)吸附泄漏曲線Fig.6 Dynamic adsorption-leakage curve of AB-8 porous microsphere for anthocyanins

從圖6可以看出，隨著流出液體積的增多，流出液的吸光度也呈遞增趨勢，在流出液體積為260 mL時，吸光度達到0.169，視作泄漏點，所以上樣量為260 mL。

2.3.4 乙醇濃度對多孔微球解吸的影響 實際上，解吸過程是用一種解吸液使花色素和多孔微球之間的相互作用力減弱。從AB-8微球中分離出花色素，但乙醇溶液濃度不同極性有差別，不同程度地干擾了相互作用力的效果。乙醇體積分數(shù)對多孔微球解吸的影響見表1。

表1 乙醇體積分數(shù)對多孔微球解吸的影響Tab.1 Effect of ethanol volume fraction on desorption of porous microsphere

從表1可看出，解吸率在乙醇溶液濃度較低時效果較差，乙醇溶液體積分數(shù)為60%時效果最好，之后解吸效果開始下降。所以在乙醇體積分數(shù)為60%時，最大解吸率為91.45%，因此將體積分數(shù)為60%的乙醇溶液作為解吸液。

2.3.5 洗脫曲線測定 紅菊苣花色素洗脫曲線如圖7所示。

圖7 紅菊苣花色素的洗脫曲線Fig.7 Elution curves of anthocyanidins of chicory red

從圖7可以看出，AB-8型多孔微球的洗脫峰較窄，大部分附著在多孔微球上的紅菊苣花色素?zé)o需用大量解吸液就被解吸。當(dāng)洗脫劑用量為100 mL時，附著于多孔微球上的花色素幾乎全部被解吸，所以選擇100 mL體積分數(shù)為60%的乙醇作為洗脫液。

2.4 紅菊苣花色素定性分析

在最優(yōu)條件下，選擇AB-8型多孔微球進行提純，測定紅菊苣花色素色價從5.3提升至49.1，是未純化的9.3倍。從顏色判斷,提純后紅菊苣的花色素液體表現(xiàn)為血色樣，由花色素的種類與顏色進行推斷，紅菊苣所含的花色素為矢車菊類的花色素。進行HPLC測定后，標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷與紅菊苣的供試樣品色譜圖對照如圖8所示。

從圖8(a)可以看出，標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷的出峰時刻為13.539 min；從圖8(b)可以看出，紅菊苣液體共含6種花色素，花色素的出峰時刻為13.609 min，接近于標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷的出峰時刻，可以斷定紅菊苣中的花色素以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為主。

(a) 矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)品色譜圖

3 結(jié) 論

1) 采用8種多孔微球?qū)Υ痔岬募t菊苣花色素液體進行純化。結(jié)果表明，AB-8多孔微球為最優(yōu)提純多孔微球。

2) 用AB-8多孔微球?qū)ㄉ剡M行提純，根據(jù)多孔微球的動、靜態(tài)吸附和解吸實驗結(jié)果，得出AB-8多孔微球提純的最佳工藝條件，可將花色素的色價從5.3升到49.1，達到未純化的9.3倍。

3) 采用HPLC分析紅菊苣花色素的組成成分，結(jié)果顯示紅菊苣含有6種花色素，其中矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量豐富。