不同品種柑橘葉際真核生物多樣性及青苔病原差異分析

楊蕾　洪林　張?jiān)瀑F等

中圖分類號(hào)：S 436. 66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020232

重慶具有悠久的柑橘種植歷史，是世界柑橘生產(chǎn)最適宜地區(qū)之一。柑橘產(chǎn)業(yè)位居重慶市特色水果產(chǎn)業(yè)之首，是助推重慶市精準(zhǔn)脫貧和實(shí)施鄉(xiāng)村振興行動(dòng)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。至2019年底全市柑橘種植面積約23. 33萬(wàn)hm²，產(chǎn)量超320萬(wàn)t，總產(chǎn)值近300億元，實(shí)現(xiàn)了柑橘種植面積和產(chǎn)量的連續(xù)13年增長(zhǎng)。品種作為重慶市柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的第一要素，現(xiàn)有種類較為齊全，主要由甜橙、雜柑、寬皮橘、柚、檸檬五大類組成，其中甜橙、雜柑兩大類的種植面積和產(chǎn)量分別約占總量的60%和63%。重慶生態(tài)條件獨(dú)特，小氣候特點(diǎn)鮮明，夏季炎熱冬季濕寒、寡日照時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)霜期長(zhǎng)、雨量充沛。這種氣候特點(diǎn)使得多種病蟲害在橘園內(nèi)普遍發(fā)生。而柑橘青苔就是一種受氣候影響極大且發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的病害。青苔滋生會(huì)阻礙柑橘的光合作用，導(dǎo)致柑橘樹勢(shì)衰退，造成果實(shí)品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響柑橘果實(shí)商品性。

復(fù)合侵染由2種、3種乃至更多種病原物共同引起，大豆、煙草、番茄、黃瓜、芒果等等多種植物上都存在因病原物復(fù)合侵染引起的病害。有學(xué)者研究認(rèn)為柑橘青苔的病原是虛幻球藻Apatococcus lo-batus和膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeospori-oides，而近期研究表明，柑橘青苔是由多種藻類和病原真菌復(fù)合侵染造成的。病原侵染寄主后，寄主內(nèi)的生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)有明顯的變化。柑橘青苔可能的主要病原生物的相對(duì)豐度隨病情等級(jí)的增加逐漸升高。在柑橘感染黃龍病后有病癥組中的Candidatus Liberibacter asiaticus的含量是無(wú)病癥組的200倍，從而確定C.Liberibacter asiaticus對(duì)黃龍病起關(guān)鍵作用。在病程的不同階段，寄主的內(nèi)生菌多樣性存在顯著差異。

作物病害生態(tài)系統(tǒng)（crop disease ecosystem）是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)子系統(tǒng)，主要由寄主、病原物及其所處的環(huán)境構(gòu)成，系統(tǒng)中的寄主抗病性、病原物毒性和環(huán)境（包括人的活動(dòng)）三者之間的相互作用，組成了不同的病害水平。總的來(lái)說(shuō)不同寄主植物的抗病機(jī)理有3種：形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的物理抗病性（physical resistance）、生理生化方面的化學(xué)抗病性（chemical resistance）以及兩者相互作用的共同抗病性。從植物微生態(tài)角度分析，植物微群落中，微種群數(shù)量越多則多樣性越高，植物生態(tài)系統(tǒng)的功能與結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越不易感病。植物病原真菌普遍存在，并且它們可以影響植物生理、生長(zhǎng)和產(chǎn)出。與此相對(duì)的，病原的傳播和侵染也會(huì)受到植物群落特征的調(diào)控：比如增加植物品種多樣性和地域多樣性可以降低病原的侵染力。在土耳其的不同地區(qū)不同栽培品種中引發(fā)橄欖黃萎病的病原類群有顯著差異，并且它們?cè)斐傻牟“Y及發(fā)病程度也不相同。在病原菌與寄主的協(xié)同作用中，病原有著復(fù)雜的再生系統(tǒng)，它會(huì)受到地域和品種的共同作用，同時(shí)研究表明病原菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和寄主在時(shí)間空間上的抗性有很強(qiáng)的相關(guān)性。有些病害病原菌的致病力和群落結(jié)構(gòu)等受地域的影響大于品種對(duì)它的影響，如在葡萄牙阿爾加韋地區(qū)橄欖炭疽病的病原群落結(jié)構(gòu)特征和葡萄牙其他地區(qū)或是世界其他地方的有明顯不同，并且在這個(gè)特定區(qū)域不論是野生種、地方種還是新栽培種的病原構(gòu)成相似度均較高。也有研究表明，寄主品種及其周圍環(huán)境中的其他物種類型會(huì)對(duì)病原產(chǎn)生影響：在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，寄主與病原的互作關(guān)系不僅與寄主植物本身有關(guān)，還與本土環(huán)境中存在的其他物種有關(guān);在森林中樹木種類的多樣性越豐富則病原的豐度和侵染力會(huì)越低，同時(shí)寄主植物比例對(duì)病原的影響不顯著而非寄主植物對(duì)病原有強(qiáng)烈的影響。

為了解不同區(qū)域和不同品種柑橘葉際生物的群落特征，探尋不同條件下有青苔病癥和無(wú)病癥柑橘葉片葉際真核生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)的差異，我們通過高通量測(cè)序的方法對(duì)重慶2個(gè)區(qū)縣6個(gè)品種的柑橘葉片進(jìn)行了葉際真核生物多樣性分析，以期明確地域和品種是否會(huì)對(duì)柑橘青苔病原類型產(chǎn)生影響，從而為針對(duì)性進(jìn)行柑橘青苔病防治提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料和采樣地點(diǎn)

以3個(gè)甜橙品種‘塔羅科血橙‘紐荷爾‘卡拉卡拉紅肉臍橙（簡(jiǎn)稱卡拉卡拉）和3個(gè)雜柑品種‘沃柑‘春見‘W·默科特為研究對(duì)象，在忠縣和開州選擇管理水平相似、海拔相近的果園分別采集6個(gè)品種有病癥和無(wú)病癥的柑橘葉片樣品共24份。樣品信息見表1。

1.2真核生物基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

柑橘葉片不經(jīng)前處理直接用天根組織DNA提取試劑盒抽提柑橘葉表真核生物的基因組DNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量。要求濃度≥10ng/μL，總量≥500 ng，純度OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.7～2.0。取3μL質(zhì)量合格的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為120 V，電泳時(shí)間約為20 min，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察DNA樣品的完整性。

1.3柑橘葉際真核生物基因組DNA擴(kuò)增及純化

以提取的24份柑橘葉表樣本基因組DNA 為模板對(duì)其18SrRNA 的V4區(qū)進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（10μL）為10×Top狋犪狇Buffer1μL，dNTPs0.8μL，上、下游引物各0.2μL，DNA 模板2μL，DNA 聚合酶0.2μL，補(bǔ)充ddH2O 至10μL。反應(yīng)程序：94℃2min;94℃20s，55℃ 30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以膠孢炭疽菌基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增引物根據(jù)18SrRNA V4檢測(cè)區(qū)域確定，具體序列為：EK NSF573：5′CGCGGTAATTCCAGCTCCA3′，EK NSR951：5′TTGGYRAATGCTTTCGC3′。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一和特異。將

1.4序列數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用FastQC評(píng)估原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量指標(biāo)，通過FASTX-Toolkit對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除未識(shí)別堿基和低質(zhì)量序列。使用FLASH（version 1.0.0）程序進(jìn)行拼接，用FASTX-Toolkit軟件將有barcode標(biāo)記的引物從混合樣品中分離。使用UChime（version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。計(jì)算DNA矩陣，運(yùn)用UPARSE程序在97%的序列相似度水平下對(duì)序列進(jìn)行OTU劃分。RDP-Classifer軟件分析設(shè)置置信度參數(shù)為50%。一般認(rèn)為遺傳距離小于3%的序列對(duì)應(yīng)微生物屬于同一物種。用R語(yǔ)言vegan程序包完成多樣性分析，其中用線性判別分析|LDA|>2且P<0. 05作為閾值評(píng)估差異顯著的物種的效應(yīng)值，得到組間豐度有顯著差異的物種，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

采用IBM SPSS Statics 21軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，并應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)不同處理間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1柑橘葉際真核生物群落基本組成

24份柑橘葉片樣本共獲得3916 232條高質(zhì)量序列片段，總堿基數(shù)為1 350 500 811個(gè)，平均長(zhǎng)度為344. 85 bp，共檢測(cè)到491個(gè)OTUs。在生物多樣性和群落調(diào)查中，稀釋曲線（rarefaction curve）被廣泛用于判斷樣品量是否充分以及估計(jì)物種豐富度。從圖1可以看出，24份樣品對(duì)應(yīng)的稀釋曲線均基本趨于平緩，測(cè)序深度基本符合后續(xù)分析要求，實(shí)際環(huán)境中真核生物群落結(jié)構(gòu)的置信度較高，能夠比較真實(shí)地反映出樣品的群落特征。從物種注釋統(tǒng)計(jì)表（表2）可以看出，開州無(wú)病癥‘塔羅科血橙組（KTN）鑒定到的真核生物類型最多，有179個(gè)門、173個(gè)綱、165個(gè)目、140個(gè)科、182個(gè)屬、207個(gè)種，而開州無(wú)病癥‘W.默科特組（KWN）的真核生物種類最少，有86個(gè)門，78個(gè)綱、73個(gè)目、56個(gè)科、77個(gè)屬、87個(gè)種;總體上兩地區(qū)6個(gè)品種的有病癥組的真核生物種類數(shù)量明顯多于無(wú)病癥組。

2.2柑橘葉際真核生物群落結(jié)構(gòu)

從不同分類水平下的多樣本物種組成圖（圖2）可以看出，優(yōu)勢(shì)門包含鏈形植物門Streptophyta、子囊菌門Ascomycota、綠藻門Chlorophyta和擔(dān)子菌門Basidiomycota，其中鏈形植物門主要是寄主植物柑橘的序列;優(yōu)勢(shì)綱包含座囊菌綱Dothideomycetes、共球藻綱Trebouxiophyceae、散囊菌綱Eurotiomycetes、子囊菌綱Sordariomycetes等;優(yōu)勢(shì)目包含煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、刺盾炱目Chaetothyriales、小球藻目Chlorellales等;優(yōu)勢(shì)科包括Cladosporiaceae、Phaeosphaeriaceae、Trichomeriaceae、鎖擲酵母科Sporidiobolaceae、小球藻科Chlorellaceae等;優(yōu)勢(shì)屬包含枝孢菌屬Cladosporium、橡膠藻屬Heveochlorella、杯梗孢屬Cyphellophora、Parast-agonospora、Knufia等;優(yōu)勢(shì)種包含Cladosporiumherbarum、Sporidiobolus pararosus、Knufia petrico-la、Heveochlorella hainangensis、Parastagonosporaavenae、Cyphellophora sessilis等。

將所有樣本中相對(duì)豐度大于1%的物種繪制物種總豐度柱狀圖（圖3），該圖顯示了在種分類水平下，所有樣本中整體豐度較高的物種及其相對(duì)豐度。結(jié)果顯示，除去柑橘和未知種外，共有28個(gè)種的相對(duì)豐度較高，其中相對(duì)豐度最高的3個(gè)種為C.herba-rum （12. 41%）、uncultured Apatococcus（5.41%）、S.pararoseus（4. 32%）。

2.3柑橘葉表真核生物多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是常用的描述群落物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，這些指數(shù)可以對(duì)群落物種組成的豐富度和均勻度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，Chaol數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon值越大說(shuō)明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大群落多樣性越低。從這些指數(shù)（表3）可以看出，柑橘葉片真核生物的多樣性較為豐富，其中Chaol指數(shù)最高和最低的分別是開州無(wú)病癥‘塔羅科血橙（KTN）和開州無(wú)病癥‘W·默科特（KWN），Shannon指數(shù)最高和最低的分別是開州有病癥‘W·默科特（KWY）和開州無(wú)病癥‘W·默科特（KWN），Simpson指數(shù)最高和最低的分別是開州無(wú)病癥‘W·默科特（KWN）和忠縣有病癥‘卡拉卡拉（ZKY）。

2.3.2組間OTU構(gòu)成分析

Venn圖可以統(tǒng)計(jì)OTU水平中多組樣本中所共有或獨(dú)有的物種數(shù)目，可以反映各個(gè)環(huán)境樣品在物種組成上的相似性及重疊情況。共同含有的OTU數(shù)量越多說(shuō)明多樣品間的生物群落組成相似度越高。通過Venn圖（圖4）可以看出，4個(gè)不同區(qū)組柑橘葉表包含共有的真核生物OTUs是145個(gè)，2個(gè)甜橙組含有的特異OTUs個(gè)數(shù)較多，2個(gè)雜柑組含有特異OTUs個(gè)數(shù)較少，其中忠縣雜柑組含特異OTUs個(gè)數(shù)最少，僅為28個(gè)。從地域來(lái)看，忠縣甜橙和雜柑共有的OTUs為201個(gè)，忠縣甜橙特有OTUs 105個(gè)，忠縣雜柑特有OTUs 54個(gè);開州甜橙和雜柑共有的OTUs為212個(gè)，開州甜橙特有99個(gè)OTUs，開州雜柑特有79個(gè)OTUs。從品種類型來(lái)看，兩地甜橙共有OTUs為209個(gè)，雜柑共有OTUs 178個(gè);忠縣甜橙特有（OTUs 97個(gè)，開州甜橙特有（OTUs 102個(gè);忠縣雜柑特有OTUs77個(gè)，開州雜柑含有特有OTUs最多，為113個(gè)。

2.3.3樣本聚類分析

樣本聚類樹可以從整體上描述和比較樣本/分組間的相似性和差異性，越相似的兩個(gè)樣本會(huì)優(yōu)先聚類。將上述4個(gè)分組按有病癥和無(wú)病癥分成兩個(gè)亞組（如將A分成Al有病癥組和A2無(wú)病癥組）。從圖5可以看出，除少數(shù)樣本外，總體而言無(wú)病癥組和有病癥組分別聚為一類，并且同一采樣區(qū)縣同一種類品種也大多聚為一類。

2.3.4 Lefse分析

基于線性判別分析（LDA）的效應(yīng)量判定方法（Lefse）支持高維分類比較，可用于篩選最可能解釋組間差異的物種。

由圖6可以看出，組間物種構(gòu)成有顯著差異的樣本是A1（忠縣甜橙有病癥組）、B2（忠縣雜柑無(wú)病癥組）、C1（開州甜橙有病癥組）、C2（開州甜橙無(wú)病癥組）、D1（開州雜柑有病癥組）和D2（開州雜柑無(wú)病癥組）。在A1組中與其他組的組成和豐度有顯著差異的物種屬于赭粉菌目Venturiales、葉黑粉菌目Entylomatales和傘型束梗孢菌目Agaricostilbales，B2組的差異物種屬于擔(dān)孢酵母目Erythrobasidiales、炭角菌目Xylariales、Sympoventuriaceae，C1組的差異物種屬于小球藻目Chlorellales、外擔(dān)菌目Exobasidiales、隔擔(dān)菌目Septobasidiales，C2組的差異物種屬于傘型束梗孢菌目Agaricostilbales，D1組的差異物種屬于小球藻目Chlorellales、外擔(dān)菌目Exobasidiales、刺盾炱目Chaetothyriales，D2組的差異物種屬于Cystofilobasidiales。

2.4有病癥組和無(wú)病癥組之間生物組成和結(jié)構(gòu)的差異

2.4.1有病癥組和無(wú)病癥組組成差異分析

將24份樣品分為有病癥組和無(wú)病癥組兩個(gè)組別。除柑橘和無(wú)記錄的物種外，選擇在種水平上豐度在前30位的物種繪制柱狀圖。

通過比較發(fā)現(xiàn)在相對(duì)豐度高的前30個(gè)物種中，有病癥組各物種的相對(duì)總豐度明顯高于無(wú)病癥組各物種的相對(duì)總豐度（圖7）。其中在有病癥組中豐度顯著高于無(wú)病癥組的物種有：不可培養(yǎng)的球藻un-cultured Apatococcus、黃綠異小球藻Heteroclor-ella luteoviridis、海南橡膠藻Heveochlorella hain-angensis、無(wú)柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum、Cryptococcus sp.CFL-2008a、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、盤狀豪斯曼尼拉菌Hausmanniella discoidea、德克氏霉Derxomyces mrakii、Occultifur erternus等14種。由此推測(cè)，柑橘青苔病可能的病原為以上14個(gè)物種中的一個(gè)或多個(gè)。在無(wú)病癥組中的豐度顯著高于有病癥組的物種有：鎖擲酵母Sporidiobolus pararo-seus、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、牛蹄菌Moesziomyces bullatus，縫殼菌Lophiostma cre-natum，這些菌可能是潛在的生防菌株，或是在真核生物與寄主柑橘的互作關(guān)系中可發(fā)揮重要作用的菌株。

2.4.2不同區(qū)域不同品種有病癥組物種組成差異

將12個(gè)有病癥組中豐度顯著高于無(wú)病癥組的物種進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果表明12個(gè)有病癥組葉樣物種組成結(jié)構(gòu)及豐度均存在較大差異（圖8）。經(jīng)方差分析顯示3個(gè)在有病癥組中豐度高的物種uncul-tured Apatococcus、H. luteoviridis、C.gloeospori-oides在2個(gè)不同地點(diǎn)的不同品種上的豐度差異極顯著（P<0.01）。

2.4.2.1同一地區(qū)不同品種間有病癥組葉際生物組成差異

在忠縣的6個(gè)有病癥組中，豐度排名前5的物種分別為uncultured Apatococcus、H. luteoviridis、C.sessilis、H. hainangensis、D. mrakii，其中uncul-tured Apatococcus占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是其他物種豐度總和的1.3倍;忠縣甜橙的有病癥組中的優(yōu)勢(shì)種為un-cultured Apatococcus，其次為H. luteoviridis和H.hainangensis，其中，忠縣‘卡拉卡拉滋生青苔后的葉片上豐度高的物種為H. luteoviridis、uncultured Apatococcus、H. hainangensis、Chloroidium ellip-soideum、C.gloeosporioides、Kalinella bambusico-la、Hausmanniella discoidea;忠縣‘塔羅科血橙有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococ-cus、D.mrakii、H.luteoviridis、C.sessilis、C.gloeosporioides、O.erternus、H. hainangensis;忠縣‘紐荷爾有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococcus、H. luteoviridis、H. discoidea、H.hainangensis、C.gloeosporioides;忠縣雜柑的優(yōu)勢(shì)種除uncultured Apatococcus外，3個(gè)品種間的差異較大。忠縣‘W·默科特有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococcus、C.sessilis、H. hain-angensis、H. luteoviridis;忠縣‘沃柑有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococcus、C.sessil-is、H. luteoviridis;而忠縣‘春見有病癥葉片上豐度明顯很高的物種僅有uncultured Apatococcus。忠縣的6個(gè)品種有病癥組的葉際生物組成中‘卡拉卡拉與‘紐荷爾、‘W·默科特與‘沃柑有一定相似性，而‘塔羅科血橙‘春見的真核生物組成與其他品種顯著不同。

在開州的6個(gè)有病癥組中，豐度排名前5的物種分別是H. luteoviridis、H. hainangensis、C.el-lipsoideum、Cryptococcus sp. CFL-2008a、uncul-tured Apatococcus，與忠縣有病癥組葉片的優(yōu)勢(shì)種組成差異明顯。開州‘卡拉卡拉滋生青苔后的葉片上豐度高的物種為C.ellipsoideum、H. luteoviri-dis、Cryptococcus sp. CFL-2008a，C.sessilis;開州‘塔羅科血橙有病癥葉片上豐度高的物種為H.hainangensis、H. luteoviridis、H. discoidea;開州‘紐荷爾有病癥葉片上豐度高的物種為H.hainan-gensis、uncultured Apatococcus、H.luteoviridis;開州‘W·默科特有病癥葉片上豐度高的物種為Cryptococcus sp. CFL-2008a、H. hainangensis、uncultured A patococcus、H. luteoviridis，開州‘沃柑有病癥葉片上豐度高的物種為H. luteoviridis、C.ellipsoideum、H. hainangensis、uncultured Apato-coccus;開州‘春見有病癥葉片上豐度較高的物種為H. luteoviridis、C.ellipsoideum;開州‘沃柑和‘春見有青苔病癥的葉際真核生物組成較為相似，而其他4個(gè)品種的組成差異大。

2.4.2.2同一品種不同地區(qū)間有病癥組葉際生物組成差異

青苔滋生后，同一品種不同地區(qū)的柑橘葉際真核生物結(jié)構(gòu)有很大差異。忠縣有病癥樣本的主要優(yōu)勢(shì)種為uncultured Apatococcus（占56. 55%），其次是H. luteoviridis（占13. 64%），開州有病癥樣本的主要優(yōu)勢(shì)種為H. luteoviridis（占32. 42%）和H.hainangensis（占23. 98%）。

忠縣‘卡拉卡拉有病癥組的主要優(yōu)勢(shì)種為H.luteoviridis、uncultured Apatococcus、H. hainan-gensis，而開州‘卡拉卡拉有病癥組的主要優(yōu)勢(shì)種為C.ellipsoideum、H.luteoviridis、Cryptococcus sp.CFL-2008a，并且K. bambusicola在忠縣‘卡拉卡拉有病癥組的存在量較高，而在開州‘卡拉卡拉有病癥組葉片上沒有被檢出;忠縣‘塔羅科血橙有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococcus、D. mrakii、H. luteoviridis，開州‘塔羅科血橙有病癥葉片上豐度高的物種為H. hainangensis、H.luteoviridis、H. discoidea，M. magnisporus以較高的豐度存在于忠縣‘塔羅科血橙有病癥葉際，而在開州‘塔羅科血橙有病癥組中不存在;忠縣‘紐荷爾有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apa-tococcus、H. luteoviridis、H. discoidea，開州‘紐荷爾有病癥葉片上豐度高的物種為H. hainangen-sis、uncultured Apatococcus、H. luteoviridis;忠縣‘W·默科特有病癥葉片上豐度高的物種為uncul-tured Apatococcus、C.sessilis、H. hainangensis，開州‘W·默科特有病癥葉片上豐度高的物種為Cryptococcus sp. CFL-2008a、H. hainangensis、un-cultured Apatococcus，雖然兩地的優(yōu)勢(shì)種相似，但在豐度上差異巨大;忠縣‘沃柑有病癥葉片上豐度高的物種為uncultured Apatococcus、C.sessilis、H.luteoviridis，開州‘沃柑有病癥葉片上豐度高的物種為H. luteoviridis、C.ellipsoideum、H. hainan-gensis;忠縣‘春見有病癥葉片上豐度很高的物種僅為uncultured Apatococcus，而開州‘春見有病癥葉片上豐度較高的物種為H. luteoviridis和C.ellip-soideum。

3結(jié)論與討論

本研究運(yùn)用高通量技術(shù)對(duì)采自重慶忠縣和開州6個(gè)品種有青苔病癥和無(wú)病癥的24份柑橘葉片樣本的真核生物物種進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，柑橘葉際真核生物中的優(yōu)勢(shì)屬是枝孢菌屬Cladosporium、橡膠藻屬Heveochlorella、杯梗孢屬Cyphellopho-ra、Parastagonospora、Knufia等。枝孢菌屬、白粉菌屬是常見的病原菌，其中枝孢菌屬也是擬南芥、小麥等植物中常見的內(nèi)生真菌。多樣性分析顯示，24份樣品的生物多樣性較為豐富，且不同樣品間多樣性指數(shù)存在差異。

傳統(tǒng)意義上講，病原物的確定必須通過柯赫氏法則的驗(yàn)證，但由于一些病害的病原不可純培養(yǎng)（如柑橘黃龍病）或病害由2種、3種乃至更多種病原物復(fù)合侵染造成，這給病原物的驗(yàn)證帶來(lái)一定阻礙和困擾。利用高通量測(cè)序技術(shù)可高效準(zhǔn)確鑒定出多種生物的類型，也給病原物的確定提供了新的技術(shù)途徑。多數(shù)情況下，有病癥組織中病原物的豐度會(huì)顯著高于未患病的組織，因此本研究推測(cè)在有病癥組中豐度顯著高于無(wú)病癥組的生物類群為可能的病原。但有研究表明，單純依靠菌群相對(duì)豐度來(lái)確認(rèn)潛在的病原菌不完全準(zhǔn)確，有些病原菌的豐度較低，但卻對(duì)寄主的微生態(tài)平衡發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，不可培養(yǎng)的球藻uncultured Apa-tococcus、黃綠異小球藻H. luteoviridis、海南橡膠藻H. hainangensis、無(wú)柄杯梗孢C.sessilis、橢圓球藻C.ellipsoideum在有病癥組中的豐度極高，很有可能是柑橘青苔的主要病原。有學(xué)者研究認(rèn)為虛幻球藻和膠孢炭疽菌是柑橘青苔的病原，這與本研究的結(jié)果有很大的不同，可能是由于病原組成受環(huán)境因素和時(shí)間變遷的影響發(fā)生了演替變化，也可能是研究技術(shù)的改進(jìn)所致。黃綠異小球藻富含類胡蘿卜素，可以利用超聲破碎等技術(shù)從中提取類胡蘿卜素和油脂，但有關(guān)它是否會(huì)引起植物的藻害尚未見報(bào)道。橡膠藻屬是共球藻綱中一種了解甚少的單細(xì)胞綠藻，它是能附生在植物葉表形成青苔的主要分支類群;海南橡膠藻是大王棕樹表主要的附生綠藻，并且它可以寄生到棕樹體內(nèi);海南橡膠藻也是一種含油量高的資源藻類。無(wú)柄杯梗孢是一種分布廣泛的外寄生菌，它可寄生在香蕉、竹子、蘋果等植物體表，造成煤污病。橢圓球藻是一種在陸生環(huán)境中普遍存在的綠藻，在大理石材料表面它會(huì)富集形成青苔，并且它在馴鹿苔的再生過程中有重要作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明12份有病癥組葉樣中物種組成結(jié)構(gòu)及豐度均存在較大差異，經(jīng)方差分析顯示3個(gè)主要優(yōu)勢(shì)種在2個(gè)不同地點(diǎn)的不同品種上的豐度差異極顯著。從地域來(lái)看，不同區(qū)域優(yōu)勢(shì)種的群落結(jié)構(gòu)差異巨大。在北美地區(qū)報(bào)道了馬鈴薯品種對(duì)瘡痂病的易感性在區(qū)域與區(qū)域、季節(jié)與季節(jié)之間的差異，而在另一項(xiàng)研究中塊莖的易感程度還受植物基因型的微弱影響，也可能受土壤的pH、降水量、溫度等自然環(huán)境因素的影響。馬鈴薯瘡痂病病斑類型與致病菌的種類、馬鈴薯品種的感病程度和環(huán)境條件有關(guān)，馬鈴薯瘡痂病病原鏈霉菌的種類受種植環(huán)境和氣候因素影響較大，其分布也存在明顯的地域性。由于地域環(huán)境、生態(tài)條件等的不同或變化，不同地區(qū)引發(fā)黃芪根腐病的致病菌群組成和優(yōu)勢(shì)致病菌存在差異。在本研究中，區(qū)域?qū)η嗵?yōu)勢(shì)種種類的影響大于品種對(duì)優(yōu)勢(shì)種群落結(jié)構(gòu)的影響，不同區(qū)域間的最主要優(yōu)勢(shì)種類群完全不同，且同一區(qū)域內(nèi)不同品種間優(yōu)勢(shì)種群落結(jié)構(gòu)仍存在一定差異。地域?qū)Σ≡惾河绊懘蟮脑蚩赡苁遣煌瑓^(qū)域的氣候特征條件下，不同病原的生態(tài)適應(yīng)性不同。品種對(duì)病原構(gòu)成有影響可能是不同品種間的組織結(jié)構(gòu)和生理代謝不盡相同，組織結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物等會(huì)對(duì)病原的侵染、繁殖等產(chǎn)生影響，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究分析得到的青苔可能病原藻鮮見有危害柑橘的報(bào)道。因此，后續(xù)可以從病原藻與寄主間的互作機(jī)制以及病原物復(fù)合侵染機(jī)理等方面開展基礎(chǔ)研究。同時(shí)，根據(jù)不同地域和品種的柑橘滋生青苔會(huì)對(duì)柑橘葉際真核生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大影響的特點(diǎn)，有針對(duì)性開展適宜的柑橘青苔防治策略研究，為柑橘青苔的高效綠色綜合防控打下基礎(chǔ)。