黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病病原鑒定及溫度對(duì)其致病力的影響

白雪　張曉曉　季葦芹等

中圖分類號(hào)： S436.421.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020260

黃瓜Cucumis sativus是葫蘆科黃瓜屬植物，在我國(guó)有2000 多年的栽培歷史，是重要的蔬菜作物。近年來(lái)，隨著黃瓜的大面積種植，日光溫室及各種塑料大棚等設(shè)施逐年增多，為黃瓜生長(zhǎng)提供適宜環(huán)境的同時(shí)，也為多種黃瓜細(xì)菌性病害的發(fā)生提供了適宜的環(huán)境條件。生產(chǎn)中黃瓜細(xì)菌性病害主要有丁香假單胞菌流淚致病變種Pseudomonas syrin?gae pv. lachrymans引起的細(xì)菌性角斑病、丁香假單胞菌P.syringae引起的細(xì)菌性莖軟腐病、綠黃假單胞菌P.viridiflava引起的細(xì)菌性白枯病、嗜管歐文氏菌Erwinia tracheiphila引起的細(xì)菌性萎蔫病、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestris pv. cucurbitae引起的細(xì)菌性圓斑病和丁香假單胞菌流淚致病變種P.sy-ringae pv. lachrymans、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense引起的細(xì)菌性流膠病等。黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中的一種新的細(xì)菌病害，2003年以來(lái)在我國(guó)河南以北地區(qū)有不同程度的發(fā)生。該病害可危害黃瓜莖部，造成植株萎蔫，因此稱為黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病。實(shí)驗(yàn)室前期采集樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病的發(fā)病時(shí)間集中在每年的10月-12月及次年的1月-2月，溫度低時(shí)，植株流膠、枯萎情況更嚴(yán)重。黃瓜細(xì)菌性莖枯萎?。ㄒ灿腥朔Q為流膠病）的癥狀與角斑病不同，可以侵染葉脈和莖部，且在早春低溫環(huán)境下危害加重。

植物病原細(xì)菌通常依據(jù)病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、致病性、生理生化反應(yīng)以及分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)等進(jìn)行鑒定。常規(guī)PCR 技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、多位點(diǎn)序列分型（multilocussequencetyping，MLST）技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、BOXPCR 技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法越來(lái)越多地用于細(xì)菌的鑒定。生理生化反應(yīng)是鑒定細(xì)菌種類的經(jīng)典試驗(yàn)，如LOPAT 試驗(yàn)、Ayers碳源利用試驗(yàn)和GATTa試驗(yàn)等。BOXPCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單快捷，易獲得豐富的擴(kuò)增條帶，不需要菌株的特異性DNA多態(tài)性分析，擴(kuò)增結(jié)果可直接進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，目前在固氮菌的多樣性研究中已有應(yīng)用，在類鼻疽假單胞菌Pseudomonas pseudomallei、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、惡臭假單胞菌P.putida等細(xì)菌上也有應(yīng)用的報(bào)道。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)是由多位點(diǎn)酶電泳（MLEE）衍生出來(lái)的分型方法，用看家基因的DNA 序列多態(tài)性代替了同工酶基因產(chǎn)物的酶譜帶型的多態(tài)性，使試驗(yàn)結(jié)果的可比性和重復(fù)性有很大提高，也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)和醫(yī)學(xué)中。Newberry等通過(guò)LOPAT 生理生化反應(yīng)、BOXPCR 和MLST 等技術(shù)確定了佛羅里達(dá)州的西瓜和西葫蘆細(xì)菌性葉斑病的病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)碳源利用等方法初步鑒定該病害的病原菌為丁香假單胞菌，本研究將進(jìn)一步明確黃瓜莖枯萎病病原菌的分類地位，并研究溫度對(duì)該病害發(fā)生的影響，為黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

本試驗(yàn)菌株如下：黃瓜莖枯萎病菌山東分離物A1～A7、北京分離物B22、遼寧分離物L(fēng)2和L3，由本實(shí)驗(yàn)室分離并驗(yàn)證為病原菌;丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachrymans pslb8、丁香假單胞菌丁香致病變種P.syringae pv.syringaepss和丁香假單胞菌番茄致病變種P.syringae pv.tomato DC3000為本研究室保存;丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv. lachrymans NCPPB540～NCPPB543、丁香假單胞菌菜豆致病變種P.syringae pv. phaseolicola psp、丁香假單胞菌降紅致病變種P.syringae pv. atropurpureaNCPPB1328、丁香假單胞菌李死致病變種P.syringae pv. morsprunorum ATCC13395、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種P.syringae pv.actinidiae NCPPB3738、丁香假單胞菌桑致病變種P.syringae pv.mori ATCC19872和丁香假單胞菌猝倒致病變種P.syringae pv.lapsa ATCC10859由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院趙文軍研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

KingsB（KB）培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨20g，MgSO₄1.5g，K₂HPO41.55g，丙三醇15mL。

LB培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

蔗糖（葡萄糖）培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨10g，NaCl5g，蔗糖（葡萄糖）50g。

Thornley培養(yǎng)基（pH 7.0）：蛋白胨1g，NaCl5g，KH₂PO₄0.3g，酚紅0.01g，L精氨酸鹽酸鹽10g。

明膠液化培養(yǎng)基（pH7.0）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，明膠120g。

七葉苷培養(yǎng)基（pH7.0）：蛋白胨5g，酵母粉1g，蔗糖5g，七葉苷1g，檸檬酸鐵0.5g。

肉汁凍培養(yǎng)基（pH7.0）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母粉1g，蔗糖10g。

Ayers培養(yǎng)基（pH 7.0）：NH₄H₂PO₄1g，KCl0.2g，MgSO₄0.2g，酵母粉0.2g，溴百里酚藍(lán)（1.6%乙醇溶液）1.5mL，在培養(yǎng)基中加1%待測(cè)定的碳素化合物。

酒石酸鹽利用培養(yǎng)基（pH=7.4）：胰蛋白胨10g，NaCl5g，溴百里酚藍(lán)（0.2%）12.5mL，酒石酸鉀10g，接種14d后加入等體積1%醋酸鉛試劑。

以上培養(yǎng)基均用去離子水定容至1000mL，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上添加瓊脂，濃度為1.5%。121℃高溫高壓滅菌（含蔗糖的培養(yǎng)基110℃高溫高壓滅菌）20min。卡那霉素（kanamycin）的最終使用濃度為50μg/mL。

菌株培養(yǎng)條件：28℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3 試劑、藥品及儀器

試驗(yàn)所用試劑：2×Taq PCR MasterMix、SuperRealPreMixPlus和FastQuentRTKit（天根生化科技（北京）有限公司）;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（BioTeke）;質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（Axygen）;N，N-二甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽、干酪素、酒石酸鉀半水合物、明膠、檸檬酸鐵、甘露醇和秦皮甲素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;溴百里酚藍(lán)、酚紅、DL-高絲氨酸、L-乳酸鈉和（R）-3-哌啶甲酸乙酯犔酒石酸鹽（上海麥克林生

化科技有限公司）;甜菜堿（北京金百特生物技術(shù)有限公司）;醋酸鉛（北京百靈威科技有限公司）。所有PCR 引物的合成和序列測(cè)序由六合華大基因（北京）公司完成。

試驗(yàn)所用儀器：普通離心機(jī)、低溫離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），凝膠成像分析系統(tǒng)和PCR 儀（BIORAD，美國(guó)），超低溫冰箱MDF382E（SANYO，日本），分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific，美國(guó)），Biosceen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Biosceen，芬蘭），pH 計(jì)（Sartorius，德國(guó)），磁力攪拌器（WiseStir，中國(guó)），烘箱（Memmert，德國(guó)），DHP120立式恒溫培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。

1.2 多位點(diǎn)序列分型（犕犔犛犜）試驗(yàn)

菌株基因組DNA 提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DNA 用去離子水溶解。選取7個(gè)管家基因：編碼σ70因子狉狆狅犇，促旋酶基因gyrB，烏頭酸水合酶B基因acnB，檸檬酸合成酶基因cts，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gap，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi和磷酸果糖激酶基因pfk，以A1～A7為供試菌株，NCPPB540 ～ NCPPB543、NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp、pss和pslb8 為對(duì)照菌株，對(duì)其DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

1.3 犅?tīng)蠣貭袪脿覚z測(cè)

以BOX 為單引物（5′CTACGGCAAGGCGACGCTGACG3′），對(duì)NCPPB540～NCPPB543、NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp、pss、pslb8和A1～A7菌株提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix12.5μL，引物1μL，模板2μL，ddH₂O9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30s，60℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。BOX 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.4 特異性引物犘犆犚擴(kuò)增與測(cè)序

以A1～A7、B22、L2和L3為供試菌株，pslb8為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水為陰性對(duì)照，用王哲等根據(jù)丁香假單胞菌流淚致病變種的glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase1（犵犪狆1）基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物PslF/R（PslF：5′GTTCGGCGACGCAATCAATG3′， PslR： 5′GTTGACTTCTTCGGCGGTGG3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（產(chǎn)物大小為179bp）。25μL 反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix13μL，引物各1μL，模板2μL，ddH₂O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物送六合華大基因（北京）公司測(cè)序。

1.5 病原菌的生理生化反應(yīng)測(cè)定

試驗(yàn)選取pslb8、pss和DC3000為對(duì)照菌株，將供試菌株用KB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，離心收集菌體，加1mL無(wú)菌水懸浮，再離心，然后洗去表面培養(yǎng)基，將菌懸液濃度調(diào)至1×10⁸cfu/mL，進(jìn)行以下試驗(yàn)：熒光色素的產(chǎn)生、LOPAT試驗(yàn)（果聚糖的產(chǎn)生、氧化酶反應(yīng)、馬鈴薯軟腐反應(yīng)、精氨酸雙水解檢驗(yàn)和煙草過(guò)敏反應(yīng)）、GATTa 試驗(yàn)（明膠液化、七葉苷水解、酪蛋白水解和酒石酸鹽的利用）及Ayers碳源利用試驗(yàn)（甘露醇、甜菜堿、L-酒石酸鹽、DL-高絲氨酸和犔乳酸鈉）。

1.6 不同溫度下病原菌致病力的測(cè)定

為了研究溫度對(duì)病害發(fā)生的影響，測(cè)定20、25℃和28℃條件下病原菌的生長(zhǎng)能力和對(duì)黃瓜葉片的致病力（30℃條件下由于溫度過(guò)高，子葉過(guò)早枯萎，無(wú)法完成試驗(yàn)，因此將最高溫度設(shè)為28℃）。

采用噴霧接種的方法。A2菌株和pslb8菌株分別用KB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，5000r/min離心10min，棄上清，沉淀用無(wú)菌水洗滌，再用無(wú)菌水將菌懸液濃度調(diào)至1×10⁶cfu/mL。使用無(wú)菌噴頭將菌液接種到4周齡健康的黃瓜植株，每個(gè)菌株接種3盆，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照。接種后使用新塑料袋保濕，置于光照氣候培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為20、25℃和28℃，L∥D=16h∥8h，相對(duì)濕度80%～85%。分別于接種后7、10、14d觀察黃瓜苗發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 不同溫度下病原菌在寄主體內(nèi)生長(zhǎng)能力的測(cè)定

參考Johnson等和Ren等的方法，進(jìn)行部分修改。將A2和pslb8菌株分別用KB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，5000r/min離心10min，棄上清，沉淀用無(wú)菌水洗滌，再加入無(wú)菌水至菌懸液濃度為1×10⁴cfu/mL，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照。使用一次性注射器將菌懸液注入至完全展開(kāi)的2周齡黃瓜子葉中，注滿整個(gè)子葉，每個(gè)菌株接種25株苗。分別放置于20、25℃和28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24h取1片子葉觀察發(fā)病情況并拍照，持續(xù)觀察至子葉癥狀不再變化或全部萎蔫。從每個(gè)菌株接種的幼苗中選6片子葉，用消毒并滅菌后的打孔器在葉脈左側(cè)中間部位打取大小約為0.5cm²的葉盤，無(wú)菌水沖洗表面后使用MP破碎儀器研磨，研磨液連續(xù)稀釋后涂布于KB固體培養(yǎng)基上，28℃孵育24h，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 不同溫度下病原菌體外生長(zhǎng)能力的測(cè)定

將A2和pslb8菌株在KB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6，用KB液體培養(yǎng)基調(diào)至菌懸液濃度為1×10⁸cfu/mL，梯度稀釋至1×10⁶cfu/mL，以KB液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，吸取200μL加入到200孔帶標(biāo)記聚苯乙烯培養(yǎng)板中，放入Biosceen自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀，設(shè)置溫度為20、25℃和28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h測(cè)定1次菌液OD₆₀₀的吸光值，測(cè)定前5s停止振蕩，培養(yǎng)96h，觀察和記錄各菌株的生長(zhǎng)情況。每個(gè)處理重復(fù)4孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPadPrism7進(jìn)行記錄、運(yùn)算及制圖，使用PASW Statistics18進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本狋測(cè)驗(yàn)進(jìn)行相同條件下的不同菌株間差異性分析（置信區(qū)間=0.95）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多位點(diǎn)序列分型（MLST）結(jié)果

通過(guò)多位點(diǎn)序列分型試驗(yàn)，對(duì)所研究菌株的7個(gè)看家基因rpoD、gyrB、acnB、cts、gap、pgi和pfk進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST分析，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。以A1和A2為例（圖1），由圖1可知：基于7個(gè)看家基因供試菌株與丁香假單胞菌流淚致病變種NCPPB540、NCPPB541、NCPPB542、NCPPB543和pslb8菌株的親緣關(guān)系最近，因此，確定黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachrymans。

2.2 BOX-PCR檢測(cè)結(jié)果

BOXPCR試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試菌株與NCPPB540、NCPPB541、NCPPB542和NCPPB543的結(jié)果相同，與NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp和pss不同，說(shuō)明供試菌株為丁香假單胞菌流淚致病變種（圖2）。

2.3 特異性引物犘犆犚擴(kuò)增結(jié)果

以特異性引物PslF/R 對(duì)黃瓜莖枯萎病菌代表性菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到179bp的目的片段，經(jīng)測(cè)序和BLAST 比對(duì)分析后，確定供試菌株為丁香假單胞菌流淚致病變種。

2.4 病原菌的生理生化反應(yīng)

10株供試菌株與pslb8菌株的試驗(yàn)結(jié)果一致，其在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光，產(chǎn)生果聚糖，煙草過(guò)敏性反應(yīng)、明膠液化和七葉苷水解均呈陽(yáng)性，精氨酸雙水解、馬鈴薯軟腐和酪蛋白水解均呈陰性，可利用甘露醇、甜菜堿和L-酒石酸鹽，不能利用L-乳酸鈉和DL-高絲氨酸（表2）。與pss菌株在酒石酸鹽、L-酒石酸鹽和犔乳酸鈉利用的試驗(yàn)結(jié)果不一致;與DC3000菌株在明膠液化、酒石酸鹽和L-酒石酸鹽利用的試驗(yàn)結(jié)果不一致;由此也可證明該病害的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種。

2.5 不同溫度下病原菌的致病力測(cè)定結(jié)果

A2菌株和pslb8菌株噴霧接種健康的黃瓜幼苗，分別在20、25℃和28℃條件下培養(yǎng)，接種后7d調(diào)查黃瓜幼苗發(fā)病情況。20℃時(shí)，接種A2菌株的黃瓜苗均比接種pslb8菌株的黃瓜苗癥狀明顯;在25℃和28℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗癥狀與接種pslb8菌株的黃瓜苗無(wú)明顯差異。說(shuō)明20℃條件下黃瓜苗接種A2菌株比接種pslb8菌株更易發(fā)病，但是隨著溫度的升高，接種A2和pslb8菌株的黃瓜苗的發(fā)病程度無(wú)明顯差異（圖3a，c，e）。

黃瓜苗噴霧接種A2和pslb8菌株7d后調(diào)查病情指數(shù)：在20℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗第7、10天和14天的病情指數(shù)分別為18.75、48.96和65.63，接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為7.14、20.24和34.67;在25℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗第7、10 天和14 天的病情指數(shù)分別為14.12、32.87和40.74，接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為15.63、35.65和41.43;在28℃條件下，接種A2菌株第7、10天和14天的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為19.5、27.48和38.19;接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為19.20、25.00和31.55。在20℃條件下，A2菌株與pslb8菌株的致病性差異顯著（犘<0.05），在25℃和28℃條件下，A2菌株與pslb8菌株的致病性差異不顯著（圖3b，d，f）。由以上結(jié)果表明：在20℃條件下，A2菌株的致病力強(qiáng)于pslb8菌株，在25℃和28℃條件下，A2與pslb8菌株的致病力無(wú)明顯差異，20℃條件下更有利于黃瓜莖枯萎病的發(fā)生（圖3）。

2.6 不同溫度下病原菌在寄主體內(nèi)生長(zhǎng)能力測(cè)定

20℃條件下，注射A2和pslb8菌液的黃瓜子葉在觀察時(shí)間范圍內(nèi)未出現(xiàn)萎蔫癥狀，在25℃和28℃條件下，子葉在72h時(shí)出現(xiàn)萎蔫癥狀（圖4a，c，e）。

注射A2和pslb8菌液后，20℃條件下，在48h內(nèi)A2菌株與pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率無(wú)差異，在48h后A2菌株的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率加快，在72h時(shí)可看出A2菌株與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長(zhǎng)率差異顯著（犘<0.05，獨(dú)立樣本狋測(cè)驗(yàn)），72h后pslb8菌株的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率進(jìn)入穩(wěn)定期。25℃條件下，24h時(shí)A2和pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率差異明顯，在48h時(shí)，A2與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。28℃條件下，在24h內(nèi)A2菌株與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率無(wú)差異，在48h內(nèi)菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率最快，48h后A2菌株的增長(zhǎng)速率趨于穩(wěn)定，pslb8菌株的增長(zhǎng)速率略有下降趨勢(shì)（圖4b，d，f）。由以上結(jié)果表明：在觀察時(shí)間范圍內(nèi)，20℃條件下，A2菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率呈現(xiàn)強(qiáng)于pslb8菌株的趨勢(shì)，說(shuō)明在20℃條件下，A2菌株在寄主體內(nèi)生長(zhǎng)能力強(qiáng)于pslb8菌株。在25℃和28℃條件下，A2菌株與pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。

2.7 不同溫度下病原菌體外生長(zhǎng)能力測(cè)定

在20℃條件下，A2菌株在第16h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第44h進(jìn)入穩(wěn)定期，在第92h出現(xiàn)衰退現(xiàn)象;pslb8菌株一直處于生長(zhǎng)期且較遲緩;在25℃條件下，A2菌株在第12h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第34h進(jìn)入穩(wěn)定期，在第72h進(jìn)入衰退期，pslb8菌株生長(zhǎng)較遲緩，在第84h進(jìn)入穩(wěn)定期;28℃條件下，A2菌株在第9h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，A2菌株在第30h時(shí)趨于穩(wěn)定增長(zhǎng)，在第60h菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期，pslb8菌株生長(zhǎng)遲緩，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)。由以上結(jié)果可知：在20℃條件下，A2菌株維持在穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng)，在3個(gè)溫度條件下，pslb8菌株均生長(zhǎng)緩慢，隨著溫度升高，pslb8菌株在后期生長(zhǎng)速率比A2菌株的生長(zhǎng)速率快。說(shuō)明在20℃條件下，A2菌株的體外生長(zhǎng)（72h內(nèi)）能力強(qiáng)于pslb8菌株（圖5）。

通過(guò)對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病病原菌不同溫度下病情指數(shù)、體內(nèi)和體外生長(zhǎng)能力的測(cè)定，可以看出，在20℃條件下，A2菌株的生長(zhǎng)能力一直強(qiáng)于pslb8菌株，這與20℃條件下A2菌株的致病力強(qiáng)于pslb8菌株的結(jié)論相符。

3 結(jié)論與討論

2003年以來(lái)在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、山東、山西、河北和河南等地黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病均有不同程度的發(fā)生。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃瓜的果實(shí)、莖稈和葉片均可被侵染。成株期葉片通常從邊緣開(kāi)始發(fā)病，形成“V”字形或圓形病斑，病斑周圍有黃色暈圈，有時(shí)也從葉片中部開(kāi)始發(fā)病，葉片水浸狀褪綠，后期整個(gè)葉片表現(xiàn)腐爛癥狀，嚴(yán)重時(shí)造成病斑穿孔，病菌可沿葉脈擴(kuò)展并侵染葉脈。莖稈發(fā)病初期，發(fā)病部位呈水浸狀，有流膠現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可見(jiàn)大量的白色膠狀物質(zhì)溢出，通風(fēng)干燥后白膠變黃;發(fā)病中期莖稈縱向開(kāi)裂，表現(xiàn)為軟腐癥狀;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)莖稈由里向外軟腐，造成整株植株萎蔫、死亡。果實(shí)發(fā)病病斑呈水浸狀，中后期果實(shí)表面流出白色膠狀物，果實(shí)內(nèi)部呈現(xiàn)軟腐癥狀，或呈開(kāi)裂狀，后期黃瓜變黃腐爛。本研究利用生理生化反應(yīng)對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病的病原菌進(jìn)行了鑒定，同時(shí)也用多種分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行了再確定，即達(dá)到了經(jīng)典細(xì)菌學(xué)鑒定病菌的要求也應(yīng)用了分子技術(shù)對(duì)其快速驗(yàn)證，最終確定黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachry-mans，與黃瓜細(xì)菌性角斑病及流膠病的病原菌為同一變種。1984年黃仲生等黃瓜細(xì)菌性角斑病的病原菌鑒定為P.syringae pv.lachry-mans。李寶聚等在河南、遼寧、山東、山西、天津等地發(fā)現(xiàn)黃瓜細(xì)菌性流膠?。ǔ醴Q為細(xì)菌性莖軟腐病，后更改為細(xì)菌性流膠病）。孟祥龍等確定了黃瓜流膠病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種和胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種。本實(shí)驗(yàn)室從采集的樣品中只分離到丁香假單胞菌流淚致病變種，沒(méi)有分離到高溫下容易引起植物發(fā)病的胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種。本研究結(jié)果表明：黃瓜細(xì)菌性莖枯萎病菌株A2和黃瓜細(xì)菌性角斑病菌pslb8在不同溫度下的致病力和生長(zhǎng)能力并不相同。20℃條件下，A2菌株的致病力、體內(nèi)生長(zhǎng)能力和體外生長(zhǎng)能力均強(qiáng)于pslb8菌株，說(shuō)明相對(duì)低溫條件下，A2菌株侵染黃瓜的能力更強(qiáng)，相對(duì)低溫的條件下更有利于病害的發(fā)生。這與在田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)黃瓜細(xì)菌性莖枯萎癥狀主要出現(xiàn)在秋冬以及初春低溫時(shí)期相符合。黃瓜角斑病的病斑為近圓形或不規(guī)則病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑連成片且受葉脈限制呈不規(guī)則形，這與黃瓜莖枯萎病的癥狀有所不同。

梨火疫病原梨火疫歐文氏菌犈狉狑犻狀犻犪犪犿狔犾狅狏狅狉犪通過(guò)胞外酶果聚糖蔗糖酶降解蔗糖產(chǎn)生β2，6呋喃低聚糖（果聚糖）。植物病原丁香假單胞菌中，細(xì)胞外多糖果聚糖蔗糖酶（Lsc）介導(dǎo)胞外多糖—果聚糖的產(chǎn)生。Lsc由兩個(gè)功能基因犾狊犮犅和犾狊犮犆編碼，兩個(gè)基因?yàn)闇囟纫蕾囆员磉_(dá)，在18℃時(shí)轉(zhuǎn)錄水平最高。LscB和LscC的區(qū)別僅在于5個(gè)氨基酸殘基，其中一個(gè)是半胱氨酸殘基。溫度響應(yīng)性表達(dá)依賴于果聚糖蔗糖酶（Lsc）基因的特定啟動(dòng)子以及調(diào)節(jié)該過(guò)程的調(diào)節(jié)子。在惡臭假單胞菌犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狆狌狋犻犱犪中犾狊犮犅和犾狊犮犆不誘導(dǎo)果聚糖形成。我們研究證明黃瓜莖枯萎病的病原菌在低溫下具有更強(qiáng)侵染能力，黃瓜莖枯萎病的低溫下發(fā)生是否受犾狊犮犅和犾狊犮犆基因調(diào)控需要進(jìn)一步研究，以便為病害防控提供科學(xué)的理論依據(jù)。