針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴位對大鼠心肌缺血再灌注損傷后的血管重塑作用

張宏如，陳靜，徐森磊，顧任鈞，白樺，盧圣鋒，潘玉璟，顧一煌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)老服務(wù)與管理學(xué)院，江蘇 南京 210023)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是世界范圍內(nèi)死亡率較高的一種心血管疾病[1]。梗死心肌組織中大量心肌細胞壞死,最終被纖維細胞代替從而導(dǎo)致心肌功能喪失[2]。有心肌梗死病史的患者進一步發(fā)生冠狀動脈疾病和腦部疾病的風(fēng)險最高[3],同時,心梗幸存者更容易再度發(fā)生梗死[4]。目前,治療最有效的方法仍是冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention, PCI),使缺血心肌很快重新恢復(fù)血液灌流及氧供應(yīng),該過程稱為缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)。然而,再灌注是一把“雙刃劍”,它在恢復(fù)心肌供血及供氧的同時也使其超微結(jié)構(gòu)、代謝及功能的損傷更加嚴重,引起心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)[5]。血管新生即通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長,實現(xiàn)心肌缺血區(qū)的自我搭橋,從而建立缺血心肌的側(cè)支循環(huán),改善心肌缺血區(qū)的血流狀況。血管新生能夠改善心肌缺血狀態(tài),促進心肌梗死后恢復(fù)[6-8]。因此,促進血管新生對防治MIRI、治療心肌梗死至關(guān)重要。

MIRI病位在心,我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬“胸痹”“真心痛”的范疇,為本虛標實之癥?，F(xiàn)代臨床試驗和循證醫(yī)學(xué)研究表明,針灸對再灌注損傷具有良好的治療效果[9]。回顧以往針灸治療心臟疾病的案例,取穴多以內(nèi)關(guān)穴疏通心脈、鎮(zhèn)痛安神[10]。梁繁榮和趙凌教授在2019 年發(fā)表于JAMAInternalMedicine的研究報告指出,以內(nèi)關(guān)穴為主的針刺療法治療慢性穩(wěn)定性心絞痛時,可顯著減少患者心絞痛發(fā)作次數(shù),降低心絞痛發(fā)作程度[11]。此外,足三里為陽明經(jīng)之合穴、胃之下合穴,能夠調(diào)補脾胃,益氣養(yǎng)血,可治胸痹氣血不足之本,也是臨床治療胸痹的重要腧穴之一。近年來,選用內(nèi)關(guān)、足三里標本配穴治療胸痹的報道日趨增多,強調(diào)治標與治本同時進行,效果顯著[12-13]。同時,關(guān)于電針內(nèi)關(guān)、足三里對心肌損傷等的修復(fù)作用也被發(fā)現(xiàn)[14]。然而,電針內(nèi)關(guān)、足三里對于MIRI后血管重塑的作用及相關(guān)機制仍然有待研究。

血管新生是在缺血、缺氧的條件下,從預(yù)先存在的血管中形成新的毛細血管,它是機體的適應(yīng)性反應(yīng),受多種環(huán)境因素的調(diào)控。新生血管可以重新供養(yǎng),改善MIRI后心肌重塑。由于血管新生在心肌梗死后早期搶救缺血性心肌的潛在作用,促血管新生治療成為治療心肌梗死患者的新策略[15-17]。本研究擬通過構(gòu)建MIRI動物模型,著重比較和探討針灸內(nèi)關(guān)、足三里雙穴位對大鼠MIRI后的血管重塑作用,以期為針刺在臨床心血管疾病治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模

采用SPF級雄性SD大鼠50只,8周齡,體質(zhì)量(280±20) g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃,濕度為 (50±5)%,給予普通光照(12 h 光照/12 h 黑暗),自由獲取食物和水。實驗過程中所有對動物的處置都嚴格遵守中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006 年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批通過(批準號：202209A046)。

將大鼠分為空白對照組(10只)、MIRI組(10只)、內(nèi)關(guān)組(10只)、足三里組(10只)以及內(nèi)關(guān)+足三里組(10只)。構(gòu)建MIRI動物模型[18],采用5%異氟烷伴70%氮氣+30%氧氣將大鼠快速誘導(dǎo)吸入麻醉,并維持在1%～2%的濃度,使大鼠仰臥位于(37±3) ℃的實驗板上,使用呼吸機進行氣管插管和機械通氣(呼吸頻率為45～60次·min-1,潮氣量為10 mL·g-1。接心電監(jiān)護儀,標準Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖。剔除胸前毛發(fā),用75%乙醇消毒,于胸骨下端與左腋窩連線相交于4、5肋間處破皮,逐層分離肌肉和筋膜,暴露肋間,以止血鉗鈍性穿破3、4肋間,左手迅速擠出心臟,右手持針,在左心耳右緣下2～3 mm處結(jié)扎冠狀動脈,寬度、深度約2 mm,缺血30 min后打開絲線結(jié),使再灌注240 min。關(guān)胸逐層縫合,斷開呼吸機,清除呼吸道分泌物。術(shù)后予常規(guī)青霉素以預(yù)防感染。模型構(gòu)建過程中MIRI對照組3只,內(nèi)關(guān)組和足三里組各有1只大鼠死亡,內(nèi)關(guān)+足三里組2只大鼠死亡。

1.2 主要試劑和儀器

CD31抗體(1/100,#AF3628,美國R&D system公司),α-SMA抗體(1/100,# MAB1420,美國R&D system公司),VEGFA抗體(1/1000,ab155944,美國Abcam公司),p-eNOS(1/1000,ab215717,美國Abcam公司),GAPDH抗體(1/1000,ab8245,美國Abcam公司),Goat Anti-Mouse IgG H&L二抗(1/2000,ab96879,美國Abcam公司),DAPI染色液(DA0004,北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

韓氏電針儀(HANS-200,南京濟生科技有限公司);線性陣列換能器超聲儀(H-300,美國Visualsonics公司);圖像分析儀 Image pro plus 7.0 軟件(美國國立衛(wèi)生研究院);熒光顯微鏡(DMI8,德國徠卡公司)。

1.3 內(nèi)關(guān)、足三里穴位選擇與電針治療

參照《實驗針灸學(xué)》穴位定位方法選取大鼠內(nèi)關(guān)穴和足三里穴。采用0.18 mm×13 mm一次性不銹鋼毫針制成雙極電針(用醫(yī)用絕緣膠帶將2根一次性針灸針針柄并列纏繞,保持兩針身相隔 1 mm,露出針柄末端和針身),在雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(PC6)和足三里穴(ST36)直刺 2～3 mm,接韓氏電針儀,疏密波,頻率 2 Hz/100 Hz,電流強度 2 mA,針刺 20 min。于再灌注后第2天行電針治療,每日1次,共14 d。MIRI對照組不予電針治療。

1.4 心肌功能檢測

于MIRI造?；螂娽樦委?4 d后對大鼠進行吸入麻醉后仰臥固定,左胸前區(qū)褪毛。采用配備10 MHz的線性陣列換能器的超聲儀,通過二維及 M 型模式進行測定。在 2D 模式下,在胸骨旁短軸切面深度 2 cm 處可見心臟成像,通過 100 mm·s-1的掃描速度測量左心室射血分數(shù)(LVEF)及左心室內(nèi)徑縮短率(LVFS)。

1.5 TTC染色法檢測心肌梗死面積

實驗結(jié)束后,取各組大鼠心臟于-20 ℃冰箱凍存 1 h,由心尖至心底部橫向均勻切片(厚度為1 mm),于1%TTC 中 37 ℃ 孵育 15 min,10%福爾馬林固定 10 min,數(shù)碼照相機拍照,蒼白色為梗死區(qū)。用圖像分析儀 Image pro plus 7.0 軟件處理得心梗面積百分比。

1.6 血管生成情況檢測

取心肌組織,采用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測心肌組織中 CD31、α-SMA共表達。將各組大鼠左心室組織固定脫水后橫切成20 μm厚的連續(xù)切片。將組織放置在玻片上進行染色。一半切片在室溫下用1% PBS中的5% BSA阻斷1 h,采用一抗(CD31, α-SMA, 1∶100)在4 ℃孵育過夜。隨后,采用二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h。采用DAPI染核。最后,采用×400熒光顯微鏡觀察CD31和α-SMA熒光。

采用Western blot技術(shù)檢測心肌組織中VEGFA、CD31、α-SMA、p-eNOS表達情況,充分評價心肌損傷后血管生成及成熟情況。具體實驗步驟參考以往研究[19]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的超聲心動圖檢查結(jié)果比較

采用超聲心動圖分析造模前后大鼠的心電情況。結(jié)果顯示造模后的小鼠ST段抬高,提示發(fā)生心肌梗死(圖1)。對電針處理前后心肌梗死大鼠的LVEF和LVFS參數(shù)進行比較，表明相對空白組,MIRI模型組的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)顯著降低(P<0.000 1)。針刺內(nèi)關(guān)或足三里穴位的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)較未進行針刺的MIRI大鼠顯著升高(P<0.000 1),而針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴位的大鼠LVEF和LVFS參數(shù)相比MIRI模型組(P<0.000 1)及針刺單穴位組(P<0.01)均有顯著升高(圖2)。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積變化

TTC染色結(jié)果顯示MIRI組的梗死面積顯著高于空白組(P<0.000 1),提示造模成功。單獨針刺內(nèi)關(guān)穴(P<0.001)和足三里穴(P<0.01)能顯著縮小梗死面積,而針刺內(nèi)關(guān)穴和足三里雙穴位相比針刺單個穴位能更有效的縮小梗死面積(P<0.05vs內(nèi)關(guān)組,P<0.001vs足三里組)。見圖3。

注:**P<0.01,****P<0.000 1。圖2 超聲心動圖檢測各組大鼠的LVEF及Fig.2 Detect the LVEF and LVFS by ECG

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。圖3 TTC染色檢測各組大鼠心肌梗死面積Fig.3 Detect the infarct area in each groups using TTC staining

2.3 各組大鼠心肌組織中α-SMA、CD31等蛋白表達變化

免疫熒光法檢測結(jié)果顯示,與空白組比較,MIRI組大鼠心肌組織中α-SMA和CD31表達陽性顯著減弱。相較MIRI組,單獨針刺內(nèi)關(guān)或足三里穴位組的大鼠心肌組織中α-SMA和CD31表達陽性增強,而針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴位組的表達陽性強于MIRI對照組以及針刺單穴位組。見圖4。

Western blot結(jié)果表明,MIRI組的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表達水平相對空白組顯著降低(P<0.000 1)。單獨針刺內(nèi)關(guān)或足三里穴位組的大鼠心肌組織中α-SMA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI組)、CD31(P<0.000 1vsMIRI組)、VEGFA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI組)和p-eNOS(P<0.001,P<0.001vsMIRI組)蛋白表達水平顯著高于MIRI組,而針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴位組的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表達水平相對針刺單穴位組(P<0.000 1)和MIRI組(P<0.000 1)均顯著升高。見圖5。

圖4 免疫熒光法檢測各組大鼠心肌組織中CD31和α-SMA共表達情況Fig.4 Test the co-expression of α-SMA and CD31 protein in each groups by IF

注:***P<0.001,****P<0.000 1。圖5 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中VEGFA、CD31、α-SMA和p-eNOS蛋白表達變化Fig.5 Measure the protein levels of VEGFA, α-SMA and CD31 in each groups by Western blot

3 討論

針灸療法治療心血管疾病歷史悠久,針灸對心肌損傷后修復(fù)作用顯著。本次研究基于前期研究中針刺內(nèi)關(guān)對MIRI的良好療效,結(jié)合祖國醫(yī)學(xué)“治病必求于本”的理念增加足三里穴。溫和針灸內(nèi)關(guān)和足三里可以發(fā)揮心臟保護效應(yīng)以減輕再灌注損傷[20]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用電針處理能夠有效治療MIRI,促進損傷后心肌功能恢復(fù)。動物研究表明,內(nèi)關(guān)穴針刺處理能顯著改善慢性心衰小鼠的心衰程度[21]。臨床研究表明,針刺內(nèi)關(guān)穴對改善運動中的心肌缺血有顯著作用[22]，針刺內(nèi)關(guān)穴能影響大鼠心肌梗死區(qū)心肌重構(gòu)[23]，針刺足三里穴也被報道能夠有效保護大鼠心臟功能[24]，電針刺足三里穴位有助于恢復(fù)膿毒癥大鼠心臟損傷[25]。足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴和胃下合穴,能夠調(diào)理脾胃,補益氣血以榮養(yǎng)心脈。內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴,通陰維脈,素有“心胸內(nèi)關(guān)謀”之說,具有寬胸理氣,活血通絡(luò)的功效。治療MIRI時,足三里為本穴,以補為主;內(nèi)關(guān)為標穴,以攻為主,兩穴合用共奏標本兼治之功。由此可見,針刺治療MIRI等心臟疾病已取得了一定成效,并處于不斷發(fā)展和深入探索之中。本研究通過單刺內(nèi)關(guān)或足三里穴位、針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴多組條件下觀察大鼠MIRI后恢復(fù)狀況以及血管再生的變化。本研究中的實驗結(jié)果表明,單刺內(nèi)關(guān)或足三里均能有效升高大鼠左心室的LVEF和LVFS參數(shù),而針刺雙穴效果較針刺單個穴位更顯著。此外,單刺內(nèi)關(guān)或足三里穴位能夠顯著減緩大鼠的心肌梗死面積,而針刺雙穴效果更為顯著。

血管新生指在原有血管基礎(chǔ)上生長形成新血管的過程,是機體對缺氧狀態(tài)的一種自然響應(yīng)過程[26]。血管新生可在MIRI早期搶救缺血心肌,恢復(fù)心肌細胞生長、存活和收縮功能,促進慢性左室重構(gòu),防止向心力衰竭過渡。心肌梗死再灌注后刺激血管新生有助于改善心臟灌注和心肌功能[27];增加血管新生能夠提高梗死區(qū)域周邊細胞存活率從而改善心室重構(gòu)[28]。因此,血管新生在心肌缺血再灌注治療中的作用越來越受到重視。然而,到目前為止,有前景的臨床前研究未能滿足臨床試驗的期望[29-30],這也進一步擴大了對新型促血管生成藥物開發(fā)的需求。血管內(nèi)皮生長因子VEGFA被廣泛認為能夠有效促進血管生成[31-32];CD31作為血管生成標記物被報道能夠參與血管新生[33];α-SMA被認為是血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的標志[34-35]；eNOS通路激活能夠促進血管新生[36-37]。本研究中,我們通過檢測VEGFA、α-SMA、CD31和p-eNOS在各組大鼠心肌組織中表達確定針刺內(nèi)關(guān)和足三里對血管生成的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴的大鼠心肌組織中VEGFA, α-SMA、CD31和p-eNOS蛋白表達水平顯著高于單刺內(nèi)關(guān)和足三里穴位組以及MIRI對照組。實驗結(jié)果證實,針灸內(nèi)關(guān)、足三里雙穴能有效促進大鼠MIRI后的血管重塑。

綜上所述,針刺內(nèi)關(guān)或足三里能夠有效減緩大鼠的心肌缺血再灌注造成的心肌損傷,并且促進血管重塑,而針刺內(nèi)關(guān)和足三里雙穴能夠達到比針刺單個穴位更佳的治療效果。然而,當前研究也存在局限性。例如,本研究未探索針刺內(nèi)關(guān)和足三里穴對MIRI后血管生成影響的具體機制。因此,課題組計劃后續(xù)研究將圍繞血管生成相關(guān)分子機制進行深入探索。