潤目靈護眼液治療苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥及其作用機制研究

宋健濤,劉鑫,祁興華,張巧,陳憶菁,朱慧,裴科,段煜,蔡皓

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)網(wǎng)絡(luò)管理與信息化辦公室,江蘇 南京 210023;4.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,山西 晉中 030619)

干眼癥是一種多因素疾病,常引起眼部不適或視力障礙,并伴有不同程度的眼表上皮病變、炎癥和神經(jīng)感覺異常[1]。在中國,約有31%的人患有干眼癥,成年人患病率大約為21%。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,干眼癥發(fā)病率與年齡、性別、地區(qū)和醫(yī)療水平密切相關(guān)[2-3]。

干眼癥的潛在發(fā)病機制通常被認(rèn)為與眼表高滲環(huán)境引起的炎癥反應(yīng)有關(guān),角膜高滲環(huán)境激活炎癥信號通路導(dǎo)致眼表炎癥,最終形成干眼癥[4]。中醫(yī)臨床上常用的潤目靈顆粒對治療干眼癥具有一定的療效[5],但其發(fā)揮治療效果的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制目前尚不明晰。

經(jīng)研究和提取分析發(fā)現(xiàn),潤目靈組方含有較多的黃酮類化合物,且有關(guān)文獻[6-7]已證實其方中含有的金絲桃苷和木犀草苷等成分具有顯著的體內(nèi)外抗炎和抗氧化等作用,并可在一定程度上抑制TNF-α和IL-6等炎癥細胞因子的活性。同時,方中含有的綠原酸具有抗炎、抗氧化以及調(diào)節(jié)細胞凋亡等功效[8-9]。

基于上述研究,本實驗在原方基礎(chǔ)上,擬通過提取工藝的優(yōu)化來提高綠原酸、金絲桃苷和木犀草苷的含量。通過比較不同給藥組間對苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥模型兔的治療效果,探索潤目靈組方治療干眼癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級3～4月齡新西蘭大白兔16只(雌雄各半,2.0～2.5 kg),購自江蘇振林生物科技有限公司,許可證號:SCXK(蘇)2021-0011。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)條件:室溫(23±2)℃,相對濕度(60±10)%,自由攝食及飲水。整個實驗研究過程嚴(yán)格遵守動物實驗的各項倫理規(guī)定,并獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:202109A018)。

1.2 實驗儀器

裂隙燈顯微鏡(BL-5000,上海博覽光電儀器有限公司);超聲霧化機(WH-802,粵華醫(yī)療器械廠有限公司);酶標(biāo)儀(iMark,美國Bio-Rad公司);倒置顯微鏡(Zeiss Axion A1,德國Carl Zeiss公司);生物樣品勻質(zhì)儀(Bioprep-24,杭州奧盛儀器有限公司);共聚焦激光掃描顯微鏡(AE41,廈門麥克奧迪電氣股份有限公司);純水機(TANKPE060，美國Millipore公司)。

1.3 藥品及試劑

潤目靈組方中的鬼針草BidenspilosaLinn(產(chǎn)地:安徽亳州，批號:210101)、枸杞LyciumchinenseMil(產(chǎn)地:寧夏，批號:210702)以及菊花ChrysanthemummorifoliumRamat(產(chǎn)地:浙江嘉興，批號:210408)均購自安徽亳州京皖中藥飲片廠,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為正品。苯扎氯銨(批號:A194586)購自南京晚晴化玻儀器有限公司;熒光素鈉試紙與淚液分泌檢測試紙購自天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司;兔白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(批號:ML027844)和兔腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(批號:ML028087)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;4%多聚甲醛(批號:BL539A)購自Biosharp生物科技有限公司;PBS緩沖液(批號：SH30256.01B)購自美國Hyclone公司;NF-κB P65(批號：AF00726)、P-P65(批號：AF06781)、MUC5AC(批號：AF20123)、TNF-α(批號：AF06294)、JNK(批號：AF02708)、P-JNK(批號：AF00640)、P38(批號：AF07562)、P-P38(批號：AF00638)和MMP-9(批號：AF06799)均購自湖南艾方生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及模型制備

新西蘭兔實驗前經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查無眼部異常,隨機分為空白對照組、模型組、原方組和考察組，每組4只。除空白對照組外,其余各組每日2次雙眼滴加0.2%苯扎氯銨溶液1滴,點眼后手動閉合眼瞼10 s,共持續(xù)14 d[10]。

2.2 潤目靈護眼液的制備及給藥方式

潤目靈護眼液原方組參照江蘇省中醫(yī)院制備方法,即稱取鬼針草30 g，枸杞15 g，菊花6 g,加8倍量純水,浸泡30 min,武火煮沸并保持微沸煎煮15 min,四層紗布過濾[11]。濃縮至生藥量為0.51 g·mL-1，4 ℃保存。

考察組由實驗前期對原方組進行工藝優(yōu)化而得,制備方法為稱取鬼針草30 g，枸杞15 g，菊花6 g,加14倍量純水,浸泡30 min,武火煮沸并保持微沸煎煮15 min,提取2次,四層紗布過濾。濃縮至生藥量為0.51 g·mL-1，4 ℃保存。

經(jīng)HPLC測定,原方組中綠原酸、金絲桃苷、木犀草苷的濃度分別為0.123 63、0.017 25、0.095 83 mg·mL-1;考察組中綠原酸、金絲桃苷、木犀草苷的濃度分別為0.225 18、0.042 11、0.183 10 mg·mL-1。

本實驗采用超聲霧化機給藥,在造模14 d后,取50 mL藥液置于超聲霧化機內(nèi)霧化,每日給予新西蘭兔雙眼熏蒸20 min,持續(xù)給藥14 d。

2.3 Schirmer試紙測定兔眼淚液分泌量

實驗第0、3、5、7、14、21、28天時,使用Schirmer試紙測量兔眼淚液分泌量。具體方法為:將Schirmer紙條插入兔眼的下眼瞼中、外三分之一交界處附近的結(jié)膜囊位置,5 min后讀取濕紙條的長度(mm),為保證實驗結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性,每次每只兔子雙眼均由同一人完成。

2.4 熒光素鈉試紙測定兔眼淚膜的穩(wěn)定性及兔眼角膜染色評分

分別于實驗第0、3、5、7、14、21、28天進行兔眼淚膜破裂時間測定。手持熒光素鈉試紙底端,在試紙表面滴加2滴生理鹽水稀釋,將試紙頭部置于兔眼的下結(jié)膜囊內(nèi)5 s后取出,手動閉合眼瞼數(shù)次,使熒光素鈉均勻分布在眼表,在裂隙燈的鈷藍光下用寬裂隙帶觀察,最后一次瞬目后睜眼至角膜出現(xiàn)第1個黑斑的時間為淚膜破裂時間,連續(xù)測量3次取平均值。

將生理鹽水稀釋后的試紙,輕撫于兔眼表面,使熒光素鈉分布均勻,2 min后,在裂隙燈的鈷藍光下用寬裂隙帶觀察并進行評分。本次實驗采用NEI角膜熒光染色評分分級法[12],NEI干眼癥臨床試驗研討會推薦的分級系統(tǒng)將角膜分為5個區(qū):中央?yún)^(qū)、上區(qū)、顳區(qū)、鼻區(qū)和下區(qū)。對于每個區(qū)域,角膜熒光素染色的數(shù)量在0到3的范圍內(nèi)分級:0級正?；蜿幮粤严稛舭l(fā)現(xiàn);1級輕度或淺層點畫;2級中度或點狀染色,包括角膜表面磨損;3級嚴(yán)重磨損或角膜侵蝕、角膜深層磨損或復(fù)發(fā)性侵蝕。最大分?jǐn)?shù)為15分。

2.5 HE切片染色觀察眼表組織

空氣栓塞法處死實驗兔后,取兔眼的下角膜和瞼結(jié)膜,用4%多聚甲醛固定24 h以上。脫水后石蠟包埋、切片并進行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 免疫熒光染色法測定兔眼結(jié)膜中MUC5AC表達水平

所有樣本在4 ℃的丙酮中固定10 min,磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4)洗滌3次,每次5 min。滴加非免疫正常山羊血清100 μL,室溫孵育30 min,與MUC5AC(1∶100)抗體4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后,將樣本與4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)結(jié)合的FITC山羊抗兔在室溫下孵育50 min,玻片置于PBS中,在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加自發(fā)熒光淬滅劑孵育5 min,流水沖洗15 min。在載玻片的組織中央滴加適量抗熒光淬滅封片液,蓋上蓋玻片。在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察,采用image J軟件進行平均熒光強度計算。

2.7 ELISA法測定兔眼淚腺、房水及哈氏腺中TNF-α和IL-6表達水平

取兔眼淚腺、房水及哈氏腺,經(jīng)勻漿機勻漿后,取上清液,嚴(yán)格按照各試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6的含量。

2.8 Western blot法測定兔眼角膜組織中P38、P-P38、P-P65、NF-κB P65、TNF-α、MMP-9及MUC5AC蛋白表達水平

取適量新鮮兔眼角膜用PBS清洗2～3次,剪成小塊置于勻漿機中,加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑,置于冰上充分勻漿。結(jié)束后,收集勻漿液,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,采用BCA法測定上清液中蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后,5%BSA封閉。封閉結(jié)束,加入一抗JNK (1∶500)、P-JNK(1∶500)、P38 (1∶800)、P-P38(1∶800)、P-P65(1∶800)、NF-κB P65(1∶1 000)、TNF-α(1∶500)、MMP-9(1∶1 000)及MUC5AC(1∶1 000),4 ℃孵育過夜。次日,洗膜,二抗(1∶200)室溫孵育1 h,洗膜后,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,Image J軟件進行灰度值定量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼淚液分泌量的影響

Schirmer試紙的測量結(jié)果如圖1所示。0～7 d內(nèi),與空白對照組相比,其余各組具有下降趨勢，但無顯著性差異。造模第10、14天差異具有顯著性(P<0.05),兔眼淚液的分泌量小于15 mm,表明模型復(fù)制成功。

超聲霧化給藥1周后(第21天),與模型組相比,考察組兔眼淚液的分泌量明顯增加(P<0.01),原方組無明顯差異,且考察組兔眼淚液的分泌量與原方組相比顯著升高(P<0.01)。超聲霧化給藥2周后(第28天),與模型組相比,原方組試紙潤濕長度明顯增加(P<0.05)。

注:與空白對照組相比,ΔP<0.05;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與原方組相比,圖1 潤目靈組方對兔眼淚液分泌量的影響Fig.1 Effects of Runmuling formula on tear secretion in rabbit eyes

3.2 熒光素鈉眼表染色實驗

3.2.1 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼淚膜破裂時間的影響 熒光素鈉試紙測定兔眼淚膜破裂時間的結(jié)果如圖2所示。造模第7、14天,與空白對照組相比,其余各組兔眼淚膜的穩(wěn)定性變差,破裂時間縮短(P<0.05)。實驗第21、28天,與模型組相比,原方組與考察組實驗兔的淚膜穩(wěn)定性顯著提高(P<0.05)。原方組與考察組兩者之間無明顯差異(P>0.05)。

注:與空白對照組相比,ΔP<0.05;與模型組相比,圖2 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼淚膜穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of Runmuling formula on tear film stability in rabbit xerophthalmia model

3.2.2 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜受損的影響 熒光素鈉試紙兔眼角膜染色評分的結(jié)果如圖3～4所示。在基線檢查時,各組之間的最小角膜點狀染色沒有顯著性差異。在第5、7、14天,空白對照組與模型組之間存在顯著性差異(P<0.05,P<0.01)。第21、28天,原方組和考察組的兔眼角膜染色評分較模型組顯著下降(P<0.05,P<0.01)。

圖3 造模第14天熒光素鈉試紙染色不同程度的眼表損傷Fig.3 Varying degrees of ocular surface damage after staining with sodium fluorescein test strip at d14 of modeling

注:與空白對照組相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與模型組相比,圖4 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜熒光染色評分的影響Fig.4 Effects of Runmuling formula on scores of corneal fluorescence staining in rabbit xerophthalmia model

3.3 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼結(jié)膜中MUC5AC表達水平的影響

如圖5所示,綠色代表MUC5AC染色,而藍色代表Hoechst 33342染核。

空白對照組可見多數(shù)結(jié)膜細胞被MUC5AC抗體染色。與空白對照組相比,模型組中幾乎未見兔眼結(jié)膜細胞被MUC5AC抗體染色(P<0.01)。與模型組相比,原方組與考察組中少量兔眼結(jié)膜細胞被MUC5AC抗體染色(P<0.05,P<0.01),同時,考察組中被MUC5AC抗體染色結(jié)膜細胞明顯多于原方組(P<0.05),提示干眼癥經(jīng)潤目靈治療后,眼表損傷得到改善,且考察組效果優(yōu)于原方組。

3.4 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜、球結(jié)膜和瞼結(jié)膜的影響

結(jié)果如圖6所示。光學(xué)顯微鏡下可觀察到空白對照組兔眼角膜基質(zhì)中有3～5層上皮細胞和膠原纖維。與空白對照組相比,模型組的兔眼角膜上皮變薄同時存在炎性細胞浸潤;原方組上皮細胞與基質(zhì)中均存在炎性細胞浸潤,兔眼角膜上皮細胞變薄;考察組兔眼角膜各層的結(jié)構(gòu)是整合的,各層之間界限明顯,兔眼角膜上皮細胞層無壞死或脫落,基質(zhì)無明顯的炎性細胞浸潤和增多。

空白對照組兔眼球結(jié)膜和瞼結(jié)膜均包含1個立方基底上皮層和3或4個上覆的柱狀層,其間散布著杯狀細胞。模型組兔眼球結(jié)膜和瞼結(jié)膜均變薄并失去立方層,PAS陽性杯狀細胞顯著減少。原方組和考察組兔眼球結(jié)膜和瞼結(jié)膜組織中杯狀細胞的數(shù)量均有增加。

注:與空白對照組相比,ΔΔP<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與原方組相比,圖5 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼結(jié)膜中MUC5AC表達水平的影響Fig.5 Effects of Runmuling Formula on expression levels of conjunctival MUC5AC in rabbit xerophthalmia model

圖6 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜、球結(jié)膜和瞼結(jié)膜的影響Fig.6 Effects of Runmuling formula on cornea, bulbar conjunctiva and palpebral conjunctiva in rabbit xerophthalmia model

3.5 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼淚腺、房水及哈氏腺中TNF-α及IL-6表達水平的影響

結(jié)果如圖7所示。與空白對照組相比，模型組中兔眼淚腺和房水中TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,原方組和考察組兔眼淚腺與房水中TNF-α的表達水平均顯著降低(P<0.01)。兔眼哈氏腺中各組TNF-α的表達水平均未表現(xiàn)出差異性。

與空白對照組相比，模型組中兔眼淚腺和房水中IL-6的表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,原方組和考察組兔眼淚腺和房水中IL-6的表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。原方組與考察組之間兔眼房水中IL-6的表達水平也具有顯著性差異(P<0.05)。兔眼哈氏腺中各組IL-6的表達水平均未表現(xiàn)出差異性。

注:與空白對照組相比，△△P<0.01；與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與原方組相比,圖7 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼淚腺、房水及哈氏腺中TNF-α及IL-6表達水平的影響Fig.7 Effects of Runmuling formula on expression levels of TNF-α and IL-6 in lacrimal gland, aqueous humor, and Harderian gland in rabbit xerophthalmia model

3.6 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜中 P-JNK/JNK、P-P38/P38、P-P65/P65、TNF-α、MMP-9 及 MUC5AC 蛋白表達水平的影響

結(jié)果如圖8～9所示。與空白對照組相比,模型組兔眼角膜組織P-JNK/JNK、P-P38/P38、P-P65/P65及TNF-α的蛋白表達均顯著升高(P<0.01，P<0.001);與模型組相比,原方組與考察組P-JNK/JNK、TNF-α、P-P38/P38、P-P65/P65的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),且與原方組相比,考察組P-P38/P38和P-P65/P65的改善效果更加明顯(P<0.05)。

與模型組相比，原方組與考察組中MUC5AC蛋白表達水平提高(P<0.05，P<0.01)，且考察組的上升趨勢與原方組相比更為顯著(P<0.05)。與模型組相比，考察組中MMP-9的表達水平顯著降低(P<0.01)，原方組次之(P<0.05)，且考察組與原方組相比，兩者具有一定的差異性(P<0.05)。

注:C.空白對照組；M.模型組；Y.原方組；K.考察組；與空白對照組相比,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與原方組相比,圖8 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜中JNK/P38通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.8 Effects of Runmuling formula on expression levels of JNK/P38 pathway related proteins in cornea in rabbit xerophthalmia model

注:C.空白對照組；M.模型組；Y.原方組；K.考察組；與空白對照組相比,ΔΔΔP<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與原方組相比,圖9 潤目靈組方對干眼癥模型兔眼角膜中MMP-9和MUC5AC蛋白表達水平的影響Fig.9 Effects of Runmuling formula on expression levels of MMP-9 and MUC5AC proteins in cornea in rabbit xerophthalmia model

4 討論

干眼癥從臨床角度一般可分為水樣缺乏性和過度蒸發(fā)性2種類型,但2者的發(fā)病機制與病理表征是相互交錯的。通常認(rèn)為,滴加苯扎氯銨溶液會使眼表黏蛋白發(fā)生改變,而黏蛋白是維持淚膜穩(wěn)定性和質(zhì)量的關(guān)鍵因素[13]。淚膜的不穩(wěn)定會導(dǎo)致眼表過度蒸發(fā),形成高滲環(huán)境,從而引發(fā)炎癥。同時,炎癥會干擾與角膜或結(jié)膜上皮細胞結(jié)合的黏蛋白分泌,影響杯狀細胞的分化和增殖,最終加重眼表高滲環(huán)境,形成惡性循環(huán)[14]。因此,炎癥可能不是導(dǎo)致干眼癥形成的根本原因,但常被認(rèn)為是干眼癥發(fā)病潛在機制的一部分。

以往文獻證明,黃酮類化合物具有較好的抗炎效果。例如,楊梅素和槲皮素通過抑制體內(nèi)外NF-κB的表達來調(diào)節(jié)TNF-α水平[15]。金絲桃苷通過抑制TNF-α、IL-6和一氧化氮等炎癥因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[16]。此外,綠原酸可通過抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的活化以及影響花生四烯酸的代謝進而調(diào)節(jié)炎癥[17]。

實驗前期利用加權(quán)評分法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化潤目靈護眼液提取工藝,將優(yōu)化后的藥液設(shè)立為考察組與原方組進行藥效對比。從實驗結(jié)果我們得出結(jié)論,兔干眼癥模型經(jīng)過考察組治療2周后,在淚液分泌量、MUC5AC的表達以及角膜、球結(jié)膜和瞼結(jié)膜的修復(fù)等方面均明顯優(yōu)于原方組(P<0.05)。與原方組相比,考察組兔眼房水中IL-6的表達水平和角膜中P-P38/P38、P-P65/P65、MMP-9的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。在熒光素鈉染色實驗中,考察組和原方組雖然最終染色評分相同,但考察組眼表損傷修復(fù)得更快。以上實驗結(jié)果表明,潤目靈組方中金絲桃苷、木犀草苷和綠原酸成分含量的提高對于干眼癥的治療具有積極的作用。

本次研究采用的Schirmer試驗可直觀比較樣本淚液的分泌情況,是評價干眼癥模型的經(jīng)典方法。進行Schirmer試驗時可預(yù)先進行眼表麻醉并清除多余的淚液,這樣可提高實驗的重復(fù)性,但表面麻醉對于淚液分泌是否具有影響尚不明確。本實驗未采取眼表麻醉,而是通過手動閉合兔眼瞼來減少眨眼所導(dǎo)致反射的淚液產(chǎn)生,因此可能會導(dǎo)致測量數(shù)據(jù)偏高[18]。

熒光素鈉染料是評估眼表狀況最簡單和最常用的技術(shù)之一。熒光素能夠染色死亡或垂死的上皮細胞,并作為細胞死亡或損傷的標(biāo)志物。通過比較染色評分可以看出,經(jīng)潤目靈方治療后染色評分降低,說明眼表損傷得到修復(fù),但不能推斷其作用方式是直接修復(fù)角膜損傷還是通過抑制炎癥發(fā)生來促進眼表進行自我修復(fù)。此外,針對局部應(yīng)用染料來評價眼表的作用機制缺少研究支持,同時從定性的角度來看,僅憑熒光強度和染色面積評判損傷情況較為主觀,應(yīng)用主觀定量評分技術(shù)進行一致的診斷評估和比較可能缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性[19]。因此,熒光素鈉染色目前只能作為一種評判的輔助手段,而非主要指標(biāo)。

MUC5AC是一種在結(jié)膜杯狀細胞中分泌并聚合形成凝膠的黏蛋白,結(jié)膜杯狀細胞是潤滑和保護眼表黏蛋白的主要來源[20]。由于黏蛋白的分泌減少所引起的眼表潤滑不良,可能會導(dǎo)致淚膜的不穩(wěn)定。免疫熒光的結(jié)果進一步說明滴加苯扎氯銨會影響結(jié)膜杯狀細胞,導(dǎo)致MUC5AC的分泌減少,光學(xué)顯微鏡下也證實了這一點,受損眼表可直觀看到上皮細胞的壞死、增生和基質(zhì)變薄。而潤目靈組方對角膜和結(jié)膜的修復(fù)具有促進作用,同時會增加黏蛋白的表達,保護眼表。

本實驗通過測定TNF-α和IL-6的表達水平,說明干眼癥模型兔淚腺及房水中含有較高的炎癥因子表達水平,印證了干眼癥與炎癥具有一定的相關(guān)性。P-JNK/JNK、P-P38/P38、P-P65/P65及TNF-α表達結(jié)果顯示,與模型組相比,原方組與考察組的兔眼角膜中JNK/P38通路的相關(guān)蛋白表達降低,提示干眼癥的發(fā)生與炎癥通路激活具有相關(guān)性,滴加苯扎氯銨形成的干眼癥是由于破壞眼表黏蛋白層,在眼表形成高滲環(huán)境,激活了JNK/P38通路,導(dǎo)致NF-κB的磷酸化以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生,引起促炎癥因子的活化,使炎癥因子TNF-α轉(zhuǎn)化為活性形式,形成眼表炎癥。由于炎癥的存在,結(jié)膜杯狀細胞受損,影響淚膜穩(wěn)定性,眼表水分過度蒸發(fā)形成干眼癥。

綜上所述,潤目靈組方能夠治療苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥模型,其作用機制是通過抑制JNK/P38通路發(fā)揮抗炎效果,并在干眼癥的發(fā)病過程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。