基于異氟爾酮的L-精氨酸探針光譜性能研究

張 玉，顧崢燁，徐洪耀*，光善儀*

1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院和生態(tài)紡織教育部重點實驗室，上海 201620 2.東華大學(xué)分析測試中心與材料學(xué)院和纖維改性國家重點實驗室，上海 201620

引 言

氨基酸是一種含有堿性氨基和酸性羧基的有機(jī)化合物，它既是生命體中蛋白質(zhì)的基本組成部分，同時也是參與生命體的修復(fù)和再生的必須物質(zhì)[1]。在20種天然氨基酸中，精氨酸(L-Arg)有不可代替的優(yōu)勢，在一端的旁鏈處存在著高堿性的胍基，其pKa高達(dá)12.48，使得其在酸性、中性及堿性條件下均帶正電荷[2-3]。L-Arg作為NO(一氧化氮)的前體，在動物的生存，繁殖，生長，抗衰老和免疫方面起著重要的作用。越來越多的臨床試驗表明，在飲食中適當(dāng)填加L-Arg可以減輕體重，降低動脈血壓，抵抗氧化并使內(nèi)皮功能正常化，從而緩解高血壓[4]，同時也可以促進(jìn)孕婦在孕期胎盤和胚胎的生長[5]。精氨酸在細(xì)胞分裂，傷口愈合，免疫系統(tǒng)，激素的釋放，尤其是基因調(diào)節(jié)，糖蛋白靶向和囊泡運輸中起著重要作用[6-7]。因此，對精氨酸的選擇性識別研究是生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵課題之一[8-9]。

目前，報道檢測L-Arg的方法有很多但均存在一些缺點，如使用高效液相色譜法(HPLC)[10]檢測時對L-Arg的選擇性差，采用電化學(xué)[11]方法檢測時對于精氨酸甲基化蛋白的修飾過程比較復(fù)雜，選擇離子交換色譜法[12]檢測時對方法條件及儀器均具有較高的要求，利用毛細(xì)管電泳[13]檢測時樣品處理過程較為復(fù)雜，從而限制了它們在實際生活中的應(yīng)用。因此，操作簡單迅速，高靈敏度以及價格低廉的探針就成了有效檢測氨基酸的方法之一。

比色探針作為一種可以通過檢測分析物的顏色及吸收光譜變化的檢測方法，可以實現(xiàn)對氨基酸定性以及定量的檢測分析。因此，基于異氟爾酮設(shè)計并合成了可以用于精氨酸(L-Arg)檢測的一種新型比色探針I(yè)SO-CN-OH。通過對ISO-CN-OH進(jìn)行光譜性能研究，發(fā)現(xiàn)ISO-CN-OH對L-Arg具有高選擇性以及高靈敏性，并通過紫外可見吸收的Job’s plot曲線及1H-NMR核磁滴定波譜，詳細(xì)研究了探針I(yè)SO-CN-OH與L-Arg的配位機(jī)理，并利用配位模型圖模擬出ISO-CN-OH與L-Arg的配位過程。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

上海豫華儀器有限公司DF-101S集熱式恒溫式加熱磁力攪拌器；瑞士Bruker公司Bruker AVANCE/DMX600型核磁共振儀器；美國熱電集團(tuán)Nicolet 8700型傅里葉變換紅外光譜儀；PerkinElmer UV/Vis Spectrometer Lambda 35。所用藥品試劑和溶劑均為市售分析純。

異氟爾酮-丙二腈(ISO-CN)按照文獻(xiàn)[14]的方法合成。

1.2 ISO-CN-OH合成方法

探針I(yè)SO-CN-OH的合成路線如圖1所示。

圖1 ISO-CN-OH合成路線

2 結(jié)果與討論

2.1 探針I(yè)SO-CN-OH對氨基酸的光學(xué)吸收性能研究

選擇21種常見的氨基酸作為研究對象，探究了探針I(yè)SO-CN-OH與不同氨基酸之間的紫外可見光譜性能，實驗結(jié)果如圖2(a)所示。發(fā)現(xiàn)在DMSO/H2O(95/5,V/V, PBS=7.0)溶液中，探針I(yè)SO-CN-OH本身在471 nm處呈現(xiàn)吸收峰，當(dāng)分別向探針中加入10當(dāng)量的L-His，L-Ala，L-Gly，Cys，L-Val，L-Pro，L-Leu，L-Phe，L-Ser，L-Met，L-Glu，L-Asp，L-Lys，L-Thr，L-Tyr，GSH，L-Asn，L-Trp，L-lle和L-Gln時，在471 nm處的吸收峰并沒有發(fā)生明顯的改變，但是在669 nm處出現(xiàn)了新的微弱的吸收峰，且溶液的顏色并無明顯的改變。僅向溶液中加入10當(dāng)量的L-Arg時，光譜在669 nm處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰且溶液顏色由原本的橙黃色變?yōu)榱四G色。該吸收光譜實驗結(jié)果表明，探針I(yè)SO-CN-OH是對L-Arg具有高度選擇性的比色探針，且響應(yīng)靈敏，檢測結(jié)果肉眼可視。

為了排除共存的氨基酸對L-Arg的識別產(chǎn)生干擾，進(jìn)行了對L-Arg的競爭性實驗測試。在其余20種氨基酸的ISO-CN-OH溶液中分別加入等當(dāng)量的L-Arg，由圖2(b)可知，其余20種氨基酸的存在并不會影響探針I(yè)SO-CN-OH對L-Arg的紫外識別。因此，探針I(yè)SO-CN-OH對L-Arg的紫外識別具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖2 (a)探針I(yè)SO-CN-OH(10-5 mol·L-1)對氨基酸(10-4 mol·L-1)的選擇性識別；(b)ISO-CN-OH(10-5 mol·L-1)對L-Arg及共存氨基酸(10-4 mol·L-1)的競爭性實驗

2.2 光譜吸收滴定曲線分析

在DMSO/PBS(95/5,V/V, PBS=7.0)體系中，進(jìn)行紫外-可見光譜滴定實驗研究。如圖3(a)所示，隨著L-Arg濃度的增加，探針I(yè)SO-CN-OH在669 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸上升，441 nm處的吸收峰逐漸下降，這表明ISO-CN-OH與L-Arg形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。除了在669 nm處產(chǎn)生新的吸收，在550 nm處還出現(xiàn)了等吸收點，這也為ISO-CN-OH+L-Arg絡(luò)合物的形成提供了進(jìn)一步的證據(jù)。當(dāng)L-Arg的濃度在1.0～10.0×10-6mol·L-1范圍時，根據(jù)ISO-CN-OH+L-Arg在669 nm處的吸收強(qiáng)度與不同濃度做線性回歸曲線，線性回歸方程式為y=0.020x+0.073，R2=0.997，如圖3(b)所示，根據(jù)DL=3σ/K，其中σ為探針I(yè)SO-CN-OH溶液平行測試20次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為線性回歸方程的斜率，可計算出檢出限為8.5×10-8mol·L-1。

圖3 (a)探針I(yè)SO-CN-OH(10-5 mol·L-1)隨L-Arg(10-6～10-4 mol·L-1)濃度變化的紫外可見光譜圖；(b)相對吸收強(qiáng)度A-A0與L-Arg濃度變化的線性曲線

2.3 吸收光譜的Job’s plot滴定曲線分析

通過固定探針I(yè)SO-CN-OH與L-Arg的總濃度為100 μmol·L-1，改變L-Arg占總濃度的比例，測其在669 nm處的吸收強(qiáng)度。由此獲得探針I(yè)SO-CN-OH對L-Arg的Job’s plot滴定光譜吸收曲線，如圖4所示。當(dāng)L-Arg占總濃度比例為0.67時，發(fā)現(xiàn)探針I(yè)SO-CN-OH在669 nm處紫外吸收強(qiáng)度達(dá)到最大值，根據(jù)計算公式n=Xmax/(1-Xmax)可得n=2，表明探針I(yè)SO-CN-OH與L-Arg以1∶2的絡(luò)合比進(jìn)行配位絡(luò)合。

圖4 探針I(yè)SO-CN-OH與L-Arg的Job’s plot滴定曲線

2.4 核磁共振光譜滴定曲線分析與探針機(jī)理研究

在確定了配位比的基礎(chǔ)上，通過核磁滴定實驗來進(jìn)一步確定配位機(jī)理。在探針I(yè)SO-CN-OH的d6-DMSO溶液中分別加入0，0.5，1.0及2.0當(dāng)量的L-Arg(d2O)，結(jié)果如圖5(a)所示。當(dāng)加入L-Arg后，探針上的羥基氫H2(9.83 ppm)和H4(8，76 ppm)峰逐漸消失，如圖5(b)放大圖所示。此外，羥基周圍的氫信號峰發(fā)生了向高場的偏移，H1峰從7.08 nm逐漸偏移到6.96 nm，H3峰從6.67 nm逐漸偏移到6.54 nm，H5峰從6.32 nm逐漸偏移到6.10 nm，且在高場區(qū)出現(xiàn)了L-Arg的特征峰Ha(3.15 ppm)和Hb(1.54 ppm)，如圖5(a)所示。上述結(jié)果表明探針I(yè)SO-CN-OH上的羥基與L-Arg結(jié)合形成了絡(luò)合物，從而引起了羥基以及周圍氫化學(xué)環(huán)境的變化。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因是探針I(yè)SO-CN-OH具有兩個酸性酚羥基，且L-Arg屬于強(qiáng)堿，其pKa=12.48，有足夠的能力去除羥基中的質(zhì)子，因此探針I(yè)SO-CN-OH通過將酸性的酚羥基質(zhì)子轉(zhuǎn)移到L-Arg堿性的胍基NH基團(tuán)上，導(dǎo)致羥基基團(tuán)附近形成負(fù)電荷，該負(fù)電荷與精氨酸的胍基部分絡(luò)合，從而形成了絡(luò)合物，即ISO-CN-OH與L-Arg通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成了穩(wěn)定的絡(luò)合物[15]。

圖5 (a)在ISO-CN-OH(DMSO-d6)中加入0，0.5，1.0及2.0當(dāng)量的L-Arg(d2O)的1H-NMR對比圖；(b)局部放大圖

基于以上光譜分析，可以得到探針I(yè)SO-CN-OH與L-Arg的配位模型如圖6所示。

圖6 探針I(yè)SO-CN-OH+L-Arg配位模型

3 結(jié) 論

通過設(shè)計并合成了一種可以用于檢測L-Arg的比色探針，采用各種光譜分析方法，研究了其光學(xué)性能及配位機(jī)理，發(fā)現(xiàn)該探針可以專一性識別L-Arg，溶液顏色發(fā)生了從橙黃色到墨綠色的改變。滴定實驗表明L-Arg在1.0～10.0×10-6mol·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限為8.5×10-8mol·L-1，表明該探針對L-Arg具有高靈敏度。基于核磁共振譜滴定的方法，通過對ISO-CN-OH與L-Arg的配位機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)ISO-CN-OH與L-Arg是通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移方式形成絡(luò)合物。本研究為今后L-Arg新型探針分子的設(shè)計，提供重要光譜研究方法與分析基礎(chǔ)。