基于逆向空間偏移拉曼光譜技術(shù)的多層混濁樣品深層分析研究

余 凡，李賀平，趙天煜，梁卓文，趙 航，王 爽*

1.西北大學(xué)光子學(xué)與光子技術(shù)研究所，陜西，西安 710069 2.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032

引 言

拉曼光譜分析技術(shù)可在分子水平上研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)與生化組成信息，因具有出色的靈敏性、特異性以及技術(shù)相容性，已成為物質(zhì)在線檢測(cè)分析的重要工具。近年來，基于新型光譜激發(fā)和檢測(cè)手段的拉曼光譜檢測(cè)分析儀器極大拓展了相關(guān)技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用深度和廣度。然而，常規(guī)背散射式拉曼光譜檢測(cè)手段極易受到樣品表面熒光背景信號(hào)的干擾，無法實(shí)現(xiàn)樣品深層光譜信息的檢測(cè)與分析[1]。透射式光譜采集手段雖然可以克服樣品表面所產(chǎn)生的熒光干擾，但是仍無法解析實(shí)驗(yàn)采集的內(nèi)層混合拉曼光譜信息[2]。此外，基于光克爾效應(yīng)(optical Kerr effect)的超快光譜檢測(cè)手段可有效抑制樣品表面的熒光背景，準(zhǔn)確檢測(cè)樣品深層光譜信息，然而這一技術(shù)中所使用的高功率脈沖激光超過了活體生物組織所能承受的最大激光照明安全極限[3]，從而限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種新型拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)，使其能夠減少樣品表面的熒光背景干擾、提高光譜探測(cè)深度和信噪比、改善其在多種研究領(lǐng)域(特別是生物醫(yī)學(xué)研究)中的適用性，仍然是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作。

空間偏移拉曼光譜(spatially offset Raman spectroscopy，SORS)作為一種新型拉曼光譜檢測(cè)手段，能夠有效抑制表層成分拉曼光譜和熒光背景干擾，在結(jié)合適當(dāng)數(shù)據(jù)處理方法的條件下，特別適用于覆蓋有不/半透明或高熒光背景材料的物質(zhì)深層光譜信息提取[4]。SORS技術(shù)由Matousek等首先提出[5]，當(dāng)激光入射到被測(cè)組織表面并透射到組織內(nèi)部時(shí)，直行光子將被側(cè)向散射(瑞利散射與拉曼散射)或激發(fā)出寬帶熒光，其中一部分散射光子經(jīng)過多次散射后到達(dá)組織深層，并與深層組織成分發(fā)生各向同性的拉曼散射，組織內(nèi)部不同深度處產(chǎn)生的拉曼散射光子溢出組織表面后，在與激發(fā)光照射位置距離Δs處被探測(cè)接收[6-7]。探測(cè)深度取決于激光激發(fā)區(qū)和信號(hào)收集區(qū)之間的距離，即空間偏移量(Δs)的大小。已經(jīng)證明，SORS可用于研究多層漫散射樣品中的子層物質(zhì)構(gòu)成信息，其探測(cè)深度通常為20 μm到5 mm，這超過了共聚焦拉曼光譜的探測(cè)深度極限[8]。此外，SORS利用滿足活體光學(xué)檢測(cè)功率要求的連續(xù)激光作為激發(fā)光源，能夠無損、快速、定量化分析活體生物組織中的物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)信息，具有較為明顯的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[9]。

基于反向光譜激發(fā)與探測(cè)方式，逆向SORS技術(shù)采用半徑可變的環(huán)形激發(fā)光束實(shí)現(xiàn)光譜激發(fā)，并在環(huán)形光束中心采集拉曼散射信號(hào)[7]。相比于常規(guī)SORS探測(cè)，通過使用半徑可控的環(huán)形激發(fā)光束(Δs連續(xù)變化)并合理設(shè)計(jì)系統(tǒng)光學(xué)結(jié)構(gòu)，逆向SORS光譜探測(cè)裝置更便于集成、封裝與使用。鑒于此，我們搭建了一套集成化逆向SORS光譜分析裝置[10]，并在不同空間偏移量條件下，實(shí)現(xiàn)了雙/三層組織模型內(nèi)深層拉曼光譜信息的檢測(cè)與分析。通過本項(xiàng)研究工作，我們不但建立并驗(yàn)證了該集成化逆向SORS光譜分析裝置的光譜檢測(cè)能力，而且為該裝置在經(jīng)皮無損探測(cè)方面的應(yīng)用研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 裝置

圖1(a)為集成化逆向SORS光譜分析裝置示意圖。該裝置采用785 nm半導(dǎo)體激光器(MDL-III-785-lock，長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)，中國(guó))作為激發(fā)光源，并通過光纖耦合與光束準(zhǔn)直器(F260APC-780，Thorlabs，美國(guó))實(shí)現(xiàn)均勻點(diǎn)光斑(直徑約為3 mm)準(zhǔn)直輸出。采用785 nm帶通濾波片(LD01-785/10-25，Semrock，美國(guó))消除激光邊帶光譜分量或雜散光的影響后，采用5°錐透鏡(AX255-B，Thorlabs，美國(guó))將準(zhǔn)直點(diǎn)光斑轉(zhuǎn)換為環(huán)形激發(fā)光束，并將其都放置于同一個(gè)伸縮管中，保證它們沿入射光光軸方向的穩(wěn)定移動(dòng)。本裝置的主要特點(diǎn)在于，通過將錐透鏡移入/移出激發(fā)光路以切換逆向SORS和背散射式拉曼光譜兩種不同的光譜檢測(cè)模式。當(dāng)錐透鏡沿垂直方向[圖1(a)的CD方向]插入光路，并沿著光軸的水平方向[圖1(a)的AB方向]移動(dòng)時(shí)，該裝置為精確控制激發(fā)光束半徑尺寸(Δs連續(xù)變化)可在樣品表面形成同心光環(huán)的逆向SORS光譜檢測(cè)模式；當(dāng)錐透鏡沿垂直方向[圖1(a)的DC方向]移出時(shí)，該裝置為背散射式拉曼光譜檢測(cè)模式，可從樣品表面提供零空間偏移的參考光譜，從而將環(huán)形照明光束變?yōu)闃悠繁砻嫔系狞c(diǎn)照明。點(diǎn)狀/環(huán)形激發(fā)光束被二向色鏡(Di03-R785-t1-25×36，Semrock，美國(guó))投射于樣品表面后，樣品表面和內(nèi)部溢出的漫散射拉曼光子，經(jīng)近紅外匹配消色差雙膠合透鏡對(duì)(MAP105050-B，Thorlabs, 美國(guó))收集后，通過陷波濾波片(NF785-33，Semrock，美國(guó))和長(zhǎng)通濾波片(LP02-785RU-25，Semrock, 美國(guó))組，由直徑為100 μm光纖(QMMJ-3A3A-IRVIS-100/140-3AS-3, OZ Optics, 加拿大)傳輸至光譜儀。采集到的光譜信號(hào)，由光譜儀(UHTS300, WITec GmbH, Ulm, 德國(guó))和背感光深度制冷電子倍增型相機(jī)(CCD, Du401ABR-DD-352, Andor Technology, Belfast, 英國(guó))記錄并分析。實(shí)驗(yàn)中，每次測(cè)量的積分時(shí)間為10 s，樣品表面激發(fā)光功率約為150 mW。

1.2 激發(fā)光束半徑計(jì)算方法

當(dāng)半徑為r0的準(zhǔn)直激光束照射時(shí)，錐透鏡將準(zhǔn)直光束轉(zhuǎn)換成環(huán)形光束照射到樣品表面[7]。通過沿光軸方向[圖1(a)所示AB方向]移動(dòng)錐透鏡，改變錐透鏡到二向色鏡之間的距離，精確控制激發(fā)光束的半徑大小(Δs)。在幾何近似下，圓環(huán)的寬度等于光束半徑r0，與錐透鏡到二向色鏡的距離無關(guān)[7]。偏離的環(huán)形光束的角度由β=(n-1)α給出，其中α是圖1(b)中錐透鏡的底角，n是錐透鏡的折射率。由于裝置系統(tǒng)中使用了邊長(zhǎng)為50.8 mm方形籠形立方體(C4W，Thorlabs, 美國(guó))和長(zhǎng)度為7.6 mm透鏡套管(SM1L03，Thorlabs，美國(guó))，因此，二向色鏡的中心到樣品位置的最大距離為33 mm[圖1(b)中的MN，MN′為MN的共軛平面，MN=MN′]。如圖1(b)所示，D是錐透鏡的尖端到二向色鏡中心的距離。假設(shè)α的角度較小，則光束在距離錐透鏡D0處分離成環(huán)形光束[7]

圖1 (a)集成化逆向空間偏移拉曼光譜實(shí)驗(yàn)裝置示意圖；(b)錐透鏡形成半徑可控的環(huán)形激光束原理示意圖

(1)

環(huán)半徑(r)可根據(jù)公式計(jì)算

r=(D+MN′-D0)tan[(n-1)α]

=(D+33 mm)tan[(n-1)α]-r0

(2)

因此，D是錐透鏡的尖端到二向色鏡中心的距離，即環(huán)半徑的函數(shù)

(3)

1.3 樣品模型

為了驗(yàn)證集成化逆向SORS光譜分析裝置的應(yīng)用潛力，分別采用雙層/三層生物組織模型用于實(shí)驗(yàn)光譜檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，分別將對(duì)乙酰氨基酚(石藥集團(tuán)，中國(guó)石家莊)貼于厚度為3和4 mm的羊肩胛骨上，制成雙層生物組織模型；在厚度分別為3和6 mm硅橡膠和對(duì)乙酰氨基酚粉末上放置一層2 mm厚的豬皮，制成三層生物組織模型。羊肩胛骨和豬皮均在當(dāng)?shù)厝獾曩徺I，實(shí)驗(yàn)前用緩沖鹽水沖洗干凈附著的血液和雜質(zhì)，并且使用商用切片機(jī)精確控制豬皮厚度，采用熱壓機(jī)制備厚度均勻的硅橡膠。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)之前，使用NIST可追蹤校準(zhǔn)燈(LS-1，Ocean Optics，美國(guó))校準(zhǔn)系統(tǒng)的光譜響應(yīng)，采用硅片的521 cm-1特征峰校準(zhǔn)系統(tǒng)檢測(cè)波長(zhǎng)。測(cè)量的光譜數(shù)據(jù)包括樣品的拉曼散射和瑞利散射信號(hào)、表面的漫反射以及自體熒光、環(huán)境噪聲等因素引起的背景噪聲。使用WITec Project 4(WITec GmbH，德國(guó))軟件，對(duì)測(cè)量得到的原始光譜依次采用5階多項(xiàng)式擬合和10點(diǎn)Savizky-Golay(S-G)平滑等方法，獲得較為純凈的拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

采用如圖2(a)所示的雙層組織模型，以0，4，4.5，5，5.5，6和6.5 mm的Δs條件，驗(yàn)證逆向SORS光譜分析裝置檢測(cè)能力。首先，在8個(gè)不同水平位置測(cè)量得到雙層模型平均光譜[如圖2(b)和(c)所示]，并對(duì)每組光譜300～1650 cm-1波數(shù)范圍的曲線下面積歸一化。圖2(b)和圖2(c)的頂部和底部分別表示由共聚焦顯微拉曼光譜儀(Alpha 500，WITec GmbH，Germany)單獨(dú)測(cè)量所得到的羊肩胛骨和對(duì)乙酰氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)參考拉曼光譜。

圖2 (a)厚度為3和4 mm的羊肩胛骨樣品圖片；(b)羊肩胛骨厚度d=3 mm；(c)d=4 mm的雙層生物組織模型在不同空間偏移量下獲得的平均拉曼光譜，在頂部和底部分別顯示單獨(dú)測(cè)量的羊肩胛骨和對(duì)乙酰氨基酚的參考拉曼光譜；(d)對(duì)乙酰氨基酚特征峰(1 326 cm-1)和羊肩胛骨特征峰(960 cm-1)相對(duì)拉曼強(qiáng)度比和空間偏移量的變化關(guān)系

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羊肩胛骨的拉曼特征光譜中最強(qiáng)的拉曼峰是960 cm-1(phosphateν1mode)，而1 070 cm-1(carbonateν1mode)和1 450 cm-1(—CH2bending of proteins)拉曼峰不太明顯[11-12]。對(duì)乙酰氨基酚在857 cm-1(para-substituted benzene ring respiratory vibration)[13]，1 238 cm-1(para-substituted benzene ring vibration)[13]、1 326 cm-1(amide CN stretching)和1 614 cm-1(C—C aromatic stretching peaks)處的拉曼峰比較明顯[14]。如圖2(b)所示，當(dāng)Δs由0 mm增加至6.5 mm時(shí)，對(duì)乙酰氨基酚1 326 cm-1拉曼特征峰貢獻(xiàn)逐漸增加，而羊肩胛骨960 cm-1拉曼特征峰貢獻(xiàn)呈同步下降趨勢(shì)。如圖2(c)所示，當(dāng)羊肩胛骨厚度增加到4 mm時(shí)，隨著Δs不斷增加，也可以觀察到與圖2(b)類似的結(jié)果。對(duì)比圖2(b)和圖2(c)可以發(fā)現(xiàn)，在相同Δs條件下，當(dāng)雙層模型中的羊肩胛骨厚度變大時(shí)，混合光譜中來自于羊肩胛骨的光譜貢獻(xiàn)更高，而來自第二層對(duì)乙酰氨基酚的光譜貢獻(xiàn)較低。

圖2(d)是雙層組織模型在不同羊肩胛骨厚度條件下，獲得的對(duì)乙酰氨基酚1 326 cm-1和羊肩胛骨960 cm-1特征峰強(qiáng)度比(R)，描述了對(duì)乙酰氨基酚和羊肩胛骨特征峰的相對(duì)拉曼強(qiáng)度比和空間偏移值的變化關(guān)系。結(jié)果顯示，不同厚度所對(duì)應(yīng)的R=I1 326/I960值均隨著Δs的增大而增大。并且，當(dāng)空間偏移值大于6 mm時(shí)，羊肩胛骨厚度為3 mm對(duì)應(yīng)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度呈加劇增長(zhǎng)趨勢(shì)，而羊肩胛骨厚度為4 mm對(duì)應(yīng)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度的增長(zhǎng)趨勢(shì)變得平緩。此外，在同一空間偏移條件(同一Δs數(shù)值)下I1 326/I960的值隨第一層物質(zhì)(羊肩胛骨)厚度增大而減小。這是由于隨著環(huán)形光束的半徑增大(即較大Δs數(shù)值)，其激發(fā)的深層物質(zhì)拉曼光子需要更長(zhǎng)的光程才能到達(dá)接收焦點(diǎn)，深層拉曼光子信號(hào)損失程度比表面拉曼光子損失程度更大，導(dǎo)致相對(duì)拉曼強(qiáng)度增長(zhǎng)變緩。對(duì)于給定的Δs，頂層樣品厚度增加會(huì)導(dǎo)致來自頂層的拉曼光子貢獻(xiàn)更高，從而減少第二層樣品的拉曼光譜貢獻(xiàn)。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們所搭建的集成化逆向SORS系統(tǒng)可以通過4 mm或更大厚度的堅(jiān)硬生物組織(例如羊肩胛骨)表面，無損探測(cè)其內(nèi)部及其下層物質(zhì)的生物化學(xué)信息。

圖3(a)所示的三層組織模型用于驗(yàn)證該系統(tǒng)無損檢測(cè)皮下組織狀態(tài)的可行性。實(shí)驗(yàn)中，我們將厚度約為2 mm的豬皮置于頂部，3或6 mm的硅橡膠用作樣品第二層，2 mm厚的對(duì)乙酰氨基酚粉末作為第三層。圖3(b)所示為實(shí)驗(yàn)測(cè)得的豬皮、硅橡膠和對(duì)乙酰氨基酚的參考光譜；圖3(c)和圖3(d)是三層模型，在不同Δs條件下，實(shí)驗(yàn)采集得到的樣品平均拉曼光譜。從圖3(b)可以看出，豬皮拉曼特征峰主要分布于853 cm-1(Ring breathing mode of tyrosine and C—C stretch of proline ring)[15]，935 cm-1(C—C stretching mode of proline and valine and protein backbone)[15]，1 450 cm-1(—CH2bending of proteins)[12]等位置處。硅橡膠的拉曼特征峰主要包括490 cm-1(Si—O—Si stretch)，711 cm-1(Si—C sym.stretch)，790 cm-1(CH3asym.rocking, Si—C asym.stretch)，863 cm-1(CH3asym.rocking)，1 266 cm-1(CH3sym.bending)和1 412 cm-1(CH3asym.bending)[16]。對(duì)比圖3(c)和(d)可看出，對(duì)于不同厚度硅橡膠的三層模型，隨著空間偏移量的增大，豬皮1 450 cm-1拉曼峰的貢獻(xiàn)逐漸減小，而硅橡膠490 cm-1拉曼峰和對(duì)乙酰氨基酚1 326 cm-1拉曼峰的貢獻(xiàn)均逐漸增大。

圖3 (a)三層組織模型示意圖；(b)豬皮、硅橡膠和對(duì)乙酰氨基酚的拉曼特征光譜；(c)3 mm硅橡膠和(d)6 mm硅橡膠組成三層組織模型在不同空間偏移量下測(cè)量的SORS光譜

圖4(a)是三層樣品模型在不同厚度硅橡膠條件下，硅橡膠(490 cm-1)和豬皮特征峰(1 450 cm-1)的相對(duì)強(qiáng)度比R=I490/I1 450。與之類似，圖4(b)是對(duì)乙酰氨基酚(1 326 cm-1)和豬皮(1 450 cm-1)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度比R=I1 326/I1 450?？梢钥闯?，對(duì)于硅橡膠厚度為3和6 mm的三層樣品模型，I490/I1 450和I1 326/I1 450的比值隨著Δs的增大而增大。然而，對(duì)于不同的硅橡膠厚度，當(dāng)Δs≥4 mm時(shí)，I490/I1 450迅速增加；當(dāng)Δs>5 mm時(shí)，I490/I1 450的增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于平緩[如圖4(a)所示]。通過比較圖4(a)和(b)可以看出，當(dāng)硅橡膠的厚度一定時(shí)，I1 326/I1 450相比于I490/I1 450來說增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定。原因在于，底層物質(zhì)(對(duì)乙酰氨基酚)在三層組織模型中的深度更大，從而需要更大的Δs檢測(cè)條件才能收集到其拉曼散射光子信息。

圖4 (a)硅橡膠(490 cm-1)和豬皮(1 450 cm-1)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度比和Δs的變化關(guān)系；(b)對(duì)乙酰氨基酚(1 326 cm-1)與豬皮(1 450 cm-1)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度比和Δs的變化關(guān)系；硅橡膠厚度分別為3和6 mm

在搭建集成化逆向SORS光譜分析裝置的基礎(chǔ)上，我們通過采用雙層和三層生物組織模型，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該套實(shí)驗(yàn)裝置可探測(cè)8 mm深度位置生物模型內(nèi)的拉曼散射信息。此外，隨著Δs的增加，獲取的SORS光譜中較深層的拉曼信號(hào)貢獻(xiàn)也會(huì)增加，這更有利于深層物質(zhì)組成信息的分析。在后續(xù)的工作中，我們?cè)谝阎嘘P(guān)樣品光學(xué)特性的條件下，需要進(jìn)一步通過蒙特卡洛模擬等方法，分析給定空間偏移量條件下拉曼信號(hào)探測(cè)的近似深度。此外，雖然現(xiàn)有的結(jié)果驗(yàn)證了集成化逆向SORS光譜分析裝置在經(jīng)皮無損探測(cè)方面的應(yīng)用潛力，但仍需要通過設(shè)計(jì)使用采集效率更高的光纖束結(jié)構(gòu)與光譜收集方式提高系統(tǒng)的信噪比，從而進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的應(yīng)用性能。

3 結(jié) 論

通過搭建集成化逆向SORS光譜分析裝置，實(shí)現(xiàn)了多層組織模型深層光譜信息的快速、無損檢測(cè)與分析。此外，結(jié)合集成化實(shí)驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)，根據(jù)幾何光學(xué)理論和投影測(cè)量原理，量化表述了空間偏移量(Δs)與錐透鏡空間位置之間的關(guān)系，為精確控制光譜檢測(cè)條件提供了保障。具體實(shí)驗(yàn)過程中，分別采用羊肩胛骨/對(duì)乙酰氨基酚組成的雙層模型和豬皮/硅橡膠/對(duì)乙酰氨基酚組成的三層模型，驗(yàn)證了該集成裝置的探測(cè)能力。結(jié)果表明，根據(jù)深層與表層物質(zhì)的相對(duì)拉曼強(qiáng)度比值關(guān)系，可以判斷該系統(tǒng)具有從8 mm深度生物模型下獲得光譜信息的檢測(cè)能力，在突破了傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)的探測(cè)深度的條件下，有利于在體組織經(jīng)皮無損深層光譜檢測(cè)與分析。在這一研究工作基礎(chǔ)上，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化光學(xué)設(shè)計(jì)，使用采集效率更高的光纖束結(jié)構(gòu)與光譜收集方式，提高該集成系統(tǒng)的信噪比，優(yōu)化其在低濃度和弱拉曼散射材料光譜檢測(cè)方面的適用性。