地黃藥材的紅外指紋圖譜及多元統(tǒng)計(jì)分析

張維方，樊克鋒，雷敬衛(wèi)*，紀(jì) 亮

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2.河南省中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046 3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

引 言

中藥地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鮮或干燥塊根[1]；始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有補(bǔ)血滋陰、清熱生津、涼血止血、益精填髓等功效[2]。生地黃是將地黃新鮮或干燥塊根緩緩烘焙至約八成干所得，生地黃性味甘、寒，歸、心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津等功效，用于溫毒發(fā)斑、熱入營(yíng)血等癥。地黃主要產(chǎn)于河南、山東、山西、河北等地，由“今人惟以懷慶地黃為上，亦各處隨時(shí)興廢不同爾”等本草考證可知，河南作為地黃道地產(chǎn)區(qū)的地位沒(méi)有動(dòng)搖，故河南產(chǎn)地黃亦稱為懷地黃，是我國(guó)著名的“四大懷藥”之一，主產(chǎn)于河南溫縣、博愛(ài)、武陟、沁陽(yáng)、孟州等地[3]。目前多運(yùn)用HPLC技術(shù)對(duì)于地黃化學(xué)成分和質(zhì)量進(jìn)行定性和定量鑒別[4]，此方法需要復(fù)雜的樣品前處理且周期較長(zhǎng)，而傅里葉變換紅外光譜法，避免了復(fù)雜的樣品前處理，最大限度保留藥材的原始信息，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥材的快速、無(wú)損檢測(cè)[5]。

中藥是復(fù)雜的混合物體系，其紅外光譜圖呈現(xiàn)出混合物體系中其各種成分的疊加譜，在同一峰位處，每種成分中只要具有相同的基團(tuán)或者官能團(tuán)，都會(huì)在此峰位處有一定的吸收[6]。因此，光譜圖中的每個(gè)峰，都不僅代表一種物質(zhì)，而是多種物質(zhì)的疊合峰，此光譜圖也就構(gòu)成了圖譜的宏觀“指紋”性，同時(shí)也具有整體性特點(diǎn)，憑借其整體宏觀“指紋”性特征，可直接或間接進(jìn)行中藥的鑒定鑒別與質(zhì)量評(píng)價(jià)[7]。IR光譜具有整體性，客觀性和科學(xué)性，可全面反映藥材質(zhì)量，化學(xué)計(jì)量學(xué)可以數(shù)字化的表達(dá)光譜信息，兩者結(jié)合可更加客觀地評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量[9]。本研究采用紅外光譜技術(shù)，建立不同產(chǎn)地生地黃的紅外指紋圖譜，結(jié)合正態(tài)分布分析、聚類分析(CA)和主成分分析(PCA)鑒別不同產(chǎn)地生地黃，為快速鑒別地黃、控制質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外分光光度計(jì)為Spectrum 100 型(美國(guó)Pekin Elmer公司)；紅外分析采用Spectrum for window3.02軟件；粉末壓片機(jī)為FW-4A型(天津市拓?fù)鋬x器有限公司)；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)；101-3AB型點(diǎn)熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；ME204E/OL型萬(wàn)分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；溴化鉀(光譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；瑪瑙研缽。

1.2 樣品采集

43批地黃藥材(編號(hào)：S1—S43)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為玄參科植物地黃(R.glutinosaLibosch.)的干燥塊根，30批河南產(chǎn)地黃藥材(編號(hào)：S44—S73)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為河南產(chǎn)懷地黃。取地黃藥材樣品洗凈，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中55 ℃烘干，樣品粉碎，過(guò)200目篩，放入干燥器中備用。藥材樣品信息來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表

1.3 紅外光譜采集

取樣品2 mg與120 mg KBr置于瑪瑙研缽研磨均勻，取適量混合均勻的樣品置于專用壓片模具中，以8 MPa壓力壓制30 s，壓成均勻半透明的薄片，然后將薄片放置于紅外燈下保持樣品片干燥，采用紅外光譜儀采集各樣品紅外光譜圖。光譜范圍4 000～450 cm-1，每張光譜掃描次數(shù)16次·s-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描速度0.2 cm·s-1，掃描時(shí)扣除CO2和H2O，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度為25%～35%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將各樣品紅外原始光譜用Spectrum for window3.02軟件進(jìn)行處理，分別進(jìn)行基線校正、歸一化處理并計(jì)算紅外光譜相對(duì)峰高，以不同產(chǎn)地地黃的相對(duì)峰高為原始數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件對(duì)不同產(chǎn)地地黃進(jìn)行聚類分析及主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地地黃紅外光譜分析

取不同產(chǎn)地地黃樣品按照1.3節(jié)壓制樣品片并掃描其紅外光譜。從不同產(chǎn)地生地黃紅外光譜圖可看出，其紅外光譜指紋圖譜峰形、峰位、峰高基本相似，不同產(chǎn)地地黃中含有相同的化學(xué)成分，所含的特征峰、形狀基本一致，其中河南產(chǎn)地有個(gè)別特征峰的高度突出，指紋區(qū)存在一定差異，如圖1所示。

圖1 不同產(chǎn)地生地黃紅外透過(guò)率疊加光譜

圖2 各產(chǎn)地生地黃紅外吸光度平均圖譜

2.2 正態(tài)分布分析

運(yùn)用Spectrum for window3.02軟件將最初得到的紅外光譜圖由透過(guò)率T%轉(zhuǎn)換成吸光度A，再依次進(jìn)行基線校正，因生地黃中糖苷類成分最多，故選擇1 200～900 cm-1波段范圍內(nèi)的最高峰歸一處理，再分別計(jì)算特征峰相對(duì)峰高，如圖3所示。得到一系列相關(guān)峰相對(duì)峰強(qiáng)值，經(jīng)過(guò)對(duì)這些相對(duì)峰強(qiáng)度值去除離散值后，因河南為地黃的道地產(chǎn)區(qū)，對(duì)河南產(chǎn)的懷地黃(S44—S73)與其他省份(S1—S43)中各個(gè)省份地黃進(jìn)行比較，利用正態(tài)分布曲線圖進(jìn)行輔助分析，如圖4(a, b, c)所示，發(fā)現(xiàn)在1 639 cm-1處，河南產(chǎn)的懷地黃與其他省份的正態(tài)分布曲線交叉依次為：山東省>山西省>河北省，因此本方法能很好地將道地藥材與非道地藥材區(qū)分開(kāi)。

圖3 不同產(chǎn)地生地黃的相對(duì)峰高

圖4 不同產(chǎn)地生地黃正態(tài)分布曲線圖

2.3 聚類分析

運(yùn)用Spectrum for window3.02軟件將所采集的紅外原始光譜由透過(guò)率T%轉(zhuǎn)換成吸光度A，進(jìn)行自動(dòng)基線校正，自動(dòng)平滑處理。選擇1 200～900 cm-1波段范圍內(nèi)的最高峰的吸光度歸一化處理，計(jì)算13個(gè)特征峰的峰強(qiáng)度。以73批不同產(chǎn)地地黃樣品的13個(gè)特征峰的相對(duì)峰強(qiáng)度為原始數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)輸入SPSS19.0軟件，采用組間連接法，以平方Euclidean距離為分類依據(jù)，橫坐標(biāo)為組間距離，縱坐標(biāo)為樣品編號(hào)，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)組間距離=10時(shí)，各省地黃基本上各自聚為一類，其中山東省生地黃(S38—S43)與山西生地黃(S9—S37)明顯各自聚為一類；當(dāng)組間距離=15時(shí)，不同產(chǎn)地生地黃藥材可聚為2類，S1—S43聚為一類，S44—S73聚為一類即懷地黃聚為一類，山西、山東、河北等地的地黃藥材聚為一類，說(shuō)明河南產(chǎn)的懷地黃內(nèi)部質(zhì)量與山西、山東、河北的地黃藥材存在一定差異。

圖5 聚類分析樹(shù)狀圖

2.4 主成分分析

主成分分析是從多個(gè)變量之間的聯(lián)系入手，利用降維思想，將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)、能反映原始變量信息變量的統(tǒng)計(jì)分析方法，在指紋圖譜研究中具有簡(jiǎn)明、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。以73批地黃樣品13個(gè)共有峰相對(duì)峰強(qiáng)度為原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS19.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理進(jìn)行降維因子分析，主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表2，因前兩個(gè)因子累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.101%>85%，充分代表了地黃樣品13個(gè)共有峰的基本特征和主要信息，故選取其中特征值大于1的前2個(gè)主成分特征值分別為9.398和1.925因子作為主成分1、主成分2。由圖6可見(jiàn)前2個(gè)因子斜率陡峭，后趨于平緩，可將前2個(gè)因子作為主成分。

圖6 主因子碎石圖

表2 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向，將各特征向量中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后，73批樣品的主成分得分圖(圖7)，河南產(chǎn)地黃樣品與主成分1均呈正相關(guān)，與主成分2大體呈正相關(guān)；山東產(chǎn)地地黃樣品與主成分1呈負(fù)相關(guān)，與主成分2大體呈正相關(guān)；山西產(chǎn)地地黃樣品與主成分1部分呈正相關(guān)，與主成分2均呈負(fù)相關(guān)；河北產(chǎn)地地黃樣品與主成分1呈負(fù)相關(guān)，與主成分2呈正相關(guān)。綜合得分計(jì)算是以主成分的貢獻(xiàn)率為權(quán)數(shù)對(duì)主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，即：主成分綜合得分=(72.291×主成分1得分+14.810×主成分2得分)/87.101。對(duì)73批地黃樣品主成分綜合得分進(jìn)行降序排列，綜合得分越高表明藥材質(zhì)量越好[9]。如表3所示，主成分綜合得分排序河南產(chǎn)地地黃主成分得分排名最為靠前，其次為山西運(yùn)城地黃，排名最后的為山東產(chǎn)地地黃，表明地黃質(zhì)量最好的為河南產(chǎn)區(qū)，山西產(chǎn)區(qū)次之，結(jié)合表3、圖7可知對(duì)于地黃品質(zhì)影響較大的為主成分1。

表3 主成分綜合得分排序表

圖7 不同產(chǎn)地地黃2個(gè)主成分的排序坐標(biāo)圖

3 結(jié) 論

傅里葉變換紅外光譜分析避免了復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，紅外光譜作為分子結(jié)構(gòu)分析方法之一，是官能團(tuán)結(jié)構(gòu)解析、未知物結(jié)構(gòu)鑒定及其偽造摻假鑒別等的重要方法。紅外光譜特征的信息整體性表征復(fù)雜混合物體系化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性。根據(jù)生地黃的化學(xué)成分特征來(lái)確定它的主成分特征峰和與其對(duì)應(yīng)的特征波段, 確認(rèn)具有的特征吸收峰(峰位置、峰形狀以及相對(duì)峰高)。將地黃圖譜進(jìn)行基本處理后，對(duì)1 200～900 cm-1進(jìn)行歸一化處理，共標(biāo)定13個(gè)共有峰，對(duì)其進(jìn)行相對(duì)峰高的計(jì)算后，發(fā)現(xiàn)1 639 cm-1處河南產(chǎn)懷地黃峰高均值>0.45、1 424 cm-1處河南產(chǎn)懷地黃峰高均值≥0.55、1 354 cm-1處河南產(chǎn)懷地黃峰高均值>0.45和1 260 cm-1處河南產(chǎn)懷地黃峰高均值≥0.37，其他產(chǎn)地地黃這四個(gè)相對(duì)峰高均低于河南產(chǎn)懷地黃，可以此4個(gè)峰高為參考依據(jù)來(lái)區(qū)分懷地黃與其他地黃。

在不同產(chǎn)地中，河南產(chǎn)的懷地黃與其他省份地黃的圖譜比較中，其光譜圖均有“菩薩身”紅外特征峰吸收。但因生長(zhǎng)過(guò)程中不同的氣候、溫度、濕度、光照時(shí)間、土壤性質(zhì)(例如酸堿性等、施肥、加工)等條件的影響，其質(zhì)量就會(huì)存在較大的差異。1 900～1 750 cm-1(主要為酯類)、1 700～1 500 cm-1(主要為酸類)和1 200～950 cm-1(主要為糖類)范圍內(nèi)的振動(dòng)吸收均有差別，主要就是在同一年限不同產(chǎn)地的條件下，由于各個(gè)地方氣候、濕度、溫度、土壤性質(zhì)等等一系列條件的影響，進(jìn)而導(dǎo)致各個(gè)產(chǎn)地地黃中所含大分子物質(zhì)酯、酸、糖的相對(duì)含量各有不同，最后在紅外吸收光譜圖中表現(xiàn)出同一峰位處峰的相對(duì)強(qiáng)弱。紅外指紋圖譜結(jié)合正態(tài)分布、聚類分析和主成分分析為地黃的道地性檢驗(yàn)提供了便捷的方法，也為地黃資源的綜合開(kāi)發(fā)提供參考。