基于微區(qū)XRF技術(shù)的海洋生物元素快速無損檢測

林梵宇，尹希杰*，鄭新慶 ，黃杰超，梁毓娜

(1.自然資源部 第三海洋研究所,福建 廈門 361005；2.福建省海洋生態(tài)保護與修復(fù)重點實驗室,福建 廈門 361005；3.自然資源部 海峽西岸海島海岸帶生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站,福建 廈門 361005)

金屬元素在不同的海洋生物之間的分布常常表現(xiàn)出差異化富集的特點,一般常見的金屬元素在雙殼類生物中的含量最高,其次是頭足類或蝦蟹類,魚類中含量最低[1-2],且底層魚類的金屬元素富集能力總體來說大于中上層魚類[3]。這種差異主要由生物的攝食習(xí)慣、環(huán)境偏好和食物鏈層級的差異性導(dǎo)致。此外,生物不同器官中的金屬元素分布往往也存在差異,其分布特點可指示海洋生物的生理過程和代謝途徑。例如雙殼貝類體內(nèi)的金屬硫蛋白可以結(jié)合多種金屬元素,從而造成強富集效果,指示了體內(nèi)參與硫蛋白結(jié)合機制的相應(yīng)位置[4]。不同元素在魚類內(nèi)臟和鱗片中的含量差異特征與金屬元素進入魚體的途徑有關(guān),通過攝食途徑進入體內(nèi)的元素多在內(nèi)臟中累積,而通過體表或黏膜滲透途徑進入體內(nèi)的元素則在鱗片和鰓中含量較高,而肌肉中含量則相對較低[5]。

由于海洋生物對環(huán)境重金屬元素具有積累作用,其含量可用于揭示其周邊環(huán)境的變化過程。隨著海洋環(huán)境污染日益嚴重,很多海洋無脊椎動物已被作為重金屬污染的指示生物[6]。如畢士川等[7]在不同季節(jié)調(diào)查同種水產(chǎn)品的鉛(Pb)含量時發(fā)現(xiàn),隨著雨季來臨,污染物進入水體造成貝類和頭足類中Pb含量比其他季節(jié)偏高；史可江等[8]在對工業(yè)區(qū)下游等水域的生物進行重金屬含量檢測時,常?？蓹z測出鎘(Cd)、Pb等含量不同程度的超標；姜可磊等[9]對湖相沉積物中介形類殼體的鎂(Mg)、鍶(Sr)和鈣(Ca)的含量進行分析,發(fā)現(xiàn)其比值關(guān)系可以反映生存環(huán)境溫度、堿度及季節(jié)變化的相關(guān)信息；李志良等[10]對Pb、Cd、Zn、錳(Mn)和銅(Cu)五種重金屬元素分別在銅銹環(huán)棱螺(Bellamya aeruginosa)的殼、內(nèi)臟團及外套膜等不同部位富集程度進行研究,可作為指示湘江水體生態(tài)系統(tǒng)重金屬污染的生態(tài)風(fēng)險評估指標。

近年來高分辨、原位和無損檢測生物體中元素分布技術(shù)成為相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的熱點,其主要包括微區(qū)XRF技術(shù)、電鏡能譜聯(lián)用技術(shù)、激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)、同步輻射技術(shù)及激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)等。馮流星和王軍[11]通過激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)對山羊腦和牛肝組織切片標準樣品中的鐵(Fe)進行了定量檢測；袁靜和羅立強[12]通過同步輻射技術(shù)研究了蚯蚓樣品中毒性元素的富集作用；萬雄等[13]通過激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)研究重金屬污染的魚體內(nèi)Pb、鋇(Ba)等毒性元素的含量及分布特點等。微區(qū)XRF技術(shù)此前多應(yīng)用于礦物、巖石類樣品的元素微區(qū)分布特征研究領(lǐng)域[14],國外研究者嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于植物樣品的檢測并獲得良好的結(jié)果[15],但該技術(shù)鮮有用于海洋生物檢測的報道。由于該技術(shù)對樣品表面的平整度沒有太高的要求,檢測屬于原位無損分析,前處理過程簡單,可一次性獲得多種無機元素信息,最重要的是和其他技術(shù)相比,能夠獲得相對較大樣品元素的分布信息,因此特別適合不同大小、不同類型和形狀海洋生物樣品表面元素的分布測定。本研究嘗試將微區(qū)XRF技術(shù)應(yīng)用于多種不同類型的海洋生物樣品元素分布測試,證明該技術(shù)可針對不同種類生物的體表層元素分布特點進行可視化展示,為后續(xù)該技術(shù)在調(diào)查海洋樣品元素分布方面的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器為微區(qū)X 射線熒光分析儀(Ixrfsystems公司,型號ATLAS),采用了10μm 光斑的聚束毛細管X 射線透鏡作為激發(fā)源。

1.2 樣品類型及預(yù)處理

采集魚、蝦、雙殼貝類和海膽外殼四種樣品,具體為六帶擬唇魚(Pseudocheilinus hexataenia)、假綿羊蝦(Saron rectirostris)、無鱗硨磲(Tridacna derasa)和高腰海膽(Mespilia globulus)。其中,無鱗硨磲取自中國科學(xué)院南海海洋研究所海南熱帶海洋生物實驗站養(yǎng)殖的硨磲幼貝自然死亡個體；魚、蝦和海膽樣品均采購自廈門市內(nèi)觀賞水族市場,樣品自然死亡后,利用自來水和雙蒸水對其進行簡單清洗,并置于60 ℃烘箱中2～3 d待水分烘干。烘干后采用微區(qū)X 射線熒光分析儀進行樣品表面元素的檢測。

1.3 實驗方法與數(shù)據(jù)處理

1.3.1 微區(qū)XRF掃描及分析步驟

將干燥的樣品固定于樣品臺上,由于生物類樣品略不平整,所以調(diào)整樣品與X射線探頭的距離,使樣品大部分位于合適焦距的位置。面掃時,X射線功率設(shè)置為50 keV,檢測器頻率(Tc)＝1.0μs,單點掃描步長根據(jù)樣品面積大小調(diào)整,對于六帶擬唇魚、假綿羊蝦、無鱗硨磲和高腰海膽樣品,掃描步長分別為22、22、23和21μm,單點駐留時間設(shè)置為30 ms。掃描完成后,對能譜信號進行元素組成的譜圖解析。針對樣品單點掃描的平行性研究,選擇了六帶擬唇魚樣品背部、無鱗硨磲外殼近接合處及無鱗硨磲外殼邊緣處的隨機單點,分別進行5次單點掃描分析,點駐留時間200 s,檢測器頻率(Tc)＝1.0μs。掃描完成后,對5次單點掃描的平行性進行均值分析、標準偏差(Standard Deviation,STD)分析、相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與后處理

微區(qū)XRF設(shè)備自帶軟件可生成多種格式類型的數(shù)據(jù)。一方面,軟件根據(jù)能譜解析的各種元素種類及信號強度值進行歸一化處理,得到不同元素的分布圖,分布圖中不同的顏色分別代表不同的元素,顏色越深則表示該元素在某位置的信號強度越強。軟件還可以在簡單的參數(shù)設(shè)定后對不同元素圖像進行疊加處理,在同一副畫面中以不同顏色表示不同元素,同時展示多種元素的分布特點,從而更加便于觀察元素分布情況的正負相關(guān)性。另一方面,如需獲得熱圖、色差圖等圖像,或?qū)?shù)據(jù)進行深度處理(例如不同元素的比例等),則需要將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至外部軟件進行加工。將檢測獲得的元素信號強度值存為txt文件制成excel表格并導(dǎo)入Originlab公司的制圖軟件Origin 7.0中,在制圖軟件中調(diào)整合適的坐標參數(shù)使圖像能清晰反映元素分布細節(jié)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦類樣品

對烘干后的假綿羊蝦樣品進行了面掃分析。結(jié)果顯示,在假綿羊蝦樣品中,元素表面分布特征在樣品不同器官位置存在差異性:氯(Cl)、鉀(K)和硫(S)等主要分布在蝦眼部、頭部的肝胰腺及腹部等部分附肢中；Ca、Cd、Sr和磷(P)等在整個蝦殼體表層則分布比較均勻；而在Cl、K和S等元素含量高的器官體表位置,Ca、Cd、Sr和P的含量則相對較低(圖1)。選取Ca和Cl兩個元素作為代表進行分布圖疊加,可以清晰見到選取元素分布在上述位置的差異。進一步對Ca與Cl信號強度比值進行熱力圖成像,同樣驗證了元素分布上存在差異(圖1)。

圖1 假綿羊蝦中部分元素的分布特征及Ca與Cl元素的相關(guān)性分析Fig.1 Distribution characteristics of some elements in Saron rectirostris and correlation analysis of Ca and Cl

2.2 魚類樣品

對烘干后的六帶擬唇魚樣品進行面掃分析。結(jié)果顯示,P比較均勻地分布在魚的鱗片上,在沒有鱗片的頭部前段含量很低；K 在魚腹部和背部含量較高,S在魚背部的含量較低,進一步對魚身從腹部到背部的線掃描分析發(fā)現(xiàn),K 和S含量在魚身的大部分區(qū)域含量高低趨勢是完全一致的,但從魚側(cè)線到背部頂端的區(qū)域,2種元素的含量高低呈現(xiàn)完全相反的趨勢；Cl的分布特點與S有一定的相似性,但在魚尾部和頭部的部分區(qū)域明顯存在很高的含量；Fe在魚體中呈不規(guī)律的點狀分布；Zn在魚背部腹部含量稍高,在魚眼中的含量最高(圖2)。

圖2 六帶擬唇魚中部分元素的分布特征及K 與S元素的相關(guān)性分析Fig.2 Distribution characteristics of some elements in Pseudocheilinus hexataenia and correlation analysis of K and S

2.3 雙殼貝類樣品

對雙殼貝類樣品無鱗硨磲進行微區(qū)面掃分析,結(jié)果顯示,雙殼貝類樣品與蝦類樣品具相似的特征,即Ca與Cl含量疊加互補分布。對2種元素的疊加圖分析可知(圖3),在無鱗硨磲樣品邊緣區(qū)域,Ca信號強度值大大超過Cl,而Cl則在無鱗硨磲主體部分呈點狀分布,其分布區(qū)域正好與Ca互補。進一步對Ca和Cl信號強度值的相關(guān)性進行點圖分析發(fā)現(xiàn),2種元素相關(guān)性特征主要分為兩簇點群,一部分在Cl含量極低的區(qū)域,主要在無鱗硨磲的周邊部分,Ca含量從低到高均勻分布；其余部分Cl和Ca的含量呈負相關(guān)關(guān)系。除此2種元素之外,還可發(fā)現(xiàn)K 和硅(Si)在無鱗硨磲上點狀分布,P在無鱗硨磲除脊線以外的部分均勻分布,Al在無鱗硨磲除脊線以外的部分呈現(xiàn)點狀分布特征,而脊線的部分S含量較高(圖3)。

圖3 無鱗硨磲中部分元素的分布特征及Ca與Cl元素的相關(guān)性分析Fig.3 Distribution characteristics of some elements in Tridacna derasa and correlation analysis of Ca and Cl

2.4 海膽外殼

對高腰海膽外殼樣品進行了面掃分析。結(jié)果顯示,K、Cu、Fe、Mn和鈦(Ti)沿海膽外殼環(huán)向不同的區(qū)域分布；P、Ca、Cl和鋁(Al)則沿縱向不同區(qū)域分布,其中Cl的含量高低與P和Ca等元素存在互補特性；S主要分布在疣突區(qū)域,與其他元素反向互補；Si含量極低,呈零星點狀分布(圖4)。

圖4 高腰海膽中部分元素的分布特征Fig.4 Distribution characteristics of some elements in Mespilia globulus

2.5 單點掃描及數(shù)據(jù)平行性分析

為驗證設(shè)備的穩(wěn)定性,對六帶擬唇魚樣品背部、無鱗硨磲外殼近接合處及無鱗硨磲外殼邊緣處分別選取了隨機單點,各進行5次單點掃描分析。結(jié)果可見,對于大部分元素而言,5次掃描半定量值的相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)在8.2%以內(nèi),相對標準偏差較小。對于少量含量特別低的元素,如六帶擬唇魚樣品背部的Si、Cr和Cu以及無鱗硨磲外殼邊緣處的P 等,由于信號值很低,其半定量值均在0.25%以下,所以相對標準偏差較大,約為13.6%～26.5%(表1)。由于能譜設(shè)備屬于半定量檢測設(shè)備,因此,在不存在標樣及樣品基質(zhì)背景復(fù)雜的情況下,多次點掃描證實了樣品檢測的各元素平行性大體良好,可以真實反映元素在樣品中的分布特征。

表1 微區(qū)XRF的平行性驗證Table 1 Parallelism verification of micro-XRF detection

3 討論

微區(qū)XRF技術(shù)已應(yīng)用于地質(zhì)和植物樣品元素分布特征研究。在陸緣沉積物鉆取巖芯制成的地質(zhì)薄片樣品中,該技術(shù)用于測試與古氣候和古環(huán)境相關(guān)的示蹤性元素分布,利用元素分布特征研究沉積物質(zhì)來源,推測其成巖演化過程[16]。在礦物鑒定領(lǐng)域,微區(qū)XRF 技術(shù)用于指示鉛鋅礦和閃鋅礦中異常元素的分布特點,從而用于區(qū)分方鉛礦和閃鋅礦等類質(zhì)同相礦物,提高鉛鋅類礦物鑒定的準確性[17]。2017年羅立強等[18]將該技術(shù)應(yīng)用于植物對毒性元素的耐受機制研究,分析了生物膜間的元素遷移情況和玉米(Zea mays)種子發(fā)芽過程中的元素分布特征。2020年Harvey等[19]將植物中的特征元素硒(Se)作為指標,結(jié)合微區(qū)XRF技術(shù)及液相質(zhì)譜技術(shù)等方法,研究其分布特征及存在形式,從而證實老葉到新葉的元素傳輸路徑。

本研究通過微區(qū)XRF技術(shù)對海洋生物樣品的體表元素分布進行了檢測。在掃描過程中,根據(jù)樣品基質(zhì)不同,微區(qū)XRF設(shè)備對樣品的檢測深度存在差異。在X 射線波長不變的情況下,其穿透深度與樣品的質(zhì)量吸收系數(shù)及密度有關(guān),即樣品的平均原子序數(shù)越小(輕元素含量高),穿透深度越大。由于基質(zhì)的復(fù)雜性,其具體穿透深度無法準確確定。如果是硬質(zhì)外殼類型,如海膽外殼或硨磲,X 射線的穿透深度通常在幾十微米到200μm；如果是魚蝦等樣品,穿透深度可達100μm 到幾百微米[20]。在掃描后的數(shù)據(jù)解析過程中,由于目前常規(guī)能譜檢測器無法完全分辨能級位置非常接近的譜峰,正確的譜圖解析對準確獲得元素種類十分重要。在實際分析中,判斷能譜峰是否真實可靠的主要方法包括:①譜峰形態(tài)是否明顯呈現(xiàn)高斯正態(tài)分布特征,形態(tài)分布不規(guī)則的譜峰往往需要重新檢查是否存在合峰或逃逸峰的干擾；②同種元素不同譜線的高度是否異常,對于同種元素的不同譜線之間應(yīng)當存在信號強度值的相關(guān)性,體現(xiàn)在譜峰高度之間存在適當?shù)谋壤P(guān)系。以本研究的假綿羊蝦樣品中Cd元素的解析為例,由于生物樣品表面K 含量很高,因此Cd-Lβ能譜峰(3.317 ke V)與K-Kα能譜峰(3.314 ke V)無法完全分離,且K-Kα能譜峰尾對響應(yīng)值較低而位置接近的Cd-Lα能譜峰(3.134 ke V)帶來巨大干擾。在Cd-Lα與Cd-Lβ能譜峰受到干擾的情況下,為判斷Cd是否真實存在,選取受干擾較小的Cd-Kα能譜峰(23.174 ke V)進行分析并最終成圖。

在對海洋生物樣品的元素分布研究上,微區(qū)XRF技術(shù)存在自身的優(yōu)缺點。X 射線作為激發(fā)源確保了檢測過程的原位及無損。能譜檢測器的特性決定了該技術(shù)可同時對樣品表面大多數(shù)元素的分布特征成像。本研究表明,該技術(shù)對樣品前處理的要求很低,只需簡單的清洗烘干即可,且可檢測的樣品表面積較大,樣品表面不需經(jīng)過特定的平整化處理,盡可能保持了樣品的原貌。這有利于表面平整度不高、表面積相對較大的海洋生物樣品快速檢測。當然,該技術(shù)也存在一定的缺陷,由于X 射線激發(fā)源對低原子序數(shù)元素的過高穿透性和對高原子序數(shù)元素?zé)o法激發(fā)[20],在檢測這2類元素時難以產(chǎn)生足夠強度的信號,因此該技術(shù)難以分析原子序數(shù)過低或過高的元素。而生物樣品中有機元素的含量通常較高,本文中各類生物樣品的檢測中,難以獲得低原子序數(shù)的碳(C)、氫(H)、氧(O)、氮(N)等元素信號。此外,能譜檢測器的檢出限較高,在分析樣品中含量特別低的元素時也存在困難。例如,將本研究中的假綿羊蝦樣品進行縱切面后嘗試對其內(nèi)臟器官表面Hg的分布情況進行檢測,由于Hg含量低于能譜檢測器的檢出限,未能獲得與背景存在顯著差異的Hg信號。該技術(shù)屬于半定量技術(shù),無法對于樣品中的元素含量進行精確定量。先前針對其他樣品的研究表明,在僅需要對較小面積的樣品中低含量元素或低原子序數(shù)元素的分布特點進行檢測時,可采用激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[21]以獲得較精確的定量信息,采用LIBS技術(shù)[22]或同步輻射技術(shù)[23]研究低原子序數(shù)元素的分布情況。

經(jīng)過對海洋生物體樣品體表的微區(qū)掃描發(fā)現(xiàn),元素在不同生物體表層的富集器官是存在明顯差異的,這有助于研究者將該技術(shù)應(yīng)用于探討重金屬元素如何在生物體表層富集的潛在可能性。在六帶擬唇魚樣品的線掃描研究中,K 與S的分布在側(cè)線到腹部的位置呈現(xiàn)完全的正相關(guān)性,而在側(cè)線向背部的部分則呈現(xiàn)負相關(guān)性,這一特點暗示著側(cè)線為分界線的表層元素分布特征差異性,有助于研究者對其原因進行進一步深入探索。在假綿羊蝦、無鱗硨磲和高腰海膽外殼中均發(fā)現(xiàn)Ca和Cl的分布互補性,這可能與海水中氯離子(Cl－)在不同表面的沉積情況有關(guān),在富含鈣質(zhì)的殼體表面Cl不易富集,其真實原因尚待進一步的實驗證實。如果將元素分布特征與環(huán)境變化特征進行比較,將對生物生長過程中的環(huán)境改變具有啟示作用。例如在假綿羊蝦樣品中,本研究得到了Ca和Sr的分布特征,而鍶鈣比在多種水生生物中被證明是與環(huán)境中的鹽度、溫度等因素及生物攝食情況密切相關(guān)的[24-25]。此外,硨磲外殼體具有年紋層,其分層特點包含形成時的氣候環(huán)境信息,是一種分辨率較好的古氣候研究載體。由于硨磲外殼體中主要成分為碳酸鈣(CaCO3),含量在90%以上[26],檢測其他低含量元素的分布特點常常存在困難,而通過本實驗室高靈敏度檢測器的微區(qū)XRF設(shè)備可以獲得硨磲外殼表層多種不同元素的差異性分布特征,為研究者在后續(xù)進一步探討環(huán)境特征的相關(guān)性提供依據(jù)。海膽外殼同樣是以Ca為主體,本研究發(fā)現(xiàn)其Fe、Mn、Cu和K 等多種元素在外殼不同圈層分布的特征,同樣將為環(huán)境變化情況提供參考指標。

4 結(jié)論

本研究利用微區(qū)XRF技術(shù)對魚、蝦、硨磲、海膽外殼等海洋生物樣品進行了微區(qū)面掃描,將掃描獲得元素數(shù)據(jù)進一步進行分析和可視化處理,并對樣品表面的不同元素相關(guān)性進行了分析,得到結(jié)論如下:

①該技術(shù)適用于上述海洋生物樣品的檢測,可獲得樣品表面元素的微區(qū)分布特征；

②在此技術(shù)基礎(chǔ)上,輔助以線性掃描等補充測試方案,可進一步佐證其面掃結(jié)果可信度,并獲得不同元素在樣品中特定線性區(qū)域上的差異性對比；

③通過多次單點掃描得到多組重復(fù)元素含量數(shù)據(jù),證實測試結(jié)果平行性良好,表明樣品體表元素分布數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

研究結(jié)果表明,微區(qū)XRF技術(shù)在測試不同類型海洋生物樣無機元素分布特征方面具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。一方面,該技術(shù)適用于大面積的樣品檢測,可全方位整體展示樣品表面元素微區(qū)特征。另一方面,該技術(shù)前處理方案簡單,可操作性高,對于相對脆弱的生物樣品可盡量保持其原位特點。此外,在數(shù)據(jù)處理方面,本研究通過線掃描、元素比例分析等多種方式,展現(xiàn)了該技術(shù)在實際研究中分析樣品特定區(qū)域元素微區(qū)特征或多種元素之間相關(guān)性特點的可行性。