新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎與腸道微生物群落關(guān)系的研究進(jìn)展

王英豪，戴立英

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是NICU常見的消化道急癥，死亡率高達(dá)30%。存活的NEC 病兒往往會出現(xiàn)后遺癥，包括慢性喂養(yǎng)不耐受、短腸綜合征和生長發(fā)育遲緩等，其病理特點是腸道黏膜損傷甚至全層壞死或穿孔，1978年，Martin等首次提出了NEC的3個階段和分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期為“可疑”期，X線片以胃潴留和輕度腹脹為特征。Ⅱ期為“腸梗阻”期，主要表現(xiàn)腸梗阻、水腫、腸壁積氣征等。Ⅲ期為疾病的晚期，進(jìn)展迅速惡化，易發(fā)生腸壞死，膿毒性休克，消化道出血，穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，此階段常需要手術(shù)干預(yù)。近年來NEC 受到了廣泛的關(guān)注，但其具體發(fā)病機制仍未完全明確。剖宮產(chǎn)嬰兒、胎齡較小的嬰兒、出生后使用抗生素和人工喂養(yǎng)的新生兒NEC 發(fā)生率較高。有研究發(fā)現(xiàn)NEC 前期腸道微生物群落已經(jīng)出現(xiàn)異常，提示微生物學(xué)可能是防治NEC 的一個很有前途的治療靶點。本研究就NEC 與腸道微生物群落關(guān)系的研究文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，為NEC 的預(yù)防及治療提供參考依據(jù)。

1 新生兒腸道微生物群落變化的影響因素

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，各種關(guān)于微生物組學(xué)的檢測手段陸續(xù)出現(xiàn)大大擴展了我們對微生物群落的認(rèn)識。腸道微生物群落擁有數(shù)千種細(xì)菌，它們在維持體內(nèi)微生態(tài)平衡方面起著至關(guān)重要的作用。腸道菌群定植是一個程序化的過程，出生后嬰兒的腸道最初被兼性厭氧菌定植，以桿菌為主，隨著時間的推移出現(xiàn)專性厭氧菌，如擬桿菌、雙歧桿菌和厚壁菌門。影響微生物早期定植的因素是多方面的，包括胎齡、分娩方式、喂養(yǎng)方式、環(huán)境因素、使用抗生素、抑酸藥物等因素，潛在甚至可能是宮內(nèi)傳播。出生后新生兒腸道微生物定植經(jīng)歷兩波發(fā)育，第一波菌群發(fā)育對于足月兒和早產(chǎn)兒來說沒有區(qū)別，主要取決于分娩方式，陰道出生的嬰兒最容易被母親的陰道微生物感染，幾項研究報道經(jīng)陰道分娩的嬰兒擬桿菌豐富度較高，以乳酸桿菌、普氏菌和雙歧桿菌為主；而剖宮產(chǎn)兒微生物群落差異較大，以葡萄球菌為主，而雙歧桿菌和擬桿菌定植延遲，腸桿菌科定植率增加。第二波菌群發(fā)育因素在足月和早產(chǎn)兒之間有所不同，在足月兒中主要受喂養(yǎng)方式如母乳或配方奶喂養(yǎng)的影響，母乳喂養(yǎng)促進(jìn)了更接近母親的微生物群發(fā)展，其貢獻(xiàn)來自母乳的含量和與乳暈皮膚的接觸，母乳中含有人乳低聚糖（HMO），可刺激雙歧桿菌和擬桿菌生長，幫助選擇有益的微生物，為其提供生長的基質(zhì)，降低機會性致病菌對新生兒腸道的侵襲，故母乳喂養(yǎng)嬰兒的微生物群富含雙歧桿菌和擬桿菌；相比之下，配方奶喂養(yǎng)的嬰兒仍然以鏈球菌、葡萄球菌和乳酸桿菌為主。而早產(chǎn)兒受喂養(yǎng)方式影響較小，微生物群主要以梭菌和腸桿菌為主要特征，雙歧桿菌和擬桿菌數(shù)量較少。因此母乳喂養(yǎng)嬰兒體內(nèi)存在一種以雙歧桿菌為主的微生物群落，而配方奶喂養(yǎng)的嬰兒體內(nèi)微生物雖多樣化，但潛在有益菌水平較低。由于新生兒免疫系統(tǒng)不成熟，感染風(fēng)險較大，臨床醫(yī)生經(jīng)常會給予可疑或確診感染的嬰兒抗生素，抗生素的暴露對新生兒微生物群有很大的影響，延緩了有益細(xì)菌的定植，減少腸道微生物群的多樣性，抗生素治療可能導(dǎo)致新生兒（胎齡≤32 周和足月兒）第一個月腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性降低，腸桿菌豐富度增加15% 左右，雙歧桿菌數(shù)量明顯減少。Patricio-S 等表明，在第一周接受5～7 d 經(jīng)驗性抗生素的嬰兒，在出生后第2 周和第3 周，變形桿菌相對豐度增加至54% 左右（正常＜1%），細(xì)菌多樣性降低。Zhou 等發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期抗生素暴露也可導(dǎo)致母親陰道和新生兒腸道微生物菌群失調(diào)，且乳酸桿菌豐度顯著下降40% 左右。抑酸療法對早產(chǎn)微生物群也有明顯的影響，通過抑制胃酸分泌加劇胃腸道殖民化，導(dǎo)致胃腸菌群失調(diào)。Gupta 等證明在早產(chǎn)兒中應(yīng)用H2受體阻滯劑限制了糞便微生物群的多樣性，以變形桿菌為主。這些因素綜合起來，對新生兒腸道菌群的定植、微生物多樣性的發(fā)展、菌群穩(wěn)定性的增加、醫(yī)院獲得的潛在致病菌和雙歧桿菌的定植等產(chǎn)生深遠(yuǎn)而有害的影響。

2 NEC與腸道微生物群落變化關(guān)系

盡管對NEC 病理生理學(xué)研究進(jìn)行了幾十年研究，目前仍未發(fā)現(xiàn)單一的致病因素，與腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)側(cè)重于腸道微生物失調(diào)，而不是一種特定的病原體。正常菌群在上皮細(xì)胞表面的生長繁殖形成了生物屏障，優(yōu)先占領(lǐng)生存空間，妨礙或抑制外來致病菌的定植。當(dāng)腸道菌群正常的定植過程遭到破壞或延遲，將導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使正常菌群與宿主間的生態(tài)平衡失調(diào)，一些正常菌群成為機會致病菌，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至引起NEC。

對早產(chǎn)兒糞便微生物組進(jìn)行測序的首批研究之一表明，微生物多樣性降低，同時屬于變形桿菌門的一個屬的優(yōu)勢伴雙歧桿菌豐富度減少是導(dǎo)致NEC 發(fā)病的關(guān)鍵。近年來，多項研究表明，早于NEC 發(fā)病前數(shù)天至數(shù)周，NEC 病兒已經(jīng)發(fā)生腸道菌群失調(diào)且革蘭陰性桿菌豐富度增多，即生態(tài)失調(diào)早于NEC 發(fā)病。幾項對變形桿菌門的病例對照研究表明，在出生后3周以上出現(xiàn)NEC的早產(chǎn)兒，往往會在發(fā)病前數(shù)天至數(shù)周出現(xiàn)這種生態(tài)失調(diào)。Pammi等Meta分析指出變形桿菌的豐度的增加在胎齡＜27 周嬰兒中最為明顯，他們還發(fā)現(xiàn)這些NEC 病兒Alpha 多樣性和Shannon 指數(shù)降低（Alpha 指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)；Shannon 指數(shù)即種群之間物種多樣性，其值越大表明菌群多樣性越高），同時通過針對16S rRNA 細(xì)菌基因的高變區(qū)V3-V5的研究發(fā)現(xiàn)，與針對V1-V3 區(qū)域研究相比，變形桿菌的相對豐富度更高，厚壁菌門的豐富度更低。Ho 等對45 例出生體質(zhì)量＜1500 g 早產(chǎn)兒的4 周內(nèi)糞便進(jìn)行連續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，糞便γ-變形桿菌的總體比例隨著出生年齡的增加而增加，且變形桿菌定植和NEC 發(fā)病率似乎在月經(jīng)后同一時期[（31±3）周］達(dá)到高峰，在出生后≤2 周時變形桿菌相對豐度42.5% 左右，第三周變形桿菌相對豐度69.7%，第四周高達(dá)75.5%。為了進(jìn)一步了解NEC 發(fā)生時的腸道菌群變化，Joann 等采用16s rRNA 基因測序及定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，分析了12例NEC 手術(shù)腸段和14例非NEC 手術(shù)腸段樣本，發(fā)現(xiàn)NEC 組中變形桿菌門占主要地位，且葡萄球菌和梭狀芽孢桿菌過表達(dá)。Warner 等對122例嬰兒的2492個糞便樣本研究發(fā)現(xiàn)，與健康嬰兒相比，樣本中28例NEC病兒γ-變形桿菌比例更高，1個月后最高峰可達(dá)80% 左右，梭狀芽孢桿菌和Negativicutes 綱比例更低，僅為10% 左右。為排除外界環(huán)境和遺傳因素影響，Suchitra 等對25周雙胞胎（雙胞胎A 無NEC，雙胞胎B 最終發(fā)展為NEC）糞便樣本進(jìn)行16s rRNA 基因測序研究發(fā)現(xiàn)，在診斷為NEC 2 周前雙胞胎的微生物菌群差異明顯，雙胞胎B 在診斷為NEC 前1 周腸道菌群多樣性大幅下降，且變形桿菌豐富度增加，約70%，而雙胞胎A腸道菌群主要以梭菌和桿菌為主。除了以糞便為基礎(chǔ)的研究外，最近一項對疾病部位的甲醛固定石蠟包埋組織的分析也發(fā)現(xiàn)，與自然隔離穿孔對照組相比，NEC 病兒中γ-變形桿菌的相對豐度較高，平均升高50%，厚壁菌門和擬桿菌的相對豐度較低，平均降低了15%，微生物多樣性更低。

由于早產(chǎn)兒不成熟的免疫系統(tǒng)和經(jīng)常留置生命支持裝置，故早產(chǎn)兒的腸道菌群與足月兒相比主要以腸桿菌科、弧菌科和假單胞菌科的革蘭陰性桿菌居多，故更易感染NEC。此外，早產(chǎn)兒腸道菌群還含有更多的潛在致病菌，如大腸桿菌、葡萄球菌和克雷白桿菌。研究表明，長期接觸抗生素，特別是氨基糖苷類抗生素，可以使早產(chǎn)兒腸道微生物群落的Alpha 多樣性降低，并增加γ-變形桿菌的豐富度。董琳研究發(fā)現(xiàn)早期經(jīng)驗性使用抗生素的早產(chǎn)兒，腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量明顯減少，NEC 發(fā)生率增高。另一方面，腸道內(nèi)微生物多樣性高、雙歧桿菌豐度高的早產(chǎn)兒可能不容易發(fā)生NEC。

如果微生物失調(diào)是導(dǎo)致NEC 發(fā)展的原因之一，那么改變早產(chǎn)兒的胃腸微生物群落，將早產(chǎn)兒胃腸微生物群落轉(zhuǎn)移到更具有保護性的微生物群落，可能會阻止NEC 的發(fā)展?？傊⒁粋€含有多種共生菌的健康胃腸微生物群落對宿主是極其重要的。

3 腸道微生物群落平衡對腸道的保護機制

NEC 的發(fā)生幾乎總是在產(chǎn)后1 周后，從不發(fā)生在妊娠期，并且NEC 手術(shù)病人發(fā)現(xiàn)腸壁內(nèi)存在細(xì)菌侵襲，以及無菌動物難以誘導(dǎo)NEC 病變，都凸顯了細(xì)菌在NEC 發(fā)病中的作用。腸道的健康取決于免疫細(xì)胞、宿主細(xì)胞和腸道菌群之間的良好平衡，腸道菌群不僅參與機體的代謝和能量儲存，并在建立免疫系統(tǒng)、抵抗病原菌過程中發(fā)揮重要作用，種類繁多的腸道微生物群組成機體腸黏膜系統(tǒng)，可以阻止致病菌對上皮細(xì)胞的黏附和定植，有助于預(yù)防腸道被感致病菌侵襲感染。人類腸道擁有模式識別受體（patternrecognitionreceptor，PRRs），其能夠特異性識別微生物相關(guān)分子模式（microbe-associatedmolecularpatterns，MAMPs），并通過支持細(xì)胞生長和增殖、細(xì)胞保護、調(diào)節(jié)屏障功能和抗菌肽的分泌來維持小腸穩(wěn)態(tài)，有助于減少病原菌對腸黏膜的黏附、預(yù)防腸道感染、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。關(guān)于PRRs 如何識別細(xì)菌產(chǎn)物，其中研究最多的是Toll 樣受體（TLRs），TLRs 可識別MAMPs，此外，機體對G-菌脂多糖可產(chǎn)生固有免疫反應(yīng)，其中包括脂多糖配體Toll 樣受體4 的激活（TLR-4），Toll 樣受體4（TLR-4）在NEC 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TLR 4 的表達(dá)水平通常在妊娠期間逐漸下降，因此早產(chǎn)兒TLR 4水平較高，早產(chǎn)兒腸道菌群定植不成熟，腸道菌群往往以變形桿菌門為優(yōu)勢菌，變形桿菌脂多糖成分誘導(dǎo)TLR-4激活后，可通過誘導(dǎo)MAMPs激活特定的TLRs，開啟特異性免疫反應(yīng)，通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ 啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，反過來引起腸上皮細(xì)胞凋亡和炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-1）的釋放，更容易引起細(xì)胞因子介導(dǎo)的腸系膜血管炎癥，破壞腸道免疫功能，造成腸組織局部缺血壞死，其中促炎細(xì)胞因子IL-8，可增加中性粒細(xì)胞的趨化性，進(jìn)一步加重炎癥、組織損傷和NEC。Hui 等發(fā)現(xiàn)在孕周在28～29周的NEC病兒腸切除標(biāo)本中促炎細(xì)胞因子增加及TLR 4表達(dá)增強。腸道共生菌可通過阻止TLRs 對腸道的識別或通過阻斷NF-κβ 抑制劑的降解而下調(diào)NF-κβ 通路，誘導(dǎo)抑菌肽分泌，限制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)。除了TLR 4 通路，其他的途徑和細(xì)胞類型被認(rèn)為在NEC的發(fā)展中很重要，包括血小板活化因子和Smad7 抑制蛋白途徑。其中血小板活化因子是一種潛在存在于各種組織中磷脂炎癥介質(zhì)，其激活可導(dǎo)致胃腸上皮細(xì)胞損傷、凋亡、黏膜通透性增加、緊密連接受損以及血管收縮，破壞胃腸道屏障功能；脂多糖通過誘導(dǎo)Smad7 抑制蛋白中斷轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）信號表達(dá)和增強巨噬細(xì)胞NF-κβ 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且在NEC標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)Smad7表達(dá)增強。

試驗報告表明，益生菌干預(yù)可增強腸道屏障，減輕腸道損傷，抑制腸道菌群失調(diào)，顯著降低NEC的發(fā)病率。唐佳等通過羅伊氏乳桿菌（L.reuturi）DSM17938 菌株對NEC 小鼠模型研究得出，實驗組通過羅伊氏乳桿菌干預(yù)可降低NEC 中炎性因子TNF-α，IL1-β表達(dá)，提高腸道GSH含量、SOD抑制率和活力，從而減少腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強抗氧化能力，減少腸道炎癥反應(yīng)，降低NEC 發(fā)病率。除此之外，腸道內(nèi)細(xì)菌可通過其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)宿主腸道免疫力。乙酸、丙酸、丁酸等細(xì)菌經(jīng)結(jié)腸內(nèi)厭氧菌酵解產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），一方面可以為宿主提供能量，通過激活G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）途徑，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥部位趨附，誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10），從而發(fā)揮抑制炎癥的作用。還可以抑制組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）途徑，減少脂多糖配體TLR-4 的激活，從而抑制中性粒細(xì)胞激活，減少TNF-α 釋放，起到抗炎作用，降低NEC風(fēng)險。

因此腸道共生菌的減少、菌群多樣性的下降可以導(dǎo)致新生兒胃腸屏障功能下降，將降低腸道上皮細(xì)胞對潛在致病菌的防御能力，增加NEC 發(fā)生風(fēng)險；反之某些益生菌和細(xì)菌產(chǎn)物的干預(yù)可以減少腸道炎癥反應(yīng)，降低NEC的發(fā)病率。

4 小結(jié)和展望

盡管腸道微生物的作用還沒有被清楚地了解，但是紊亂的腸道微生物群，似乎會使新生兒有更高的發(fā)生NEC 的風(fēng)險，腸道微生物群變化在預(yù)防或促進(jìn)NEC 的過程中具有保護性或致病性作用。新生兒健康的腸道環(huán)境可以幫助他們減少腸道炎癥和損傷，盡量避免NEC 發(fā)生。腸道微生物組的監(jiān)測及干預(yù)是診斷及預(yù)防NEC的一種很有希望的策略。